Name: In Vivo Microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht Cut-off Probes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer in vivo microdialyse voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten uit hersenvloeistof bij wakke, vrij bewegende muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neurale signalering en afvalverwijdering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door '' Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (hersenen eiwitten veroudering en dementie Control)(15H01552) van MEXT en Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (B) (16K 20969). De auteur dankt Dr. David M. Holtzman en Dr. John R. Cirrito voor de technische adviezen tijdens de ontwikkeling van deze methode.

Alle dierlijke studies werden herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Graduate School of Medicine aan de Universiteit van Tokio.
1. pre-operatieve ingreep
<ol><li>Voordat u begint chirurgie, veeg alles met 70% ethanol steriele voorwaarden te handhaven. Thermische ondersteuning met behulp van een verwarming pad wordt aanbevolen.</li>
	<li>Anesthetize de muizen door intraperitoneale injectie van Chloraalhydraat (400 mg/kg). Afstomping bevestigen door het uitvoeren van een teen snuifje. Gebruik van meloxicam SR op inductie en buprenorfine inning bod gedurende ten minste 24 uur wordt aanbevolen.</li>
	<li>Het scheren van het haar met een chirurgische clipper. Een muis in de muis en neonatale rat adapter met oor bars en een neus klem vast te stellen. Opmerking: Het is essentieel om ervoor te zorgen dat muis hoofd is beveiligd in dit stadium en side-by-side niet wordt verplaatst.</li>
	<li>Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.</li>
</ol>2. stereotaxic chirurgie voor gids canule implantatie
<ol><li>Stel de muis en neonatale rat adapter op het stereotaxic apparaat. Maak een incisie sagittally op de huid over de schedel met behulp van een scalpel.　Veeg van bloed en het bindweefsel op de schedel met behulp van een vochtig wattenstaafje.</li>
	<li>Het bepalen van de coördinaat voor hersenen regio van belang met behulp van de atlas van de hersenen. Voordat u begint metingen, zorg ervoor dat middellijn rechte zodat de boor kan worden verplaatst van A-P en blijven op de middellijn Sutuur (geologie) de hele tijd. Opmerking: Dit artikel maakt gebruik van de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,5 mm, D/V:-1,2 mm, 12 graden) te richten posterieure hippocampus.</li>
	<li>Niveau schedel A-P<ol>
<li>Bevestig een boor op een manipulator van stereotaxic frame. Verlaag de boor totdat het zachtjes lambda aanraakt en de ventrale coördinaat opnemen. Herhaal deze procedure voor bregma. Opmerking: Wanneer de schedel wordt herverdeeld, is de verticale afmeting van bregma is gelijk aan die van lambda. Zo niet, de hoogte van de neus klem dienovereenkomstig aanpassen. Nadat de schedel wordt herverdeeld, registreren de anterior/posterior, laterale coördinaat van bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Niveau schedel links-rechts<ol>
<li>Verplaatsen van de boor van de bregma naar de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L: +2.0 mm), lagere de boor op de schedel en de verticale coördinaat opnemen. Herhaal deze procedure voor de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,0 mm). Opmerking: Als de schedel wordt herverdeeld, is deze verticale metingen van twee equidistante punten vanaf de middellijn zijn gelijk. Als dat niet het geval is, het aanpassen van de hoogte van de balken van het oor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boor een burr gat zorgvuldig op de doelgroep coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,5 mm) om het implantaat een canule gids. Als de diameter van een burr gat niet groot genoeg voor een gids canule implantatie is, boor een gat dat wordt overlapt door het ene. Boor een gat aan het bot van de pariëtale recht (contralaterale zijde) en voeg een botschroef, die helpt bij het beveiligen van tandheelkundige cement in 1.10 (Zie figuur 1B).</li>
