Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden
4 augustus 2018
Dit protocol biedt een uitgebreide dissectie en analyse gids voor het gebruik van diep oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct en aangepaste code nauwkeurig en betrouwbaar oriënteren het netvlies geïsoleerde muis in anatomische ruimte.
Het doel van dit dissectieprotocol is om een gestandaardiseerde methodologie te bieden voor het gebruik van anatomische richtlijnen van het oog, zoals de rectus spieren, choroïde fissuur en S-opsinegradiënt voor de topografische oriëntatie van de muisretina. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze een betrouwbare manier bieden om de dorsale, ventrale, nasale en temporale polen van een geïsoleerde muisretina nauwkeurig te identificeren. Begin met het identificeren van een punt op de dorsale cornea dicht bij de cornea sclera-grens en tussen de nasale en temporale canthi.
Raak de cornea aan met een verhitte cauterisatiepen voor minder dan een seconde om een brandmerk te maken voor oriëntatiedoeleinden. Herhaal dit voor het tweede oog. De aanwezigheid van de dorsale brand maakt het mogelijk om de superieure rectus spier te identificeren.
Voor enucleatie, gebruik gebogen pincetten om het oog voorzichtig uit zijn holte te duwen en de bol van onderaf vast te grijpen. Til dan langzaam de bol uit zijn holte terwijl je hem tegelijkertijd voorzichtig van links naar rechts beweegt tot de bol loskomt uit de holte. Breng de bol met de aangehechte rectus spieren over naar een petrischaal met dissectiemedium.
Als je met beide ogen werkt, zorg ervoor dat je bijhoudt welk oog het linkeroog is en welk oog het rechteroog is. Onder de dissectiescoop lokaliseer je visueel de dorsale corneabrand en identificeer je de superieure rectus spier waarmee deze is geassocieerd. Gebruik dissectiescijzen of een 20-gauge naald om de cornea op het brandmerk te puncteren.
Maak vervolgens een diepe ontlastingssnede in de bol richting van de oogzenuw om de superieure spier te bisseren. Een geïsoleerde retina met deze snede is hier te zien, en een gereconstrueerde retina met deze snede wordt hier getoond. Gebruik twee sets pincetten om de retina te beginnen isoleren door voorzichtig het gat gemaakt met de punctie te scheuren tot een deel van de retina is blootgelegd.
Scheur vervolgens de retina van de sclera los tot de sclera volledig is verwijderd. Verwijder de iris, lens, vitreus en eventuele resterende structuren tot de retina volledig is geïsoleerd. De aanwezigheid van een dorsale brand maakt het mogelijk om de nasale en temporale choroïde fissuur te identificeren.
Als je met het rechteroog werkt, bevindt de nasale choroïde fissuur zich rechts van de brand en de temporale choroïde fissuur bevindt zich links van de brand. Dit is het tegenovergestelde van wanneer je met het linkeroog werkt. Om de choroïde fissuur als richtlijn te gebruiken om de oriëntatie van de retina te identificeren, lokaliseer en identificeer je de choroïde fissuur aan de achterkant van het oog.
Orienteer de bol zodat de dorsale brandmerk zich op de superieure pool bevindt, zoals het zou zijn als het oog nog in de muis zat. Gebruik vervolgens dissectiescijzen of een 20-gauge naald om een punctie in de bol te maken, eerst waar de dorsale brand zich bevindt. Maak vervolgens een ondiepe ontlastingssnede richting de oogzenuw waar de dorsale corneabrand zich bevindt.
Maak vervolgens de volgende twee diepe ontlastingssneden richting de oogzenuw. Een door de bladen van de dissectiescijzen uit te lijnen met de temporale choroïde fissuurlijn aan de achterkant van het oog, en een door de bladen van de dissectiescijzen uit te lijnen met de nasale choroïde fissuurlijn aan de achterkant van het oog. Deze sneden worden hier getoond op een geïsoleerde en gereconstrueerde retina.
Na het maken van deze sneden, gebruik twee sets pincetten om voorzichtig aan de punctiegaten te scheuren tot een deel van de retina is blootgelegd. Gebruik dissectiescijzen om vier ontlastingssneden in de retina te maken zodat deze plat zal liggen. Monteer de retina, ganglioencelzijde omhoog, op nitrocellulosemembraan door elke hoek van de retina voorzichtig op het membraan te drukken met pincetten.
Gebruik vervolgens pincetten om de gemonteerde retina onder te dompelen in één milliliter 4% paraformaldehyde bevat in de eerste put van een 24-welplate. Plaats de 24-welplate op een orbitale shaker op kamertemperatuur en fixeer de retina gedurende exact 40 minuten. Na het fixeren, breng de retina over naar de tweede put van de plaat, die is gevuld met één milliliter 0,1 molaire PBS en was de retina gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
Wanneer het wassen voltooid is, breng de gemonteerde retina over naar de vijfde put die één milliliter blokkeeroplossing bevat en incubeer deze een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag voeg je het konijn anti-S-opsine primaire antilichaam toe aan de blokkeeroplossing in een concentratie van één op 500 en incubeer je deze drie dagen bij vier graden Celsius. Na de drie dagen incubatie, was je het overtollige primaire antilichaam van de retina zes keer door het sequentieel in zes putten te plaatsen gevuld met één milliliter PBS gedurende 10 minuten elk bij kamertemperatuur.
Plaats de gewassen retina vervolgens in een put met verse blokkeeroplossing en voeg je ezel anti-konijn Alexa 594 secundair antilichaam toe. Incubeer de retina met het secundaire antilichaam een nacht bij vier graden Celsius. Na de incubatie, was je de retina in PBS zes keer, zoals eerder.
