Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen
14 juni 2018
Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.
Door het exploiteren van het langetermijnbeeldvormingspotentieel van dit nieuwe popmodel samen met de genetische aanpasbaarheid van Drosophila, kan deze methode ons helpen om sleutelvragen te beantwoorden op het gebied van wondgenezing en aangeboren immuniteit. Het popstadium biedt enkele duidelijke voordelen voor live beeldvorming ten opzichte van meer traditionele Drosophila wondgenezingsmodellen. Popae kunnen bijvoorbeeld over veel langere tijdsperioden worden geïmagerd, meer weefseloppervlak is beschikbaar voor experimentele manipulatie en er zijn meer hemocyten aanwezig in dit stadium.
Bovendien is de efficiëntie van RNAi-gemedieerde geninactivatie aanzienlijk verbeterd tijdens deze popstadia, waardoor veel genen op een weefsel- of tijdspecifieke manier kunnen worden uitgeschakeld. Om de poppencollectie op te zetten, zet je flessen op met 20 maagdelijke vrouwtjes en 20 mannetjes. Verzamel dan 18 uur voor de beeldvormingssessie ten minste 10 nieuw gevormde witte prepupae uit de flesjes.
Gebruik een pincet of een fijne penseel om een pop los te maken van het binnenoppervlak van de fles en breng hem voorzichtig over naar de zijkant van een nieuwe vliegfles. Nadat de poppen zich tot het gewenste tijdstip hebben ontwikkeld, breng je ze over naar een stuk dubbelzijdig plakband dat op een glasplaat is gemonteerd. Verwijder nu onder een heldere velddissectiemicroscoop voorzichtig de poppen uit hun behuizingen.
Plaats de poppen zodat hun ventrale zijden stevig aan het plakband vastzitten. Maak de eerste incisie in het anteriorste gebied van het popparium met behulp van het pincet. Zorg ervoor dat het poppengeval in dit gebied hol is en dat er geen popweefsel aanwezig is, omdat de poppen zijn gekrompen in het geval tijdens de vroege ontwikkeling van de pop.
Scheur vervolgens voorzichtig of snijd het poppengevel open in een anterieure tot posterieure richting met behulp van een pincet of microschaar totdat de pop volledig vrij is van de bruine ondoorzichtige broze behuizing. Wees voorzichtig, deze poppen zijn erg kwetsbaar. Het is nu cruciaal dat het pincet en de microschaar het oppervlak van de pop niet doorboren tijdens deze stap.
Probeer de pop zelf niet aan te raken terwijl je de omringende behuizing verwijdert. Monteer nu de onbeschadigde poppen in een glazen bak met een glasbodem met heptaanlijm. Deponeer eerst een lijn voorbereide heptaanlijm van een aliquot van 10 microliter.
Na vijf seconden drogen, gebruik je een pincet om de gedissekteerde poppen voorzichtig over te brengen naar de lijm. Tijdens het leren, lijn je maximaal vijf poppen uit. Meer kunnen worden voorbereid met opgedane ervaring.
Gebruik een pincet om de poppen te rollen en ze te monteren, zodat de vleugel plat op de glasbodem ligt met het grootste deel van het vleugeloppervlak in direct contact met het glas. Ten slotte, om uitdroging te voorkomen, voeg je een stuk absorberend filterpapier gedrenkt in gedestilleerd water toe aan de zijkant van de bak met glazen bodem. Bedek vervolgens de bak en ga verder met de laser-geïnduceerde wondprocedure.
Breng de gemonteerde poppen over naar een brede veldmicroscoop uitgerust met een afstembaar laserablatiesysteem. Stem de gepulseerde UV-luchtgekoelde stikstofgepompte ablatielaser af op de gewenste golflengte met behulp van de juiste kleurstofcel. Voor optimale wondvorming stelt u de pulsfrequentie in op 40 hertz.
Gebruik nu objectieven van 40 keer of 63 keer en werk met behulp van fel veld om de microscoopinstellingen aan te passen om de poppenvleugel van de eerste pop die gewond moet worden te lokaliseren. Focus op het vlak van het poppenvleugelepitheel dat het dichtst bij de glasdekking ligt. Lijn het te wonden gebied uit met het bekende doelgebied van de ablatielaser.
Gebruik hiervoor het kruishaarmarkering binnen het microscoopoogstuk. Pas vervolgens de laservermogen aan door de energiedichtheidsverminderingsschuifregelaar in de microscoop aan te passen. Gebruik de klikstops om de instelling reproduceerbaar te maken.
Activeer nu de ablatielaser met een snelle klik op de handmatige bediening om een wond te maken. Controleer vervolgens op het verschijnen van de voorbijgaande luchtbel op de ablatiesite, wat normaal is bij wondvorming. Als de wondvorming niet succesvol is, probeer dan de focale vlak te variëren.
Of verhoog geleidelijk het laservermogen met behulp van de verminderingsschuifregelaar totdat de gewenste wondgrootte is bereikt. Na het wondvormen van de poppenvleugelranden, breng je de glazen bak snel over naar een geschikte microscoop voor tijdsverloopbeeldvorming. Open vervolgens de juiste beeldopnamesoftware.