	<li>Een circulaire vergrendeling stuk uit de achterzijde van het deksel van een centrifugebuis 1,5 mL gesneden met een scheermesje en maak een '' kroon ''. Deze kroon wordt gebruikt om te voorkomen dat tandheelkundige cement verspreiden naar de huid. Plaats deze op de schedel, zodat de burr gaten gemaakt in stap 2.5 binnen de cirkel (Zie Figuur 1 blijven).</li>
	<li>Een stereotaxic vergadering instellen door een gids canule op de korte arm van een stereotaxic adapter en zet vast met behulp van een GLB moer. De lange arm van de stereotaxic adapter ingesteld op de elektrode klem. Sluit het op de manipulator van het stereotaxic apparaat (Zie figuur 1A).</li>
	<li>Draai de D-V stereotax vergadering op de manipulator arm door 12 graden (Zie figuur 1B). Verplaats de canule gids naar het burr gat gemaakt in 1.6. Plaats de canule gids langzaam in de hersenen door het verlagen van het door 1.2 mm. Opmerking: De hoek van de sonde is specifiek voor de hippocampus; andere regio's kunnen vereisen andere hoeken of geen hoek helemaal. Raadpleeg een atlas van de hersenen voor precieze coördinaten. Droog het oppervlak van de schedel, want als niet de cement niet vasthouden zal en cement GLB kan worden verdreven</li>
	<li>Voeg de tandheelkundige cement binnen de kroon aan zowel het metalen deel van de canule gids en de botschroef genoeg om hen volledig te dekken. Gelden aanvullende tandheelkundige cement als er een deel van de schedel blootgesteld.</li>
	<li>Wachten tot tandheelkundige cement wordt volledig gedroogd (~ 12-20 min). Verwijder de stereotaxic adapter van de elektrode klem. Verwijderen van de GLB-moer en de stereotaxic adapter met een dummy sonde vervangen en vastmaken van de GLB-moer.</li>
	<li>Laat de muisknop los uit het stereotaxic apparaat en huis van de muis alleen in een individuele kooi. Opmerking: De muis mag niet worden overgelaten zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Controleren de muis dagelijks tot de dag van microdialysis. De muis ontvangt NSAID's zoals carprofen als het lijkt te zijn in pijn. 2 weken wachten is noodzakelijk voor slaap-waak onderzoek, zodat de muis habituates aan de nieuwe milieu-10, maar andere soorten studies kortere perioden van herstel (bijvoorbeeld 1-2 dagen vereisen kunnen).</li>
</ol>3. Microdialysis Setup
<ol><li>Kwaliteitscontrole van sondes: Vul een wegwerp 1ml spuit met gedestilleerd waterand aansluiten op de uitlaat (kortere poort) van een sonde die met behulp van een byton buis. Bedek de luchtgaten met de vingers en druk de plunjer van de injectiespuit zachtjes om de infusie van water aan de sonde. Controleer of water uit de inlaat van de sonde blijkt en er geen lekkage op het oppervlak van een microdialysis-membraan is.<ol>
<li>Activering van sondes: dompelen de membranen van een sonde in ethanol (70-100%) gedurende twee seconden. Vervolgens inblazen gedestilleerd water de sonde opnieuw met een spuit weer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van perfusie buffer: toevoegen om te voorkomen dat de hechting van doel moleculen naar de tubings, BSA door verdunning van de oplossing van de BSA van 30% naar 4% met kunstmatige CSF (1.3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 , 122 mM NaCl, pH 7,35 =), die overeenkomt met elektrolyt concentratie in het CSF, onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken. De buffer van de perfusie door