Name: Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer een gestandaardiseerde dissectiemethode voor de topografische oriëntatie van het muizennetvlies met behulp van anatomische oriëntatiepunten zoals de rectus spieren, choroid fissuur en S-opsin gradiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Bretagne dag en Jessica Onyak voor hun technische bijstand en Dr. Liu voor kandidatuur laten gebruiken zijn epifluorescerende Microscoop. Met dank aan steun: NIH R15EY026255-01 en de Karl Kirchgessner Stichting.

<ol><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
<li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li>
<li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites%3A+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li>
<li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice%3A+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131(2014).</li>
<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
<li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+selectivity+in+the+retina%3A+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er is geen omvattende, gestandaardiseerde protocol voor het bepalen en het labelen van de oriëntatie van het netvlies van de geïsoleerde muis in anatomische ruimte. Het protocol gedetailleerde hier pogingen om deze leemte opvullen door te standaardiseren en detaillering van het gebruik van diep anatomische bezienswaardigheden zoals referentiepunten aan betrouwbaar identificeren retinale oriëntatie. Het is aangetoond dat de diep anatomische bezienswaardigheden in dit protocol een meer accurate en betrouwbare methode bieden kunt u het netvlies van de muis dan oppervlakkige bezienswaardigheden zoals hoornvlies brandwonden22. Dus, kunnen op studies die hebben vertrouwd op hoornvlies brandwonden voor retinale oriëntatie meer fouten in oriëntatie dan studies die hebben vertrouwd op bezienswaardigheden zoals de spieren van de musculus rectus en choroideus horizontalis hebben gehad. Deze discrepantie benadrukt de behoefte aan en de betekenis van dit gestandaardiseerde protocol met betrekking tot de interpretatie van resultaten en het maken van vergelijkingen tussen studies die afhangen van nauwkeurige retinale oriëntatie. Over het geheel genomen zorgt een gestandaardiseerde protocol voor een gemeenschappelijke methode voor visie onderzoekers te volgen, waardoor de aanwezigheid van een storende variabele in data-acquisitie die zich kan voordoen met het gebruik van niet-gestandaardiseerde methoden voor de identificatie van de retinale oriëntatie.
De hier gepresenteerde methoden zijn gemakkelijk herhaalbaar en toepasbaar is in vele soorten experimentele protocollen. In feite, is een van de grootste voordelen van dit protocol zijn aanpassingsvermogen. Omdat de choroideus horizontalis, s-opsin expressie en rectus spier bezienswaardigheden allemaal retinale oriëntatie22 de mijlpaal die het best past bij de experimentele parameters kan worden gekozen gebleken zijn voor het optimaliseren van de data-acquisitie (tabel betrouwbaar te identificeren 1). Daarnaast methoden van dissectie kunnen worden gecombineerd teneinde te verduidelijken op de oriëntatie van het netvlies. Bijvoorbeeld choroideus horizontalis bezuinigingen kunnen worden gecombineerd met s-opsin immunohistochemistry om te oriënteren alle vier stokken van het netvlies: nasale en temporele hemisferen kunnen worden geïdentificeerd door de choroideus horizontalis bezuinigingen, en s-opsin immunohistochemistry kan identificeren ventrale en dorsale hemisferen. Nog, het aanpassingsvermogen van dit protocol kan worden beperkt door de tijd-gevoelige aard van fysiologie experimenten. Omdat de tijd die nodig is om te identificeren een mijlpaal, een hoornvlies brandwond maken en uitvoeren van een verlichten knippen in aanzienlijke weefsel dood in ex vivo experimenten resulteren kan, is het mogelijk dat sommige van deze methoden dissectie minder dan optimaal. Gelukkig, zodra een dissector vertrouwd te met de choroideus horizontalis of superieure rectus spier dissectie methode, raken heeft identificatie van de diepe bezienswaardigheden en het maken van het verlichten van de bezuinigingen snel een deel van de dissectie routine geworden en geen aanzienlijk toevoegt aan de lengte van de dissectie. Hoewel we erkennen dat de hier gedetailleerde stappen op tijd aan zeer tijd-gevoelige experimenten toevoegen kunnen, raden we u aan het verloop van de s-opsin voor post hoc retinale oriëntatie wanneer de levensvatbaarheid van het weefsel niet langer een probleem (Figuur 3 is ). Kleuring van het netvlies, voor s-opsin een effectieve manier om zich te oriënteren op het netvlies, is zoals het alle vier Polen identificeren kan: s-opsin kleuring verdeelt het netvlies in dorsale en ventrale Polen en maakt het mogelijk voor de identificatie van de nasale en temporele palen naargelang het netvlies is van een oog van rechts of links (Figuur 3). Daarom vinden wij dat dit protocol biedt een betrouwbare en herhaalbare set methoden voor nauwkeurige retinale oriëntatie die kan voldoen aan eventuele experimentele parameters.
Als met een gewijzigde retinale dissectie, wordt de geldigheid van de dissectie-methode beperkt door de nauwkeurigheid van de dissector en de kwaliteit van het weefsel dat geïsoleerd is. Als een weefsel verloren tijdens dissectie is of een netvlies is te vervormd voor nauwkeurige wederopbouw, zal Retistruct en de MATLAB-programma niet zitten kundig betrouwbaar reconstrueren of oriënteren op het netvlies. Daarom is het belangrijk naar de praktijk van de dissectie-methode voor te gebruiken voor het verzamelen van gegevens experimenten. Terwijl de soorten dissecties uitgelegd hier zijn niet moeilijk, moeten ze worden beoefend om ervoor te zorgen de herhaalbaarheid van de identificatie van de retinale oriëntatie met een bijzondere mijlpaal. Bovendien is het essentieel dat de praktijk van de dissector visueel identificeren de anatomische bezienswaardigheden voorafgaand aan begin van gegevensverzameling om zorg ervoor dat de juiste landmark wordt gebruikt. Unidirectioneel om te controleren van de juistheid van een bepaalde dissector is om beide choroideus horizontalis snijdt of Musculus rectus superior snijdt en vergelijk de locatie van de bezuinigingen op het verloop van de s-opsin, omdat het een vaste markering en dus niet afhankelijk van de nauwkeurigheid van dissectio is n. potentiële dissectors kunnen ook vergelijken hun gereconstrueerde netvlies naar de voorbeelden van gereconstrueerde netvlies met nauwkeurige landmark bezuinigingen zijn afgebeeld in Figuur 1 en Figuur 2. In wezen, een potentiële dissector moet worden uitgevoerd door de stappen in dit protocol voor een bepaalde dissectie-type, of het nu de musculus rectus superior of vaatvlies horizontalis methode, en vergelijken de resultaten op het verloop van de s-opsin om de geldigheid van een bijzondere dissector. Omdat als de dissector is niet zeker over de locatie van de bezienswaardigheid, kan dit resulteren in een onjuiste stand van het netvlies dat zal, standaard, invloed op gegevensverzameling en interpretatie.