Gebruik pincetten om de gemonteerde retina over te brengen naar een petrischaal met PBS. Los de retina van het nitrocellulosemembraan door voorzichtig de punten van de pincetten tussen de retina en het membraan te steken tot de retina niet meer is bevestigd. Dompel een glazen microscoopglaasje in de PBS en monteer de retina op het glaasje door het drijvend op het glaasje te plaatsen en voorzichtig ermee te prikken met pincetten tot de retina aan het glas blijft plakken.
Bedek de retina op het glaasje met montagemedium en plaats een 1,5 dekglas. Leg de plaat in een schuiflade en laat hem een uur op kamertemperatuur staan. Na een uur, plaats de schuiflade op vier graden Celsius.
Nadat de plaat gedurende 24 uur is bedekt, gebruik je nagellak om de zijden van de plaat af te dichten om uitdroging te voorkomen. Dit is een voorbeeld van een retina geïsoleerd uit he
Overzicht
Dit protocol biedt een dissectie- en analysegids met behulp van oculaire kenmerken en immunohistochemie om de geïsoleerde muisretina nauwkeurig te oriënteren. Belangrijke technieken omvatten de identificatie van dorsale en ventrale polen door middel van specifieke anatomische kenmerken en S-opsine gradiënten.
Belangrijke studiecomponenten
Gebieden van wetenschap
- Neurowetenschappen
- Oftalmologie
- Immunohistochemmie
Achtergrond
- De studie richt zich op nauwkeurige oriëntatie van het netvlies met behulp van gevestigde anatomische oculaire kenmerken.
- Belang van het herkennen van anatomische kenmerken voor verbeterde nauwkeurigheid in netvliesgerelateerd onderzoek.
- Toepassing van immunohistochemie bij het visualiseren van netvliesstructuren.
- Standaardisatie van dissectieprotocollen voor reproduceerbaarheid in onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methodologie te bieden voor het identificeren van specifieke netvlisoriëntaties.
- Om anatomische kenmerken zoals het S-opsine gradiënt te gebruiken in netvliesanalyse.
- Om de nauwkeurigheid van geïsoleerde netvliesstudies in de neurowetenschappen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Deze studie gebruikt voornamelijk dissectietechnieken voor geïsoleerde muisretina's.
- De muisretina dient als modelsysteem, met focus op het gebruik van oculaire kenmerken.
- Er werden geen multiomics workflows genoemd in de tekst.
- Het protocol beschrijft specifieke stappen voor enucleatie, dissectie, fixatie en kleuring van het netvlies.
- Belangrijke methodologische details omvatten het gebruik van cauterpennen voor markering en immunokleuringstechnieken.
Belangrijkste resultaten
- De studie toont met succes de isolatie van netvliesstructuren met nauwkeurige anatomische oriëntatie.
- Het benadrukt het nut van het S-opsine gradiënt voor het identificeren van netvlispolariteit.
- Mechanistische inzichten in netvlisdissectie werden gegeven met duidelijke procedurele stappen.
- Concludeerde met nadruk op het belang van standaardisatie van technieken in netvlisstudies.
Conclusies
- Dit protocol vergemakkelijkt verbeterde nauwkeurigheid in netvlisoriëntatie en -analyse.
- Resultaten maken betere biomechanische en fysiologische beoordelingen van netvlisreacties en -structuren mogelijk.
- Belangrijke implicaties voor toekomstig onderzoek in de visiewetenschap en anatomische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate spatial orientation of the mouse retina is critical for reproducible analysis in visual neuroscience, enabling reliable comparison of cell density gradients, directional tuning, and degeneration patterns across studies. Standardizing orientation methods using deep ocular landmarks reduces variability and supports mechanistic de-risking in target validation pipelines. This protocol enhances predictive confidence by ensuring consistent anatomical alignment, a prerequisite for translational biomarker alignment and preclinical model reproducibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal cell type gradients and pathway-specific functional assays through precise dorsal-ventral and nasal-temporal orientation.
- Operational Value: Reduces ambiguity in phenotypic screening by establishing a repeatable reference frame for directional tuning and topographic analyses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay standardization by ensuring consistent retinal flat-mount orientation, critical for quantitative immunohistochemistry and imaging-based readouts.
- Operational Value: Facilitates scalable workflows through reliable dissection and fixation steps compatible with multi-well plate processing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables alignment of degeneration patterns with anatomical axes, improving translational biomarker relevance in retinal disease models.
- Operational Value: Promotes cross-study comparability by minimizing orientation-related noise in preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into early discovery workflows by providing a standardized orientation step prior to immunohistochemistry, imaging, and functional assay execution, ensuring data integrity from target validation through preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate spatial mapping of retinal structures and cell-type distributions.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible retinal isolation and orientation, reducing technical variance in compound screening.
- Analytics: Generates quantifiable spatial data via S-opsin gradient analysis, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by ensuring consistent anatomical reference points for degeneration and regeneration studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and orientation platform applicable across multiple retinal neuroscience projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in retinal orientation-dependent assays.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability through standardized dissection, fixation, and staining protocols.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing biological noise in early-stage retinal target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by ensuring data comparability across studies and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and ocular anatomy identification.
- Dependent on access to cautery tools, dissection microscopes, and immunohistochemistry reagents.
- Necessitates standardization of landmark identification across teams to ensure inter-laboratory consistency.
- Adaptation to alternative model systems may require validation of conserved ocular landmarks.
- Relies on computational tools (Retistruct, custom code) for S-opsin-based orientation, adding bioinformatics dependency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Using the Superior Rectus Muscle Landmark to Identify Retinal Orientation
2:36
Using the Choroid Fissure Landmark to Identify Retinal Orientation
4:06
Labeling the S-opsin Gradient in the Mouse Retina
7:02
Results: Using the S-opsin Gradient to Identify All Four Poles of the Retina
8:09
Conclusion