middel van een spuit filter eenheid met 0.1 µm poriegrootte filteren. Opmerking: 4% BSA verbetert herstel voor steken eiwitten maar levering van stoffen, met name voor verbindingen die hoge BSA-bindende ernstig kan beperken. Dit is een voordeel van het gebruik van lagere concentratie van BSA (bijvoorbeeld 0,15%) in bepaalde gevallen3. Merk op dat BSA kan statistische heel gemakkelijk-wanneer geschud door vortex of roer plaat. Deze aggregaten kunnen sondes of membraan poriën verstoppen. Ga voorzichtig te werk bij het opstellen van een oplossing van de BSA te beperken deze aggregatie</li>
	<li>Twee afzonderlijke regels voorbereiden met inlaat en uitlaat (Zie Figuur 1 c) en beide lijnen sluit met een naald van de verbinding. Vul een wegwerp 3 mL spuit gevuld met perfusie buffer en verbinding te maken met het einde van de inlaat van de buis met behulp van een naald blunt-einde. Vul de hele slang met perfusie buffer door de spuitpomp uit te voeren.</li>
	<li>Stoppen met de spuitpomp en de naald van de verbinding tussen lijn van de inlaat en uitlaat lijn vervangen door een sonde van de geactiveerde microdialysis uit stap 3.3 (Zie Figuur 1 c). Voordat deze vervanging, door de GLB-moer te zetten door de sonde.</li>
	<li>Monteer de roller buis in de uitlaat slang op de roller pomp. Start de spuitpomp op 10 µL/min en vervolgens de roller pomp aan de iets langzamere stroomtarief (9.5-9,8 µL/min). Zorg ervoor dat alle luchtbellen in de hele buis, die invloed op het herstel hebben kan bij het invoeren van de sonde te verwijderen.</li>
	<li>Anesthetize de muis vanaf stap 1.12 op dezelfde manier als in stap 1.2. Zet de muis kraag om haar nek. Verwijder de moer van het GLB en de dummy sonde langzaam een microdialysis-sonde uit 3.4 via de canule gids invoegen en vastmaken van de GLB-moer.</li>
	<li>Plaats de muis in de kooi aangesloten op een gratis voortbewegende systeem en ketting de muis met de kraag. Houden lopend-spuitpomp én roller pomp aan de aangegeven stroomtarief in stap 3.5 voor ten minste 1 uur. Opmerking: Om te bereiken ISF collectie van wakker dieren, dit artikel maakt gebruik van een gratis voortbewegende systeem, waar de kooi zelf reageert op het dier beweging om te voorkomen dat tubings draaien. U kunt ook de vloeibare wartels verkrijgbaar bij diverse bedrijven kunnen ook worden gebruikt.</li>
	<li>Stop de roller pomp eerst en vervolgens de spuitpomp. Stel de gewenste debiet. Voer de spuit pomp 20% sneller dan de roller pomp. Opmerking: bijvoorbeeld, als u op 1 µL/min uitvoeren, werken de spuitpomp op 1.2 µL/min. optimale debiet empirisch moet worden bepaald voor elke molecuul.</li>
	<li>Verzamelen van ISF monsters: plaats het vrije uiteinde van de uitlaat slang op de gekoelde breuk verzamelaar. Opmerking: Passende monstervolume varieert afhankelijk van testen gebruikt voor analyse.</li>
	<li>Verwijder na de voltooiing van het experiment, de sonde. (Anesthetize de muis desgewenst.)  Omgaan met muis herstel de dezelfde manier als in stap 2.11. Het analyseren van de verzamelde ISF door methoden zoals HPLC of ELISA.</li>
	<li>Om te wassen de hele buis na microdialysis, sluit inlaat en uitlaat tubings opnieuw door het vervangen van de sonde met de verbinding naald en het verdunde bleekwater in de hele buis uitgevoerd en vervolgens met water spoelen. Droog en bewaar het voor herhaald gebruik. Opmerking: Andere soorten tubings zijn aanvaardbaar, maar BSA in perfusie buffer kan verstoppen de tubings met kleine diameter, dus deze tubings worden beschouwd als eenmalig gebruik. De slangen kunnen worden versleten of verstopt na meerdere toepassingen, dus zorg ervoor dat het debiet telkens vóór gebruik strookt.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