Een belangrijk en soms onderbelicht aspect van retinale neurowetenschappen is de goede richting en de analyse van het geïsoleerde geheel-mount netvlies, of het nu de richting van een netvlies in een electrofysiologie opname kamer of op een histologische dia. Dit is vooral belangrijk voor studies waarbij het netvlies van de muis, die momenteel het meest gebruikte model voor onderzoek van de zoogdieren visuele systeem. Recente ontdekkingen laten zien dat het netvlies muis geen ruimtelijk uniforme is maar dichtheid en grootte gradiënten van functioneel-verschillende retinale celtypen, zoals melanopsin peesknoopcellen, voorbijgaande OFF-alpha peesknoopcellen en kegel opsins1,2 heeft ,3,4,5. Bijgevolg, de gebruikte methode voor het bepalen van de richting van het netvlies van invloed kan zijn op de experimentele resultaten met betrekking tot cel type of opsin distributies2,3,6, richting afstemming van richting-selectieve ganglion cellen7,8,9, en topografische patronen van Retina degeneratie10,11,12,13,14 . In feite niet rapporteren hoe retinale oriëntatie is gemeld kan leiden tot verschillen in de literatuur en de verwarring wanneer u probeert om gegevens tussen studies te vergelijken. Daarom is het essentieel dat onderzoekers de methode melden voor de identificatie van de oriëntatie van het netvlies, zodat de resultaten van dergelijke onderzoeken nauwkeurig kunnen worden geïnterpreteerd.
Netvlies oriëntatie wordt vaak aangeduid met scoren het dorsale, ventrale, nasale of tijdelijke hoornvlies vóór oogbeschadigingen en/of enucleation1,3,12,15,16,17 19 18, ,of door snijden of kleuring diep anatomisch oog monumenten zoals de extraocular spieren6,7, het vaatvlies horizontalis20,21, of de s-opsin kleurovergang2,3. De spieren van de musculus rectus kunnen worden gebruikt voor identificatie de dorsale, ventrale, nasale en temporele netvlies door een diep verlichten verlaging inhouden die snijdt hoofdbundel van de bijlage van het of de superieure rectus, inferieur rectus, mediale rectus of laterale rectus spier, respectievelijk. Voor de meeste experimenten is met behulp van één Musculus rectus echter voldoende kunt u het netvlies22. De choroideus horizontalis, oftewel een overblijfsel van de ontwikkeling van het oog, kan worden beschouwd als een vage horizontale lijn op de achterkant van het oog. Elk einde van deze lijn eindigt in de neus of de temporele pool van de wereld-23. Tot slot, s-opsin expressie wordt asymmetrisch verdeeld aan de ventrale netvlies in muizen, en s-opsin antilichamen te onthullen het ventrale netvlies in immunohistochemische experimenten1kunnen worden gebruikt.
Recent werk van Stabio, et al.. 22 aangetoond dat oppervlakkige oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden zoals hoornvlies brandwonden een minder betrouwbare methode zijn kunt u het netvlies in anatomische ruimte, meest waarschijnlijk te wijten aan menselijke fouten en variabiliteit in het maken van het hoornvlies branden bij het gebruik van de temporele en mediale canthi als referentiepunten. Daarentegen is diepe oriëntatiepunten, zoals de musculus rectus superior, choroideus horizontalis en het verloop van de s-opsin, gebleken te zijn meer betrouwbare en nauwkeurige bezienswaardigheden kunt u het netvlies22. De identificatie van deze anatomische bezienswaardigheden vereist echter unieke dissectie stappen die niet in detail in de literatuur beschreven zijn. Het doel van dit protocol is dus om een uitgebreide tutorial over het gebruik van de musculus rectus superior, choroideus horizontalis en s-opsin verloop nauwkeurig identificeren de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies van de muis. Daarnaast hebben we een vergelijking van de doeltreffendheid van de twee s-opsin antilichamen, evenals een protocol voor s-opsin immunohistochemistry opgenomen.
Een extra uitdaging aan studies te vertrouwen op precieze retinale oriëntatie is de grote verlichten bezuinigingen nodig om plat wholemount netvlies op een opname kamer, een schotel, of een dia. Dit kan leiden tot uitdagingen voor de analyse van wat natuurlijk een driedimensionale structuur is wanneer het image is gemaakt als een platte tweedimensionale structuur. Een programma genaamd Retistruct24 kan worden gebruikt op een vlakke wholemount netvlies terugkomen met de driedimensionale structuur, voordat de gegevens verzameld uit het wordt geanalyseerd. Dus, een deel van dit protocol is gewijd aan het markeren van de stappen die nodig zijn voor het gebruik van de software van de Retistruct te reconstrueren s-opsin immunostained muis netvlies. We hebben ook een sectie van protocol voor het gebruik van onze aangepaste MATLAB-script, dat werd ontwikkeld om nauwkeurig roteren en orient muis netvlies gekleurd met s-opsin opgenomen.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nailpolish</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC-Treated 24-well Plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Normal Serum</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Gebruik op 5,2% (52 &mu;L met 86 &mu;L van 20% Triton X-100 en 863 &mu;L van 0,1M PBS voor 1 mL blokkeeroplossing)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Niet commercieel verkrijgbaar vanaf 2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ of FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Gratis beschikbare software</td></tr><tr><td>Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Minimaal versie 2007b of later</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slide Trays</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Ultra Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Gebruik op 4% (25 &mu;L en 875 &mu;L van 0,1 M PBS voor 1 mL fixeermiddel)</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Gratis beschikbare software; versie 3.4.3 of later</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Microscope Camera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gratis beschikbare software&nbsp; compatibel met Windows 7 of Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Gebruik 1,7% (86 &mu;L van 20% Triton-X met 52 &mu;L van Donkey Normal Serum en 863 &mu;L van 0,1 M PBS voor 1 mL blokkeeroplossing)</td></tr><tr><td>Vannas Spring Dissection Scissors&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB Microscope Digital Camera</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Te gebruiken met de Olympus Dissection Microscope</td></tr></tbody></table>

