Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping
November 3rd, 2018
De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden bij de diagnose van myeloïde ziekten zoals myelodysplasiesyndromen of andere hematologische ziekten die evolueren met rijpingsafwijkingen in myeloïde celstamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de subjectiviteit van de onderzoeker in die analyse en interpretatie vermindert. Deze methode kan inzicht geven in welke de meest discriminerende parameters voor myelodysplasie zijn.
Het maakt kwantificering van de verschillen van normale myeloïde cel populaties. Het aantonen van de procedure zal Tiphanie Picot, een post-doctorale collega van ons laboratorium. Begin met het mengen van 600 microliter van het primaire celmonster met 10 milliliter wasbuffer in een conische buis van 15 milliliter voor twee centrifugaties en 10 milliliter verse wasbuffer per wasmachine.
Na de tweede wasbeurt, opnieuw opschorten de pellet in 400 microliter verse wasbuffer, en breng 350 microliter van de cel suspensie in een vijf milliliter polypropyleen FACS buis, met het hele paneel van backbone antilichamen. Na het grondig mengen van de cellen, pipet gelijke volumes van de cel antilichaam oplossing in drie nieuwe polypropyleen buizen, en breng het uiteindelijke volume in elke buis tot 200 microliters met verse wasbuffer indien nodig. Voeg vervolgens het juiste volume antilichamen toe tegen de celoppervlakmarkers die van belang zijn bij het mengen, voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
Voeg aan het einde van de incubatie twee milliliter lysingoplossing toe met het mengen, voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verzamel de gelyseerde cellen door centrifugatie, en gooi alle, behalve de laatste 50 microliter van supernatant in elke buis, zonder verstoring van de pellet. Schort de pellets opnieuw op in de resterende supernatant, met zachte menging, en voeg twee milliliter verse wasbuffer toe aan elk monster.
Gooi na de tweede wasbeurt de supernatant weg, waardoor er ongeveer 50 microliter restvolume in elke buis achterblijft, zonder de pellet te storen. Schort de pellet opnieuw op in 200 microliter PBS met mengen, voor onmiddellijke analyse. Als u de monsters op een stroomcytometer wilt lezen, opent u eerst een nieuw experiment in de stroomcytometersoftware en wijzigt u het experiment op basis van de naam, het type monster en de datum.
Maak een nieuw exemplaar voor drie buizen en geef de antilichamen op die in elke buis worden gebruikt in de indeling van het experiment. Open de cytometer-instellingen en selecteer toepassingsinstellingen om de waarden toe te passen die zijn verkregen in de maandelijkse installatie. Open een nieuw globaal werkblad en maak de juiste stipplospunten voor het gating van de singletcellen, evenals voor de granulocyten-, monocyten-, ontploffings- en lymfocytenpopulaties.
Maak een nieuw globaal werkblad voor de compensatiebesturingselementen. Dan, verwerven 500,000 gebeurtenissen van elke buis, op een gemiddelde overname tarief, het exporteren van de gegevens als fcs 3.0 bestanden, na hun technische validatie. Voordat u een nieuwe analyse start, downloadt u de cyt-bestanden met de normale beenmerggegevens, voor neutrofiele, monocytische en nucleated rode afstammingen en de analysebestanden in inp-formaat.
Sla de gegevens vervolgens op op uw bureaublad. Om de neutrofiele rijping op te slaan in de databank, opent u eerst de Infinicyt-software en opent u vervolgens het cytbestand dat overeenkomt met de neutrofiele rijpingsgegevens. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek en sla het rijpingstraject van de neutrophil op naar de database.
Open het fcs-bestand voor de neutrofiele afstamming die geanalyseerd moet worden. Upload het neutrofiele rijpingsinp-bestand vanaf het tabblad profielen. De analyse voor deze afstamming is verdeeld in drie stappen.