Microdialysis met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen moet worden bediend door een push-pull-modus, dus is het essentieel dat het debiet nauwkeurig en constant is. De onnauwkeurigheid in de stroomsnelheid kunnen de oorzaak van air bubble generatie en inconsistentie in de concentratie van het monster. Als de stroom niet consistent is, controleert u alle verbindingen op lekkage. Als het probleem nog steeds aanhoudt, is het mogelijk dat het nodig om opnieuw te beginnen met nieuwe sondes en tubings.
<p clas...

ISF bestaat uit 15-20% van de totale hersenvolume en biedt een communicatie cruciaal voor signaaltransductie, substraat vervoer en afval goedkeuring1. Daarom zullen de mogelijkheid van het ISF verzamelen van levende dieren verlenen meer gevolgen voor verschillende biologische processen, alsmede ziekte mechanisme. In vivo microdialysis is een van de enkele methoden die steekproef en kwantificeren van extracellulaire moleculen van ISF van wakker, vrij bewegende dieren en daardoor fungeert als een nuttig hulpmiddel in neurowetenschap onderzoek veld2,3. Bij deze methode, microdialysis sondes met semipermeable membranen zijn ingevoegd in de hersenen en geperfundeerd met perfusie buffer op de relatief trage stroomsnelheid (0.1-5 µL/min). Tijdens deze perfusie, extracellulaire moleculen in ISF passief diffuse in de sonde volgens het verloop van de concentratie en verzamelen als een dialysate. Hoewel dit artikel richt zich op de methode om te monster ISF in de hersenen, kunnen zowel het beginsel als de methode worden toegepast op andere organen door de juiste wijziging indien nodig.
Microdialysis werkte eerst in de vroege jaren 1960, en sinds dan het uitgebreid gebruikt is voor het verzamelen van kleine molecules, zoals aminozuren of neurotransmitters in de hersenen. Echter, recente commerciële beschikbaarheid van microdialysis sondes met hoog-moleculair gewicht afgesneden membranen (100 kDa-3 MDa) heeft uitgebreid de toepassing ervan op relatief grotere proteïnen in ISF evenals4,5,6 ,7. De studies met behulp van deze sondes heeft geleid tot de bevinding dat eiwitten zoals tau of α-synuclein die werden lang beschouwd als exclusieve cytoplasmatische zijn ook fysiologisch aanwezig in ISF4,5,8.
Een van de problemen microdialysis sondes met grote afgesneden membranen (meestal meer dan 1.000 kDa) is dat ze gevoeliger voor ultrafiltratie vocht verlies als gevolg van de innerlijke druk opgebouwd in de sondes. Microdialysis sondes gebruikt hier hebben een unieke structuur om te voorkomen dat dit probleem. De druk zal niet worden opgebouwd als gevolg van deze structuur, dus microdialysis met deze sondes moet worden beheerd in een modus van de "push-pull" een spuitpomp met perfuse de sondes (= druk) en een roller/peristaltische pomp voor het verzamelen van de dialysate komen uit het stopcontact sonde (= Trek) 9 (hoewel het zowel push- en pull-pompen, als gevolg van druk annuleren luchtgaten aanwezig in de sondes, moet het systeem is technisch alleen aangestuurd door de pull-pomp). Dit artikel begint met de stereotaxic operatie een gids canule innesteling en wordt beschreven hoe u microdialysis regels instellen om te verzamelen van ISF via microdialysis sondes met 1.000 kDa cut-off membranen.