waar je knippen zaken: een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Nauwkeurig en betrouwbaar identificatie van ruimtelijke oriëntatie van het netvlies geïsoleerde muis is belangrijk voor vele studies in visuele neurowetenschappen, met inbegrip van de analyse van de dichtheid en gradiënten van de grootte van de retinale celtypes, de afstemming van de richting van richting-selectieve ganglion cellen, en het onderzoek van topografische degeneratie patronen in sommige retinale ziekten. Echter, er zijn vele verschillende oogbeschadigingen en/of dissectie methoden die worden gemeld in de literatuur en die worden gebruikt voor het identificeren en label retinale oriëntatie in het netvlies van de muis. Terwijl de methode van oriëntatie gebruikt in dergelijke studies vaak vergeten wordt, geen rapportage hoe retinale oriëntatie wordt bepaald kan leiden tot verschillen in de literatuur en de verwarring wanneer u probeert om gegevens tussen studies te vergelijken. Oppervlakkige oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden zoals hoornvlies brandwonden worden vaak gebruikt, maar onlangs is gebleken dat minder betrouwbaar dan dieper bezienswaardigheden zoals de spieren van de musculus rectus, de choroideus horizontalis of de s-opsin verloop. Hier, bieden wij een uitvoerige gids voor het gebruik van diep oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden nauwkeurig ontleden en vastleggen van de ruimtelijke oriëntatie van een geïsoleerde muis netvlies. Wij hebben ook in vergelijking van de effectiviteit van twee s-opsin antilichamen en een protocol voor s-opsin immunohistochemistry opgenomen. Omdat de richting van het netvlies volgens het verloop van de s-opsin retinale wederopbouw met Retistruct software en rotatie met aangepaste code vereist zijn, hebben we de belangrijke stappen vereist voor het gebruik van beide programma's gepresenteerd. Globaal, is het doel van dit protocol is het leveren van een betrouwbare en herhaalbare set methoden voor nauwkeurige retinale oriëntatie die is aangepast aan de meest experimentele protocollen. Een overkoepelend doel van dit werk is op de standaardisering van de retinale oriëntatie methoden voor toekomstige studies.

