Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus
20 juni 2018
Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd. Volg deze organisatie na verloop van tijd in traag groeiende Myxococcus xanthus cellen en werd een set-up voor fluorescentie live-cel beeldbewerking met hoge Spatio resolutie gedurende enkele generaties ontwikkeld. Met deze methode kon Spatio dynamiek van belangrijke eiwitten voor chromosoom segregatie en celdeling worden vastgesteld.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bacteriële celbiologie, zoals hoe cellen hun DNA repliceren, hoe ze groeien en hoe ze zich delen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat levende bacteriecellen minimaal 24 uur onder de microscoop kunnen worden gemonitord en dat de techniek geen speciaal apparatuur vereist. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de groei en deling van Myxococcus xanthus, kan deze ook gemakkelijk worden toegepast op andere langzaam groeiende bacteriën.
Om te beginnen, suspendeer een enkele M.xanthus kolonie in 500 microliter 1%CTT, aangevuld met antibiotica, in een steriele buis en breng de gehele suspensie over naar een 50-milliliter Erlenmeyer kolf met vijf milliliter 1%CTT. Bereid een 1%agarose microscopie oplossing met 0,2%CTT door een gram agarose te mengen met 80 milliliter TPM buffer en 20 milliliter 1%CTT medium. Verwarm de oplossing in de magnetron totdat de agarose gesmolten is.
Vul een petrischaal met ongeveer 60 milliliter gesmolten agarose en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Verwarm de agarose pad op 32 graden Celsius gedurende minimaal 15 minuten voor gebruik. Plaats vervolgens een steriele glazen deksel op een plastic of metalen frame met een gat in het midden en bevestig de deksel met tape aan het frame.
Voeg 10 tot 20 microliter exponentieel gekweekte M.xanthus cellen toe aan de deksel. Om fluorescente microsferen als fiducial markeringen van de cellen toe te voegen, verdun de microsferen met TPM buffer tot 1:100. Schud de bead suspensie grondig en voeg vijf tot tien microliter toe aan de cellen.
Snij uit de grote, voorverwarmde 1%agarose pad een kleine pad ongeveer ter grootte van de deksel en plaats deze bovenop de cellen. Plaats vervolgens een deksel bovenop de pad om verdamping te voorkomen en om de cellen in een vochtige omgeving te houden. Incubeer het microscopiemonster gedurende 15 tot 20 minuten op 32 graden Celsius om de cellen te laten hechten aan de bodem van de agarose pad vóór de time-lapse microscopie opnames.
Om time-lapse microscopie uit te voeren, zet de microscoop aan en start de microscoopcontrolesoftware. Selecteer het juiste objectief en de juiste spiegels en filters om fasecontrastbeelden te verkrijgen, evenals beelden van groen-fluorescente, rood-fluorescente of geel-fluorescente eiwitten. Voeg een druppel hoogwaardige immersieolie toe op het objectief en op de bodem van het monster dat vooraf op 32 graden Celsius is geïncubeerd.
Met de zijde met het gat naar het objectief toe, plaats de metalen frame met het monster op de microscoopstandaard en bevestig het monster stevig in de standaardhouder. Focus op de cellen door de standaard in de Z-richting dichter bij het objectief te bewegen. Wanneer het olie op het objectief en het monster contact maken, beweeg de standaard in de X/Y-richting.
Schakel over naar de Metamorph software en open de Acquire tool. Selecteer Phase Contrast in de Setting vervolgkeuzelijst en stel de Exposure Time in op 100 milliseconden. Klik op Show Live, Bring Cell into Focal Plane en beweeg de standaard in de X/Y-richting totdat meerdere enkele cellen zichtbaar zijn in het veld van zicht.
Zorg ervoor dat er ten minste één fluorescente microsfeer in het gebied van zicht is om later de verworven beelden uit te lijnen. Open vervolgens de Multi-Dimensional Acquisition wizard van de microscoopcontrolesoftware om een time-lapse experiment op te zetten dat het microscoop toestaat om beelden te verwerven op meerdere golflengten en standaardposities indien nodig. In het Main tabblad, activeer time-lapse en Multiple Wavelengths.