<table><tbody><tr><td>The Univentor 820 Microsampler</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Gekoelde fractiecollector</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Rollerpomp</td><td>Eicom microdialyse</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn Stand-Alone Systeem</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>Vrij bewegend systeem</td></tr><tr><td>Dual species kooikit</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>AtmosLM Microdialyse sonde (schachtlengte 8 mm, membraanlengte 2 mm)</td><td>Eicom microdialyse</td><td>PEP-8-02</td><td>Schachtlengte voor een sonde, een gids, een dummy sonde en een stereotaxische adapter moeten identiek zijn.</td></tr><tr><td>Microdialyse gids (schachtlengte 8 mm)</td><td>Eicom microdialyse</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Microdialyse dummy sonde (schachtlengte 8 mm)</td><td>Eicom microdialyse</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Botschroef</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C&amp;B set</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Tandheelkundig cement</td></tr><tr><td>Stereotaxisch instrument voor kleine dieren met digitale weergaveconsole</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>Stereotaxisch apparaat</td></tr><tr><td>Muis en neonatale rat adapter</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Standaard oorstaven en rubberen tips voor muis stereotaxie</td><td>Stoelting</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Albumine oplossing uit runder serum</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>30% BSA oplossing</td></tr><tr><td>FEP slang (70 cm)</td><td>Eicom microdialyse</td><td>JF-10-70</td><td>Intern volume = 0.5 &micro;L/cm</td></tr><tr><td>Teflon slang (50 cm)</td><td>Eicom microdialyse</td><td>JT-10-50</td><td>Intern volume = 0.08 &micro;L/cm</td></tr><tr><td>Byton buis</td><td>Eicom microdialyse</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic luer stab adapter 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Blunt end naald</td></tr><tr><td>Rollerslang</td><td>Eicom microdialyse</td><td>RT-5S</td><td>Intern volume = 4 &micro;L</td></tr><tr><td>Kappenmoer</td><td>Eicom microdialyse</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0,25 mL microcentrifugebuis met dop</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Buizen voor fractiecollector</td></tr><tr><td>Stereotaxische adapter (schachtlengte 8 mm)</td><td>Eicom microdialyse</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Verbindingsnaald</td><td>Eicom microdialyse</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Muis collier</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Boor</td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Schroevendraaier voor botschroeven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische knip</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht cut-off probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In vivo microdialysis is een krachtige techniek voor het verzamelen van ISF van wakker, vrij-gedragen dieren gebaseerd op het beginsel van een dialyse. Terwijl microdialysis een gevestigde methode die relatief kleine molecules, zoals aminozuren of neurotransmitters maatregelen is, is het onlangs gebruikt om te beoordelen ook dynamica van grotere moleculen in ISF sondes met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen. Op het gebruik van dergelijke sondes, moet microdialysis worden uitgevoerd in een push-pull-modus om te voorkomen dat druk opgebouwd binnenkant van de sondes. Dit artikel bevat stapsgewijze protocollen zoals stereotaxic chirurgie en microdialysis lijnen instellen voor het verzamelen van eiwitten van ISF. Tijdens microdialysis, kunnen drugs worden toegediend hetzij systemisch, hetzij door directe infusie in ISF. Omgekeerde microdialysis is een techniek om direct inblazen ISF verbindingen. Integratie van drugs in de microdialysis perfusie buffer hen in staat stelt om te verspreiden in ISF via de sondes terwijl gelijktijdig het verzamelen van ISF. Door het meten van tau-eiwit als voorbeeld, toont de auteur aan hoe haar niveau op stimulerende Neuronale activiteit worden gewijzigd door omgekeerde microdialysis van picrotoxin. Voordelen en beperkingen van microdialysis worden beschreven samen met de uitgebreide toepassing door het combineren van andere methoden in vivo .

Om te stimuleren of remmen Neuronale activiteit in omgekeerde microdialysis11,12,13, picrotoxin, GABAA receptor antagonist of tetrodotoxine, nb+ kanaal blocker zijn gebruikt. Het is aangetoond dat tau release wordt gestimuleerd door toename van neuronale activiteit13,14. Overeenstemming met dit eerdere opmerkingen, w...

In vivo microdialysis heeft ingeschakeld collectie van moleculen aanwezig in de interstitiële vloeistof van de hersenen (ISF) van wakker, vrij-gedragen dieren. Om te analyseren relatief grote moleculen in ISF, het huidige artikel richt zich specifiek op het microdialysis protocol sondes met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen.