Een enkele verlichten verlaging inhouden die snijdt hoofdbundel van de musculus rectus superior, nauwkeurig en betrouwbaar identificeert het dorsale netvlies (Figuur 1). De choroideus horizontalis identificeert nauwkeurig en betrouwbaar het nasale en temporele netvlies met diepe verlichten bezuinigingen langs de temporele en nasale choroideus horizontalis (Figuur 2). In dit voorbeeld een verlichten knippen ook geboekt in de dorsale retina teneinde de dorsale/ventrale as van het netvlies (Figuur 2D, verticale pijl). De stappen van deze processen staan ten behoeve van replicatie door toekomstige dissectors. Een combinatie van s-opsin immunohistochemistry (figuur 3A en 3D), wederopbouw met Retistruct software (3B, 3E) en nauwkeurige vruchtwisseling met een aangepaste code voor MATLAB (3 C, 3F) voorziet in de identificatie van de ventrale en dorsale helften van het netvlies, evenals de nasale en temporele Polen als het is bekend of het netvlies van een oog van rechts of links (Figuur 3). Wij ook ten opzichte van twee veelgebruikte s-opsin primaire antilichamen voor effectiviteit in het labelen van s-opsin kegels (Figuur 4A-D): zowel de geit anti-s-opsin primair antilichaam en het konijn anti-s-opsin primair antilichaam effectief label s-opsin kegels (Figuur 4E) in de dezelfde muis.
Verlichten bezuinigingen op s-opsin immunostained gereconstrueerd netvlies werden geïdentificeerd en hun locaties werden vergeleken met de afdrukstand bepaald door de s-opsin verloop. Met behulp van onze aangepaste MATLAB code (Zie Aanvullende materialen), netvlies nauwkeurig werden gedraaid zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring ventrally ligt, waardoor echte dorsale op 90 ° (voor superieure rectus), waar nasaal bij 0 ° (voor nasaal choroideus horizontalis) en ware temporele op 180 ° (voor tijdelijke choroideus horizontalis). De waarde van elk individu verlichten gesneden hoek werd bepaald met behulp van het hulpprogramma hoek in ImageJ nadat netvlies werden gedraaid volgens het verloop van de s-opsin. Een gemiddelde hoek werd berekend voor elk verlichten type knippen en de gemiddelde waarde van elk verlichten gesneden type werd vervolgens uitgezet op een polar perceel (Figuur 6). Gemiddeld, superieure rectus spier bezuinigingen de dorsale paal bij 96.3 ± 4,3 ° geïdentificeerd (n = 11) (Figuur 6). De nasale choroideus horizontalis geïdentificeerd de nasale paal op 6,7 ± 5,8 ° en de temporele choroideus horizontalis geïdentificeerd de temporele paal bij 172.0 ± 4.4° (n = 9; Figuur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> Figuur 1: de musculus rectus superior met nauwkeurig identificeren het dorsale netvlies van een rechteroog. (A) een voorbeeld van een dorsale hoornvlies branden in de buurt van de cornea-scleral grens gemaakt met een brandijzer tip pen (witte pijl). De musculus rectus superior is ook zichtbaar in deze weergave (witte pijl). (B) een voorbeeld van een geheel gemonteerd netvlies met een verlichten van gesneden in de dorsale retina gemaakt door het bisecting van de musculus rectus superior. Pijl toont de diepe knippen in het dorsale netvlies gemaakt door de bisecting van de musculus rectus superior verlichten. Het netvlies is gekleurd met primair antilichaam geit anti-s-opsin (Zie Tabel van materialen) en secundair antilichaam ezel anti-geit Alexa 594 (Zie Tabel of Materials; excitatie: 590 nm, emissie: 620 nm) (cyaan). Netvlies was beeld met een Microscoop epifluorescerende met een Texas rood filter (595 nm). (C) A netvlies gereconstrueerd in Retistruct en gedraaid met een aangepaste code van MATLAB (Zie Aanvullende materialen) met de superieure rectus spier verlichten gesneden zichtbaar (witte pijl). D: dorsal, V: ventrale, T: stoffelijk, N: nasaal. Schaal bars = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> Figuur 2: met behulp van de choroideus horizontalis nauwkeurig identificeren de nasale en temporele Polen van het netvlies van een rechteroog. (A) een voorbeeld van een dorsale hoornvlies branden in de