Begin met de selectie van CD34 positieve, neutrofiele-gepleegde ontploffingen. Gebruik hiervoor een kruising van zeven poorten, om de selectie van de CD34 positieve, CD117 positieve, HLADR laag, CD10 negatief, CD13 positieve, CD11 b-negatieve gebeurtenissen mogelijk te maken. Vervolg de analyse met de selectie van de CD117 positieve, CD34 negatieve neutrofiele precursoren.
Zet de analyse voort met de selectie van meer volwassen neutrofiele cellen. Toon vervolgens de analyse van monocytische afstammingcellen. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek.
Controleer of de pijl die het gevoel van rijping aangeeft is gericht van onrijpe, monocytische cellen, CD14 negatief, IREM2 negatief, op de volwassen monocyten, CD14 positief, IREM2 positief. Bewaar de rijpingsroute voor monocytische afstamming in de database. Open het fcs-bestand voor monocytische afstamming rijping die moet worden geanalyseerd.
Upload het profiel voor monocytische afstamminganalyse. Om de monocytische lijncellen te identificeren, gebruikt u een kruising van vier poorten waarmee de selectie van CD64 positieve hoog, CD117 positief, CD117 negatief, HLADR positieve gebeurtenissen mogelijk maakt. Wijs deze gebeurtenissen toe aan het monocytische tabblad in de structuur van de bevolkingshiërarchie.
Open het NRC-cytbestand dat opgeslagen moet worden in de NRC-database. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek en sla de nucleated rode cellen rijpingsroute naar de database op. Open het fcs-bestand dat geanalyseerd moet worden.
Upload vanuit de profielen de sjabloon van analyse voor nucleated rode cellen. De analyse voor deze afstamming is verdeeld in twee stappen. Te beginnen met de selectie van de CD34 positieve, erythroid gepleegd ontploffing.
Gebruik hier een kruispunt van zeven poorten om de selectie van de CD34 positieve, CD117 positieve, HLADR laag, CD105 positief, CD33 negatief, CD36 positieve, CD71 positieve gebeurtenissen mogelijk te maken. Wijs deze gebeurtenissen toe aan het tabblad NRC in de bevolkingshiërarchie. Verwijder de CD34 positieve erythroroid gepleegd ontploffing van het zicht.
Om meer volwassen erythroid cellen te identificeren, gebruik maken van een kruising van vier poorten die discriminatie van CD45 negatief en CD45 positieve laag, side-scatter laag, CD36 positief hoog, en CD71 positief hoog mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de CD36 high side scatter lage bloedplaatjes uit de nucleated rode cellen en wijs deze populatie toe aan het tabblad NRC. Open het cyt-bestand dat overeenkomt met de afstamming van de belangstelling van de zaak die moet worden geëvalueerd om de myeloïde rijping in het beenmergcompartiment te beoordelen.
Houd alleen de gebeurtenissen die zijn toegewezen aan het tabblad van de neutrophil in de structuur van de bevolkingshiërarchie zichtbaar. Teken het rijpingstraject op de APS-grafiek en laad de database die overeenkomt met de rijping van de neutrophil in normaal beenmerg en vergelijk gegevens. Als de gegevens ten minste gedeeltelijk compatibel zijn, maakt de software een diagram voor genormaliseerde rijpingsverschillen en een parameterband om de rijpingsverschillen te visualiseren.
Om de rijping van monocyten in het beenmergcompartiment te vergelijken, voor een nieuw geval met gegevens van normale beenmerg, ook in de monocytendatabase, opent u het cytbestand dat overeenkomt met de monocytische cellijn. Houd alleen de gebeurtenissen die zijn toegewezen aan het tabblad monocyten in de hiërarchiestructuur van de populaties zichtbaar en teken het rijpingspad in de APS-grafiek. Laad de database die overeenkomt met de rijping van de monocyten in normale beenmerg en vergelijk gegevens.