In Vivo Microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht Cut-off Probes

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappelijke onderzoekssector over hoe signaal transductie substraat transport en een afval klaring optreden in de hersenen extracellulaire ruimten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de bemonstering en kwantificering van grote extracellulaire moleculen in de Interstitiële Vloeistof of ISF van wakkere vrij bewegende dieren mogelijk maakt. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen, verwijder het haar uit de schedel van een verdoofde muis en gebruik de oorspen en een neusklem om het fix dier veilig op een adapter.Breng zalf aan op de ogen van het dier en plaats de adapter op het stereotaxic-apparaat. Gebruik een scalpel om een huidincisie sagittally over de schedel te maken en bevestig een boor op de manipulator van het stereotaxic frame. Laat de boor zakken totdat het lambda zachtjes raakt en zet de DV-coördinaat van de boor op nul.Verplaats vervolgens de boor naar bregma voor het resetten van de AP- en ML-coördinaten naar nul. Verplaats de boor van bregma naar de verticale coördinaat. Laat de boor naar de schedel zakken en zet de DV-coördinaat weer op nul.Na het herhalen van de procedure voor een derde coördinaat, boor een braamgat zorgvuldig op de doelcoördinaat, gevolgd door een tweede gat aan de contralaterale kant van het pariëtale bot. Steek een botschroef in het tweede gat en plaats het vergrendelingsstuk van een 1,5 milliliter microcentrifugebuisdeksel op de schedel, zodat de braamgaten zich binnen de cirkel bevinden. Plaats vervolgens een geleidekanule op de kortere arm van de stereotaxic-adapter en bevestig de canule met een dopmoer.Stel de langere arm van de stereotaxic adapter op de elektrodeklem en bevestig de arm op de manipulator van het stereotaxic-apparaat. Draai de DV stereotaxic montage op de manipulator arm met 12 graden en beweeg de geleide canule naar de braam gat. Dan, langzaam lager de gids canule 1,2 millimeter in de hersenen.Voeg tandcement toe aan de kroon totdat het metalen deel van de geleidekanule, de botschroef en elke blootgestelde schedel zijn bedekt en bevestigd en laat het cement drogen. Verwijder na 12 tot 20 minuten de stereotaxic-adapter uit de elektrodeklem, verwijder de dopmoer en vervang de stereotaxic-adapter door een dummy-sonde. Dan, refasten de dop moer, laat de muis van de stereotaxic apparaat, en huis de muis alleen in een individuele kooi.Voordat u de microdialyse opzet, vult u een wegwerpspuit van één milliliter met gedestilleerd water en gebruikt u een vitonbuis om de spuit aan te sluiten op de uitlaat van een microdialysesonde. Bedek handmatig de ventilatiegaten en druk de spuitzuiger voorzichtig in om de sonde met water te bezielen. Controleer of er water in de sondeinlaat voorkomt en dat er lekkage is op het oppervlak van het microdialysemembraan.Om de sonde te activeren, dompelt u de sondemembranen gedurende twee seconden onder in 70-100%-ethanol, gevolgd door een tweede gedestilleerde waterinfusie. Bevestig een verbindingsnaald aan één inlaat en één uitlaatlijn en laad een wegwerpspuit van drie milliliter met vers bereide perfusiebuffer. Sluit een spuit uitgerust met een stompe naald aan op het inlaateinde van de slang en gebruik een spuitpomp om de hele slang te vullen met perfusiebuffer.Wanneer de buis vol is, vervang de verbindingsnaald tussen de inlaat- en uitlaatlijnen door de geactiveerde microdialysesonde en de dopmoer en monteer een rolbuis in de uitlaatbuizen op een rolpomp. Start de spuitpomp met 10 microliter per minuut en de rolpomp met 9,5-9,8 microliter per minuut. Plaats nu de halsband rond de hals van de verdoofde geleide canule geïmplanteerd dier en verwijder de dop moer en dummy sonde.Steek de microdialysesonde langzaam door de geleide canule en maak de dopmoer vast. Plaats vervolgens de muis in een kooi die is aangesloten op een vrij bewegend systeem en koppel de muis aan de kraag. Na ten minste een uur, achtereenvolgens stoppen met de rolpomp en de spuitpomp, het opnieuw opstarten van de pompen met de spuit pomp ingesteld op 20% sneller dan de rolpomp en plaats het vrije uiteinde van de uitlaat slang op een gekoelde fractie collector om de hersenen ISF te verzamelen.Wanneer het juiste experimentele volume is verkregen, verwijdert u de sonde en behandelt u het herstel van de muis zoals zojuist is aangetoond. In overeenstemming met eerdere waarnemingen, wanneer 50 micromolar Picrotoxine wordt toegediend via omgekeerde microdialyse zoals aangetoond bij wakkere C57B6J-muizen, wordt een toename van interstitiële endogene tau-niveaus waargenomen in vergelijking met niveaus die worden gemeten bij dieren die met een voertuigcontrole worden behandeld. Naast medicijnadministraties kan microdialyse worden gecombineerd met andere in vivo methoden zoals EEG-opname of optogenetica om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe neuronale activiteit de substraatconcentratie in ISF beïnvloedt.