buurt van de cornea-scleral grens gemaakt met een brandijzer tip pen. (B) het vaatvlies horizontalis zichtbaar op de achterkant van het oog op de sclera (witte pijl). Het dorsale hoornvlies branden is ook zichtbaar in deze weergave, gelegen ongeveer 90° van de temporele choroideus horizontalis. (C) het vaatvlies horizontalis zichtbaar op de achterkant van het oog op de sclera, reizen van de oogzenuw naar de cornea-scleral grens. (D) een netvlies gekleurd met geit anti-s-opsin (Zie Tabel van materialen) en secundair antilichaam ezel anti-geit Alexa 594 (Zie Tabel of Materials; excitatie: 590 nm, emissie: 620 nm) (cyaan) met choroideus horizontalis bezuinigingen (horizontaal pijlen) en de dorsale verlichten knippen (verticale pijl). Netvlies was beeld met een Microscoop epifluorescerende met een Texas rood filter (595 nm). (E) een netvlies gereconstrueerd in Retistruct en met een aangepaste code voor MATLAB (Zie aanvullende materialen) gedraaid met de dorsale verlichten gesneden en de nasale en temporele choroideus horizontalis bezuinigingen zichtbaar (witte pijlen). D: dorsal, V: ventrale, T: stoffelijk, N: nasaal. Schaal bars = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> Figuur 3: met behulp van het s-opsin verloop te identificeren alle vier stokken van het netvlies. (A) een voorbeeld van een netvlies ontleed van een rechter oog, dat is immunostained aan het label s-opsin en beeld met een Microscoop epifluorescerende met een Texas rood filter (595 nm). De bezuinigingen in deze netvlies zijn willekeurige aangezien de topografische oriëntatie wordt bepaald door de s-opsin verloop. (B) de resultaten op de wederopbouw van het netvlies in A met Retistruct. Merk op dat de s-opsin gradiënt is niet correct uitgelijnd omdat het netvlies is niet uitgevoerd door de aangepaste code voor MATLAB (Zie Aanvullende materialen). (C) de resultaten van het draaien van het netvlies in A met de aangepaste code. Het netvlies is gedraaid zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring gelegen aan de onderkant is en de ventrale Retina genoemd. Omdat het netvlies afkomstig van een rechter oog is, de temporele paal is gelegen 90° tegen de klok in vanaf de dorsale pole en de nasale paal is gelegen 90° met de klok mee vanaf de dorsale pole. (D) een voorbeeld van een netvlies ontleed uit een linker oog, dat is immunostained aan het label s-opsin en beeld met een Texas rood filter (595 nm). De bezuinigingen in deze netvlies zijn willekeurige aangezien de topografische oriëntatie wordt bepaald door de s-opsin verloop. (E) de resultaten van digitaal reconstructie van het netvlies in D met Retistruct. Merk op dat de s-opsin gradiënt is niet correct uitgelijnd omdat het netvlies is niet gedraaid door de aangepaste code. (F) de resultaten van het draaien van het netvlies in D met de aangepaste code. Het netvlies is gedraaid zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring gelegen aan de onderkant is en de ventrale Retina genoemd. Omdat het netvlies afkomstig van een linker oog is, de neus paal is gelegen 90° tegen de klok in vanaf de dorsale pole en de temporele paal is gelegen 90° met de klok mee vanaf de dorsale pole. D: dorsal, V: ventrale, T: stoffelijk, N: nasaal. Schaal bars = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> Figuur 4: vergelijking van twee primaire s-opsin antilichamen in labeling s-opsin kegels. (A) A netvlies gekleurd met de geit anti-s-opsin primair antilichaam (Zie Tabel van materialen). (B) de andere retina van de dezelfde muis gekleurd met konijn anti-s-opsin primair antilichaam (Zie Tabel van materialen). (C) A vertegenwoordiger regio (0.1 x 0,1 mm2) van een netvlies gekleurd met de geit anti-s-opsin primair antilichaam. Foto genomen op een epifluorescerende Microscoop op 40 X vergroting. (D) een vertegenwoordiger regio (0.1 x 0,1 mm2) van een netvlies gekleurd met konijn anti-s-opsin (Zie Tabel of Materials), een primair antilichaam alternatief. Beeld is genomen op een epifluorescerende Microscoop op 40 X