Om de nucleated rode cellen rijping in het beenmergcompartiment te vergelijken, voor een nieuw geval, met gegevens van de normale beenmerg, opgenomen in de NRC-database, open het cytbestand dat overeenkomt met de afstamming van de NRC. Houd alleen de gebeurtenissen die zijn toegewezen aan het tabblad NRC in de structuur van de bevolkingshiërarchie zichtbaar. En teken de rijpingsroute op de APS grafiek.
Laad de database die overeenkomt met de NRC-rijping in normale beenmerg en vergelijk gegevens. Klik vervolgens op genormaliseerde rijpingsverschillen en zoom op genormaliseerde rijpingsverschillen om de betekenis van de verschillen tussen het nieuwe bestand en de gegevens in de database te visualiseren. Vergeet niet dat methoden die de hiërarchische classificatiealgoritmen in de stroomcytometrische gegevensanalyse gebruiken, zeer subjectief en inherent onjuist zijn, omdat ze niet meetellen voor overlapping van celpopulaties.
De evaluatie van nieuwe gevallen van cytopenie, waarvan wordt vermoed dat ze MDS zijn tegen de myeloïde normale rijpingsdatabanken, maken het mogelijk om abnormaal uitgedrukte rijpingsantigen van neutrofiele, monocyten en NRC-geslachten te identificeren, zelfs in gevallen zonder cytologische of cytogene afwijkingen. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de stroom cytometrische gegevens te verwerven, op gestandaardiseerde manier, om maandelijkse cytometer instelling setup uit te voeren, dagelijkse controles, om het antilichaam voor gebruik grondig pipette, en om de kleuring tijden te respecteren. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kompas worden uitgevoerd om de verschillende groep gevallen te vergelijken en om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de uiteindelijke typische afdruk is voor een bepaalde groep gevallen.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor de onderzoekers die geïnteresseerd waren in het verkennen van myeloïde celrijpingspatronen, in gevallen van kloonhematopoiesis met onbepaald potentieel om de uiteindelijke veranderingen te identificeren die betrouwbaar gerelateerd zijn aan dysplastisch proces. Houd er rekening mee dat het bijwerken van de database met een verhoogd aantal gegevens van gezonde donoren de robuustheid van de analyse kan verbeteren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van multi-parameter flow cytometry (MFC) om het diagnostische proces voor myelodysplastische syndromen (MDS) te verbeteren. Het benadrukt de belangrijkheid van specificiteit en gevoeligheid in MFC-analyse voor klinische toepassingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hematologie
- Myeloïde ziekten
- Diagnostische technieken
Achtergrond
- MDS-diagnose is uitdagend zonder morfologische criteria.
- Niet-informatieve cytogenetica bemoeilijkt het diagnostische proces.
- MFC kan het MDS-diagnostisch proces mogelijk verfijnen.
- Reproduceerbaarheid van data tussen operators is cruciaal.
Doel van het onderzoek
- Om de effectiviteit van MFC bij het diagnosticeren van myeloïde ziekten te evalueren.
- Om de meest discriminerende parameters voor myelodysplasie te identificeren.
- Om subjectiviteit in analyse en interpretatie te verminderen.
Gebruikte methoden
- Primaire celmonsters mengen met wasbuffer.
- Centrifugeringen uitvoeren voor monstervoorbereiding.
- Verschillen van normale myeloïde celpopulaties kwantificeren.
- De procedure demonstreren door een post-doctoraal fellow.
Belangrijkste resultaten
- MFC geeft inzicht in verschillen van myeloïde celpopulaties.
- De techniek vermindert subjectiviteit van onderzoekers.
- Het maakt kwantificering van discriminerende parameters mogelijk.
- De reproduceerbaarheid van data wordt benadrukt voor klinische bruikbaarheid.
Conclusies
- MFC kan de diagnostische nauwkeurigheid voor MDS verbeteren.
- Specificiteit en gevoeligheid zijn vitaal voor klinische toepassing.
- Verdere validatie is nodig voor wijdverbreid klinisch gebruik.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