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De controle van de extracellulaire neurotransmitter niveaus in verschillende gebieden van de hersenen van vrij bewegende dieren biedt inzichten over het verband tussen neurotransmitters en gedrag. In vivo microdialyse gekoppeld met elektrochemische detectie zorgt voor een uitstekende anatomische en chemische resolutie, en informatie over hoe basale neurotransmissie wordt aangepast door farmacologische of fysiologische manipulaties.

Survivable stereotaxische Chirurgie in Knaagdieren

Modulatie van hippocampally-afhankelijke ruimtelijk werkgeheugen door middel van directe intrahippocampale micro-injectie, begeleid en gevolgd...

Insuline en hippocampale Microinjection<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialyse Tijdens ruimtelijk geheugen testen

The video demonstrates the process of using a microdialysis probe to collect extracellular proteins from the interstitial fluid (ISF) of a mouse brain. A microdialysis probe, equipped with a high-molecular-weight cut-off semi-permeable membrane, is inserted into the brain of an anesthetized mouse via an implanted guide cannula. The probe, connected to pumps, allows a physiological buffer to perfuse the brain tissue and mix with the ISF. Proteins in the ISF diffuse across the semi-permeable...

Microdialysis of Interstitial Fluid from a Mouse Brain to Isolate Extracellular Proteins

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Daarom commerciële sondes zijn in grote demand.In dit werk een sonde assemblage wordt in detail uitgelegd om een ​​betrouwbare, concentrische, op maat gemaakte microdialysesonde te bouwen voor minder dan $ 10.

Maatwerk microdialysesonde ontwerp

Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.

Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Het protocol hier biedt een gedetailleerde real-time dynamische bemonstering van extracellulaire vloeistof uit de hippocampus van wakkere ratten met behulp van een microdialysesysteem.

Real-time dynamische verzameling van hippocampale extracellulaire vloeistof van bewuste ratten met behulp van een microdialysesysteem

In vivo zijn intercellulaire communicatie die ten grondslag ligt aan veel aandoeningen van het centrale zenuwstelsel, zoals glioblastoom (GBM), berucht moeilijk te meten en te karakteriseren. Hier beschrijven we procedures van cerebrale open-flow microperfusie (cOFM) die kunnen worden gebruikt om interstitiële vloeistofcomponenten te bemonsteren in een longitudinaal diermodel van GBM.

Gebruik van cerebrale open-flow microperfusie voor de longitudinale verzameling van interstitiële vloeistof in een diermodel van glioblastoom

Extracellulaire opnames van neuronale activiteit met behulp van silicium sondes in de verdoofde rat wordt beschreven. Deze techniek maakt het mogelijk informatie te verkrijgen over verschillende hersengebieden die uit meer dan 100 neuronen tegelijk. Het geeft informatie met enkele cel resolutie over neuronale ensembles dynamiek in meerdere lokale circuits.

Opname Grootschalige Neuronale Ensembles met Silicon Probes in de verdoofde Rat

Leer in vivo microdialyse voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten uit hersenvloeistof bij wakke, vrij bewegende muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neurale signalering en afvalverwijdering.

In Vivo Microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht Cut-off Probes (Video) | JoVE Journal

In Vivo Microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht Cut-off Probes

Meer video's verkennen