vergroting. (E) beide antilichamen label hetzelfde aantal s-cone buitenste segmenten want er is geen significant verschil in het aantal immunopositive s-kegels die zijn gekleurd door geit anti-s-opsin en konijn anti-s-opsin op elk van de geteste retinale excentriciteiten (n = 2; ANOVA met post hoc Bonferroni test; p > 0,05). Schaal bars = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> Figuur 5: een visuele gids voor het gebruik van de software van de Retistruct te reconstrueren netvlies immunostained met s-opsin. (A) A netvlies geopend in Retistruct met de zichtbare omtrek en een "Tear" toegevoegd. Punten van de "scheur" worden aangeduid met bovenliggende witte pijlen. Alle bezuinigingen in deze netvlies zijn willekeurig, geen bijzondere mijlpaal werd gebruikt voor het markeren van retinale oriëntatie tijdens dissectie. Belangrijke knoppen worden beschreven in het rood. (B) een netvlies met alle "Tears" toegevoegd en het dorsale netvlies geïdentificeerd met "D" op de rand van het netvlies. Merk op dat de "Reconstrueren Retina"-knop nu zichtbaar is. Belangrijke knoppen worden beschreven in het rood. (C) het proces van wederopbouw van een netvlies. De polar plot van het gereconstrueerde netvlies zal verschijnen aan de rechterkant, tonen dat de verlichten snijdt in cyaan (blauwe pijlen bovenop om te verduidelijken gesneden locaties). (D) het eindresultaat van het runnen van een netvlies via Retistruct. Het oorspronkelijke wholemount netvlies blijft aan de linkerkant en het gereconstrueerde netvlies aan de rechterkant wordt weergegeven. De verlichten bezuinigingen zijn zichtbaar in cyaan (witte pijlen bovenop om te verduidelijken gesneden locaties). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> Figuur 6: de superieure rectus spier- en vaatvlies horizontalis kan worden gebruikt om te nauwkeurig te oriënteren de muis netvlies. Een polar plot van de hoeken verkregen van beide superieure rectus spier verlichten van bezuinigingen of choroideus horizontalis snijdt in het netvlies die zijn gerenoveerd met Retistruct. Verlichten bezuinigingen op s-opsin immunostained gereconstrueerd netvlies werden geïdentificeerd en hun locaties werden vergeleken met de locatie van het s-opsin verloop. Met behulp van de douanecode van MATLAB nauwkeurig het netvlies draaien zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring is gelegen ventrally, echte dorsale (90° voor superieure rectus), waar nasaal (0° voor nasale choroideus horizontalis) en temporele (180° voor tijdelijke vaatvlies waar horizontalis) werden bepaald voor elke netvlies. De waarde van elke afzonderlijke verlichten van gesneden hoek werd bepaald in ImageJ en een gemiddelde hoek werd berekend voor elk verlichten gesneden type. Superieure rectus spier bezuinigingen geïdentificeerd de dorsale paal bij 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). De nasale choroideus horizontalis geïdentificeerd de nasale paal op 6,7 ± 5,8 ° en de temporele choroideus horizontalis geïdentificeerd de temporele paal bij 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Diepe Landmark</td>
			<td>Hoornvlies Burn locatie</td>
			<td>Pool van Retina geïdentificeerd</td>
			<td>Experimentele toepassing</td>
		</tr>
<tr>
<td>Superieure Rectus</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Live of vaste</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nasale choroideus horizontalis</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Nasaal</td>
			<td>Live of vaste</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temporele choroideus horizontalis</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Temporele</td>
			<td>Live of vaste</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin verloop</td>
			<td>Geen</td>
			<td>Dorsal ventrale, nasale, temporele</td>
			<td>Vaste</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Diepe monumenten, de pool van het netvlies zij identificeren, en of ze kunnen worden gebruikt voor verzending van live of vaste weefsel toepassing.