Er verschijnen extra tabbladen aan de linkerkant van het venster. Klik op het Saving tabblad en Selecteer Directory om een lege map op de computerharde schijf te selecteren om de verworven beelden op te slaan, en activeer Increment Base Name If File Exists om ervoor te zorgen dat de opeenvolgende datasets de eerdere niet overschrijven. Geef het experiment een naam met datum en de stamnaam of titel van het experiment.
Klik op het time-lapse tabblad om de time-lapse parameters aan te passen, stel de Time Interval in op 20 minuten en stel Duration in op 24 uur. Het aantal tijdstippen zal automatisch veranderen. Klik nu op het Wavelengths tabblad.
Selecteer het aantal golflengten dat voor elk beeld op elk tijdstip moet worden verkregen door het aantal te wijzigen. Selecteer Allow Separate Hardware Memorized AF Position for Each Wavelength. Klik op het First Wavelength tabblad vanaf de bovenkant.
Selecteer Phase Contrast in de vervolgkeuzelijst Verlichting. Selecteer 100 milliseconden voor belichting en selecteer in de vervolgkeuzelijst Acquire, Elke Tijdstip. Deactiveer Auto Expose in de vervolgkeuzelijst door Never te selecteren en selecteer Elke Acquisitie in de vervolgkeuzelijst voor Auto Focus.
Stel de belichting voor elke golflengte in zoals zojuist is gedemonstreerd met behulp van de volgende parameters. Klik vervolgens op de Main tab en activeer Multiple Stage Positions om beelden van meerdere standaardposities te verkrijgen. Klik op het Stage tabblad en klik op de Live knop om naar het veld van zicht te kijken.
Beweeg de standaard in de X/Y-richting totdat een ROI zichtbaar is in het veld van zicht. Sla de X en Y-coördinaten op in het Stage tabblad door op het plusteken te klikken. Beweeg de standaard opnieuw in de X/Y-richting totdat een nieuwe ROI is gevonden en sla de coördinaten opnieuw op door op het plusteken te klikken.
Ga door totdat het gewenste aantal regio's is opgeslagen. Controleer nogmaals of de cellen scherp staan door op de verschillende opgeslagen X en Y-posities te klikken en start de hardware autofocus door op AFC hold te klikken om de opgeslagen Z-positie constant te houden tijdens het verloop van het experiment. Start de time-lapse opname in de Multi-Dimensional Acquisition wizard van de microscoopcontrolesoftware door op Acquire te klikken.
Controleer of de cellen nog scherp staan na de eerste paar tijdstippen in de time-lapse opnames om de kwaliteit van de beelden te maximaliseren en focus opnieuw indien nodig. Om time-lapse films te genereren en beelduitlijning
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor fluorescentie-live-cell imaging van traag groeiende Myxococcus xanthus-cellen, waardoor een hoge spatiotemporele resolutie over meerdere generaties mogelijk is. De techniek maakt het mogelijk om sleutelproteïnen te observeren die betrokken zijn bij chromosoomsegregatie en celdeling.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Bacteriële celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Celdelingsmechanismen
Achtergrond
- Bacteriële cellen vertonen een ruimtelijke organisatie.
- Het begrijpen van DNA-replicatie en celdeling is cruciaal in de microbiologie.
- Live-cell imaging-technieken verbeteren de studie van cellulaire processen.
- Myxococcus xanthus dient als modelorganisme voor deze studies.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om langzaam groeiende bacteriële cellen te observeren.
- Het monitoren van de dynamiek van eiwitten die betrokken zijn bij de celdeling.
- Het verschaffen van inzichten die toepasbaar zijn op andere bacteriële soorten.
Gebruikte methoden
- Resuspendering van Myxococcus xanthus in een specifiek medium.
- Bereiding van agarosepads voor microscopie.
- Time-lapse microscopie om cellulaire processen vast te leggen.
- Gebruik van fluorescerende markers voor verbeterde visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van levende bacteriële cellen gedurende meer dan 24 uur.
- Observatie van de spatiotemporele dynamiek van sleuteleiwitten.
- De methode toonde toepasbaarheid aan voor andere langzaam groeiende bacteriën.
- Hoge-resolutie beeldvorming leverde inzichten op in de celdeling.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van de bacteriële celbiologie.
- Het maakt real-time observatie van kritieke cellulaire processen mogelijk.