Schakel in de software de juiste lasers in en pas hun vermogen en gain/offset aan om voldoende fluorescerend signaal te krijgen zonder pixelsaturatie. Over het algemeen werkt het laagst mogelijke laservermogen in het bereik van vijf tot 20% het beste om fotobleking te minimaliseren. Focus op de hele poppenvleugel onder lage vergroting of focus op de wond onder hoge vergroting om wondreparatie te onderzoeken.
Om zowel het reparerende epitheel als de rekrutering van inflammatoire cellen vast te leggen, stelt u de microscoop eerst in om een z-stack op te nemen met behulp van de fijne focusaanpassing op het bedieningspaneel. Scan van het gewonde epitheel doorheen tot aan de extracellulaire ruimte eronder met migreerende hemocyten. Stel vervolgens de software in om z-slices door de poppenvleugel elke drie micron of met nog kleinere intervallen op te nemen.
Voor tijdsverloopbeeldvorming neem je z-stacks minstens elke 30 seconden gedurende minimaal een uur op. Wanneer je de foto-omkeerbare sondes gebruikt om selectief een subset van cellen tijdens de beeldvorming foto-om te zetten en te labelen, open je de juiste modules in de beeldvormingssoftware om de foto-omzetting uit te voeren en activeer je de 405 nanometer laser. Selecteer vervolgens de cellen die foto-omgezet moeten worden binnen de FRAP-
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor live-beelden van wondherstel en de ontstekingsreactie in Drosophila-poppen. De methode maakt langdurige beeldvorming en tracking van specifieke celpopulaties mogelijk, waardoor het onderzoek naar wondgenezing en aangeboren immuniteit wordt verbeterd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Drosophila biedt genetische tractabiliteit voor het bestuderen van biologische processen.
- Het popstadium maakt langere beeldvorming mogelijk in vergelijking met traditionele modellen.
- De aanwezigheid van hemocyanen is groter tijdens het popstadium, wat studies naar de immuunrespons vergemakkelijkt.
- RNAi-gemedieerde gen-inactivatie is efficiënter in poppen.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor hoog-resolutie beeldvorming van wondgenezing.
- Om de dynamica van hemocyanenmigratie tijdens wondherstel te onderzoeken.
- Om het begrip van aangeboren immuniteitsmechanismen in Drosophila te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling en voorbereiding van Drosophila-poppen voor beeldvorming.
- Laser-geïnduceerde wonden op poppenvleugels voor real-time observatie.
- Time-lapse beeldvorming om cellulaire reacties na letsel vast te leggen.
- Gebruik van foto-omkeerbare sondes om specifieke celpopulaties te labelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van hemocyanenmigratie naar wondplaatsen.
- Het effectiviteit van het popmodel voor het bestuderen van wondherstel is aangetoond.
- Sleutel-cellulaire dynamica betrokken bij de ontstekingsreactie is geïdentificeerd.
- Een gedetailleerd protocol is gepresenteerd voor toekomstige studies in wondgenezing.
Conclusies
- Het popstadium van Drosophila is voordelig voor live-beeldvormingsstudies.
- Deze methode kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van wondgenezingsprocessen.
- Toekomstig onderzoek kan op dit protocol voortbouwen om verschillende genetische factoren in immuniteit te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution, long-term imaging of inflammatory cell dynamics in a genetically tractable model, supporting mechanistic de-risking in target validation and assay development for innate immunity pathways. By capturing real-time hemocyte migration and wound healing dynamics, it provides quantitative, reproducible data that enhances predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates cross-functional collaboration between discovery biology and computational modeling teams to explore wound attractant signals and cellular behavior relevant to therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking innate immune cell recruitment and behavior in response to tissue damage.
- Operational Value: Supports functional target validation through visualization of hemocyte migration dynamics and response to genetic perturbations via RNAi.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing spatio-temporal data on inflammatory responses that inform target confidence and pathway relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized wound models with quantifiable immune cell recruitment.
- Operational Value: Addresses assay reproducibility through consistent laser-induced wounding and time-lapse imaging protocols across multiple pupae.
- Scalability: Enables preparation of multiple samples within 10 minutes post-mastery, supporting medium-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery observations to preclinical validation by modeling conserved inflammatory processes in a disease-relevant system.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking through detailed analysis of hemocyte trajectories and wound re-epithelialization dynamics.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker exploration via photo-convertible fluorophores like Kaede to track specific immune cell subsets over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions in early-stage programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time observation of innate immune cell dynamics following tissue injury.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized wound generation and quantitative imaging of hemocyte recruitment and clearance.
- Analytics: Generates measurable outputs including migration trajectories, wound closure rates, and photo-conversion kinetics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling immune cell behavior applicable to human wound healing and inflammation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of genetic and pharmacological modifiers of inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in inflammatory cell recruitment and resolution.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through defined pupal preparation, wounding, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking of immunomodulatory targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative assessment of pathway activity and cellular response dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, microsurgery, and confocal microscopy for successful pupal dissection and mounting.
- Dependent on laser ablation systems and tunable UV lasers for precise, reproducible wound induction.
- Necessitates standardization across teams for consistent wound size, imaging intervals, and photo-conversion protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or genetic backgrounds beyond hemocytes and epithelium.
- Includes practical limitations such as pupal fragility post-dissection and dehydration risk, requiring careful handling and environmental controls.