Dit protocol biedt een uitgebreide dissectie en analyse gids voor het gebruik van diep oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct en aangepaste code nauwkeurig en betrouwbaar oriënteren het netvlies geïsoleerde muis in anatomische ruimte.

Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Het doel van dit dissectieprotocol is om een gestandaardiseerde methodologie te bieden voor het gebruik van anatomische richtlijnen van het oog, zoals de rectus spieren, choroïde fissuur en S-opsinegradiënt voor de topografische oriëntatie van de muisretina. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze een betrouwbare manier bieden om de dorsale, ventrale, nasale en temporale polen van een geïsoleerde muisretina nauwkeurig te identificeren. Begin met het identificeren van een punt op de dorsale cornea dicht bij de cornea sclera-grens en tussen de nasale en temporale canthi.Raak de cornea aan met een verhitte cauterisatiepen voor minder dan een seconde om een brandmerk te maken voor oriëntatiedoeleinden. Herhaal dit voor het tweede oog. De aanwezigheid van de dorsale brand maakt het mogelijk om de superieure rectus spier te identificeren.Voor enucleatie, gebruik gebogen pincetten om het oog voorzichtig uit zijn holte te duwen en de bol van onderaf vast te grijpen. Til dan langzaam de bol uit zijn holte terwijl je hem tegelijkertijd voorzichtig van links naar rechts beweegt tot de bol loskomt uit de holte. Breng de bol met de aangehechte rectus spieren over naar een petrischaal met dissectiemedium.Als je met beide ogen werkt, zorg ervoor dat je bijhoudt welk oog het linkeroog is en welk oog het rechteroog is. Onder de dissectiescoop lokaliseer je visueel de dorsale corneabrand en identificeer je de superieure rectus spier waarmee deze is geassocieerd. Gebruik dissectiescijzen of een 20-gauge naald om de cornea op het brandmerk te puncteren.Maak vervolgens een diepe ontlastingssnede in de bol richting van de oogzenuw om de superieure spier te bisseren. Een geïsoleerde retina met deze snede is hier te zien, en een gereconstrueerde retina met deze snede wordt hier getoond. Gebruik twee sets pincetten om de retina te beginnen isoleren door voorzichtig het gat gemaakt met de punctie te scheuren tot een deel van de retina is blootgelegd.Scheur vervolgens de retina van de sclera los tot de sclera volledig is verwijderd. Verwijder de iris, lens, vitreus en eventuele resterende structuren tot de retina volledig is geïsoleerd. De aanwezigheid van een dorsale brand maakt het mogelijk om de nasale en temporale choroïde fissuur te identificeren.Als je met het rechteroog werkt, bevindt de nasale choroïde fissuur zich rechts van de brand en de temporale choroïde fissuur bevindt zich links van de brand. Dit is het tegenovergestelde van wanneer je met het linkeroog werkt. Om de choroïde fissuur als richtlijn te gebruiken om de oriëntatie van de retina te identificeren, lokaliseer en identificeer je de choroïde fissuur aan de achterkant van het oog.Orienteer de bol zodat de dorsale brandmerk zich op de superieure pool bevindt, zoals het zou zijn als het oog nog in de muis zat. Gebruik vervolgens dissectiescijzen of een 20-gauge naald om een punctie in de bol te maken, eerst waar de dorsale brand zich bevindt. Maak vervolgens een ondiepe ontlastingssnede richting de oogzenuw waar de dorsale corneabrand zich bevindt.Maak vervolgens de volgende twee diepe ontlastingssneden richting de oogzenuw. Een door de bladen van de dissectiescijzen uit te lijnen met de temporale choroïde fissuurlijn aan de achterkant van het oog, en een door de bladen van de dissectiescijzen uit te lijnen met de nasale choroïde fissuurlijn aan de achterkant van het oog. Deze sneden worden hier getoond op een geïsoleerde en gereconstrueerde retina.Na het maken van deze sneden, gebruik twee sets pincetten om voorzichtig aan de punctiegaten te scheuren tot een deel van de retina is blootgelegd. Gebruik dissectiescijzen om vier ontlastingssneden in de retina te maken zodat deze plat zal liggen. Monteer de retina, ganglioencelzijde omhoog, op nitrocellulosemembraan door elke hoek van de retina voorzichtig op het membraan te drukken met pincetten.Gebruik vervolgens pincetten om de gemonteerde retina onder te dompelen in één milliliter 4% paraformaldehyde bevat in de eerste put van een 24-welplate. Plaats de 24-welplate op een orbitale shaker op kamertemperatuur en fixeer de retina gedurende exact 40 minuten. Na het fixeren, breng de retina over naar de tweede put van de plaat, die is gevuld met één milliliter 0,1 molaire PBS en was de retina gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.Wanneer het wassen voltooid is, breng de gemonteerde retina over naar de vijfde put die één milliliter blokkeeroplossing bevat en incubeer deze een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag voeg je het konijn anti-S-opsine primaire antilichaam toe aan de blokkeeroplossing in een concentratie van één op 500 en incubeer je deze drie dagen bij vier graden Celsius. Na de drie dagen incubatie, was je het overtollige primaire antilichaam van de retina zes keer door het sequentieel in zes putten te plaatsen gevuld met één milliliter PBS gedurende 10 minuten elk bij kamertemperatuur.Plaats de gewassen retina vervolgens in een put met verse blokkeeroplossing en voeg je ezel anti-konijn Alexa 594 secundair antilichaam toe. Incubeer de retina met het secundaire antilichaam een nacht bij vier graden Celsius. Na de incubatie, was je de retina in PBS zes keer, zoals eerder.Gebruik pincetten om de gemonteerde retina over te brengen naar een petrischaal met PBS. Los de retina van het nitrocellulosemembraan door voorzichtig de punten van de pincetten tussen de retina en het membraan te steken tot de retina niet meer is bevestigd. Dompel een glazen microscoopglaasje in de PBS en monteer de retina op het glaasje door het drijvend op het glaasje te plaatsen en voorzichtig ermee te prikken met pincetten tot de retina aan het glas blijft plakken.Bedek de retina op het glaasje met montagemedium en plaats een 1,5 dekglas. Leg de plaat in een schuiflade en laat hem een uur op kamertemperatuur staan. Na een uur, plaats de schuiflade op vier graden Celsius.Nadat de plaat gedurende 24 uur is bedekt, gebruik je nagellak om de zijden van de plaat af te dichten om uitdroging te voorkomen. Dit is een voorbeeld van een retina geïsoleerd uit he