- Deze techniek kan worden aangepast voor diverse bacteriële soorten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het monitoren van de celcyclus van langzaam groeiende bacteriën vormt een uitdaging bij de validatie van antimicrobiële targets vanwege fotobleken en fototoxiciteit tijdens langdurige imaging. Deze methode maakt real-time observatie van chromosoomsegregatie en divisiedynamiek in Myxococcus xanthus mogelijk, wat een schaalbaar model biedt voor het verminderen van risico's bij antibacteriële targets. De aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door proteïnedynamiek te koppelen aan cellulaire fenotypen over meerdere generaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de spatiotemporele dynamiek van deling- en segregatie-eiwitten in langzaam groeiende bacteriën te visualiseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van de effecten van target-interactie op de progressie van de celcyclus.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfoli triage door eiwitlokalisatiepatronen te correleren met fenotypische uitkomsten over meerdere generaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Assaygereedheid: Bereidt gevalideerde bacteriële systemen voor op downstream screening door baseline-delingstijdlijnen en proteïne-oscillatiepatronen vast te stellen.
- Kwantitatieve outputs: Genereert meetbare interdivisietijden en proteïnetranslocatiekinetiek voor hit-validatie in antibacteriële screens.
- Hergebruik van het platform: Maakt schaalbare, reproduceerbare imaging-workflows mogelijk die aanpasbaar zijn voor andere langzaam groeiende pathogenen voor cross-species target-validatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Biedt een mechanistische brug van ontdekking naar preklinisch onderzoek door antibioticum-geïnduceerde celcyclusarrest modellering in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door fluorescerende reporters van het delingsmechanisme te volgen als functionele readouts van doelwitmodulatie.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de waargenomen verstoring van chromosoomsegregatie of delingsdynamiek in levende cellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypotheses tot lead-optimalisatie en biedt live-cell validatie van antibacteriële mechanismen vóór de preklinische fase.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests door in realtime te visualiseren hoe kandidaatverbindingen de FtsZ-accumulatie in het midden van de cel of de ParB-translocatie van pool naar pool beïnvloeden.
- Screening: Levert assay-klare systemen met kwantificeerbare tijdlijnen van de deling en proteïnedynamiek voor high-content screening van antimicrobiële bibliotheken.
- Analytics: Maakt het mogelijk om de tijd tussen delingen, de timing van proteïneclusterduplicatie en metrieken voor subcellulaire lokalisatie te extraheren om de effecten van verbindingen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege mechanistische observaties met preklinische continuïteit door dosisafhankelijke vertragingen in chromosoomsegregatie of cytokinese te modelleren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform voor langzaam groeiende bacteriën, waardoor redundante optimalisatie in antimicrobiële projecten wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in de regulatie van de bacteriële celcyclus te verminderen.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie en reproduceerbaarheid via een gedefinieerde bereiding van agarosepads, fiduciale markering en omgevingscontroles.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van antibacteriële targets mogelijk te maken, waardoor falen in een laat stadium door onverwachte cytostatische effecten wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door live-cell imaging-uitkomsten te koppelen aan go/no-go-criteria in antibacteriële programma's.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en het hanteren van bacteriële stammen voor een correcte marker-expressie en controle op contaminatie.
- Is afhankelijk van toegang tot microscopen die time-lapse opnames kunnen maken, voorzien van milieukamers en geschikte filtersets voor de detectie van YFP, GFP en mCherry.
- Maakt standaardisatie van de dikte van de agarosepads, de luchtvochtigheid en de temperatuur tussen laboratoria noodzakelijk om consistente metingen van de verdubbelingstijd te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij variërende groeisnelheden, waarbij optimalisatie van de beeldvormingsfrequentie en de samenstelling van het medium per bacterie vereist is.
- Bevat praktische beperkingen zoals het risico op fototoxiciteit tijdens langdurige acquisities, wat wordt beperkt door het aanpassen van de belichtingstijden en lichtintensiteit zoals vermeld in het protocol.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Growth and Preparation of M. xanthus Microscopy Samples
2:41
Microscope Set-up and Time-lapse Acquisition
7:37
Generation of Time-lapse Movies and Image Alignment
9:16
Results: Fluorescence Time-lapse Imaging of Myxococcus xanthus
11:01
Conclusion