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een formele demonstratie van het ontleden van een muis oog, wat resulteert in een hele berg van het retinale pigment epitheel.

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

Source: Jagodzinska, J., et. al.,  Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  In this video, we demonstrate the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to image retinal layers and assess structural changes in a genetically modified mouse model with optic neuropathy.

In Vivo Imaging of the Mouse Retina Using Optical Coherence Tomography

Het verwijderen van de ogen, ook wel enucleatie, een bruikbare strategie om aspecten van de visuele, cross-modale en ontwikkelingsplasticiteit bestuderen langs de zoogdieren visuele systeem is omdat het leidt tot onomkeerbare gedeeltelijke (monoculair) of volledige (binoculair) verlies van gezichtsvermogen. Hier beschrijven we een zeer reproduceerbare en duidelijke aanpak om te presteren in vivo enucleatie.

Een zeer reproduceerbare en eenvoudige methode om te presteren In Vivo Oculaire Enucleatie in de muis na opening van de ogen

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Dit manuscript wordt een protocol voor de beeldvorming in vivo van het netvlies van de muis met hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) beschreven. Het richt zich op netvlies peesknoopcellen (regering van Cambodja) in de peripapillary regio, met verschillende scannen en kwantificeren van de aanpak beschreven.

Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Hier beschrijven we het gebruik van spectrale optische coherentietomografie (SD-OCT) om retinale en oculaire structuren in vivo te visualiseren in modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid.

In vivo structurele beoordelingen van oogziekten in knaagdiermodellen met behulp van optische coherentietomografie

Hier beschrijven we een in vivo beeldvormingstechniek met behulp van optische coherentietomografie om de diagnose en kwantitatieve meting van retinopathie bij muizen te vergemakkelijken.

Toepassing van optische coherentietomografie op een muismodel van retinopathie

Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.

Microdissectie van het knaagdieroog

Het huidige protocol schetst de stappen voor het in vivo uitlijnen van optische coherentietomografie-vezelgrafiebeelden (vis-OCTF) in vivo met ex vivo confocale beelden van hetzelfde netvlies van muizen met het oog op het verifiëren van de waargenomen morfologie van de axonbundel van retinale ganglioncellen in de in vivo beelden.

Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer een gestandaardiseerde dissectiemethode voor de topografische oriëntatie van het muizennetvlies met behulp van anatomische oriëntatiepunten zoals de rectus spieren, choroid fissuur en S-opsin gradiënt.

Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden (Video) | JoVE Journal

Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden

Meer video's verkennen