Name: In Vitro Fokken van Solitaire bijen: een instrument voor de beoordeling van larvale risicofactoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer in vitro foktechnieken voor solitaire bijen om de effecten van fungiciden op larven en hun microbiële symbionten te onderzoeken. Deze methode helpt onderzoekers bijenpopulaties beter te beschermen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Kimball Clark en Tim Krogh voor het verstrekken van Osmia nesten riet, Meredith Nesbitt en Molly Bidwell voor bijstandsverlening in het lab, Drs. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter en drie Anoniem reviewers voor hun nuttige opmerkingen dat het manuscript is verbeterd. Dit werk werd ondersteund door de USDA-Agricultural Research Service toegeëigend fondsen (huidige Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin ministerie van landbouw, handel en de bescherming van de consument (#197199), National Science Foundation (onder Grant nr. DEB-1442148), het DOE grote meren bio-energie Research Center (DOE Office van wetenschap BER DE-FC02-07ER64494).

1. Prepareer propiconazool oplossingen Fungicide blootstelling experimenten
<ol><li>0.1 x fungicide oplossing voor te bereiden door het oplossen van de juiste hoeveelheid commercieel aangeschafte propiconazool 14,3% in steriel water de dag van het experiment. Zorg ervoor dat alleen vers bereide fungicide oplossing wordt gebruikt voor alle behandelingen.</li>
	<li>Voeg 23 µL van 0.1 x fungicide oplossing per gram stuifmeel bepaling te verkrijgen van de maximale concentratie van propiconazool eerder gemeld van bee-verzamelde stuifmeel24 (0.361 PPM of werkzame bestanddeel g-1 van stuifmeel µg).</li>
</ol>2. de oogst van eieren en Host stuifmeel bepalingen van Osmia riet
<ol><li>Met behulp van een gesteriliseerde scalpel, ontleden vers aangesloten nesten van Osmiariet, het splitsen in twee delen langs de lengte van het riet bloot van de afzonderlijke ruimten. Opmerking: Elk nest tussen de 8 tot en met 14 kamers en een enkel ei in een vergaderzaal kan bevatten.</li>
	<li>Inspecteer het riet visueel ter identificatie van de kamers met mannelijke eieren op basis van eerder gepubliceerde richtsnoeren77. Gebruik een gesteriliseerde gebogen naald te verwijderen elke bepaling stuifmeel samen met het bijbehorende ei uit de nesten reed, en in een schone wegen boot.</li>
	<li>Zachtjes scheiden van het ei van de bepaling met behulp van een schone fijne kwast en het verse gewicht van de stuifmeel-bepaling opnemen en ei met behulp van een standaard laboratorium evenwicht. Bereken het gemiddelde gewicht van de mannelijke stuifmeel bepalingen.</li>
	<li>Voer de volgende stappen met minimale vertraging te verminderen de kans op schade aan het ei tegen blootstelling aan bovenmatige temperatuur en uitdroging.</li>
</ol>3. voorbereiding van de Host Plant stuifmeel bepalingen
<ol><li>Inspecteer visueel of het stuifmeel van de maternally verzamelde waardplant opgegraven uit de nesten kamers om ervoor te zorgen dat geen parasieten huidige78 zijn. Teneinde potentiële moeders vooringenomenheid, combineren de stuifmeel-bepalingen tot een enkele massa in een steriele petrischaal en meng goed met behulp van een gesteriliseerde naald.</li>
	<li>Verdeel de gecombineerde massa in nieuwe bepalingen van het stuifmeel, ervoor te zorgen dat het gewicht van elke gereconstitueerde bepaling ongeveer gelijk aan het gemiddelde gewicht van een natuurlijk toegewezen mannelijke bepaling is (bedoel ± SE, 0.35 ± 0,01 g, N = 42). Opmerking: Omdat Osmia sp. kleinere stuifmeel bepalingen aan de mannelijke nakomelingen, dit resulteert in lagere lichaam gewichten van de mannelijke larven vergeleken met die van de vrouwtjes77toegewezen. Om te voorkomen dat een dergelijke bias die voortvloeien uit verschillen van het geslacht wordt bepaald, gebruik alleen mannelijke eieren in de experimenten.</li>
</ol>4. voorbereiding van de niet-waardplant stuifmeel bepaling
<ol><li>Verpulveren commercieel aangeschafte honey bee-verzamelde stuifmeel tot een fijn poeder met behulp van een standaard laboratorium bal-molen.</li>
	<li>Op basis van het vochtgehalte van gastheer maternally verzamelde stuifmeel bepalingen (~ 20%), hydrateren het stuifmeel poeder gebruik van passende volumes 40% gesteriliseerd suiker oplossing79 en meng grondig om te vormen van een deeg-achtige consistentie.</li>
	<li>Verdelen in afzonderlijke stuifmeel massa's, elk met een gewicht van ongeveer hetzelfde als het gemiddelde gewicht van een natuurlijk toegewezen mannelijke bepaling. Opmerking: Vochtgehalte van maternally verzamelde host stuifmeel bepalingen in voorafgaande kunnen worden gestandaardiseerd door het vergelijken van het verse en droge gewicht van stuifmeel bepalingen 30 willekeurig geselecteerde mannelijke chambers €80. Voor het verkrijgen van de droge stof, pollen bepalingen moeten worden gevriesdroogd in een lyophilizer (1.5 Pa gedurende 72 uur).</li>
</ol>5. voorbereiding Multiwell cel cultuur platen
<ol><li>Lijn individuele putjes van steriele 48-well cultuur plaat met gesteriliseerde met autoclaaf tin cups (5 × 9 cm). Met behulp van steriele pincet, zachtjes flair uit de bovenste rand van de capsule zodat het rekening met de bepaling van het stuifmeel houden kan.</li>
	<li>Plaats een enkele massa van host of niet-host stuifmeel bepaling binnen de tin beker met behulp van steriele instrumenten op basis van de behandelde groep. Opmerking: Voorkom kruisbesmetting, gebruiken afzonderlijke platen voor behandeling en controlegroepen.</li>
</ol>6. Voeg fungiciden
<ol><li>Het maken van een centraal geplaatste depressie binnen de stuifmeel massa met behulp van een steriele houten stok. Gebruik een nieuwe stick voor elke bepaling van stuifmeel.</li>
	<li>Juiste hoeveelheid fungicide oplossing (voor behandeling), of steriel water (voor besturingselementen) toevoegen in de depressie. Knijp de opening van de depressie met behulp van steriele pincet te minimaliseren oppervlak contact tussen het fungicide / steriel water en het ei.</li>
	<li>Zorgen dat de faculteit opzet van de proefopzet worden uitgelijnd met die afgebeeld in de schematische weergave (Figuur 4).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> Figuur 4. Schematische weergave van de experimentele opstelling. Het experiment vertegenwoordigt een volledig-crossed 2 × 2 factoriële setups. Factor 1 vertegenwoordigt Fungicide blootstelling en bestaat uit 2 niveaus: (i) geen fungicide (N = 10), en (ii) Fungicide (N = 10). Factor 2 stuifmeel bron vormt en bestaat uit 2 niveaus: (i) ontvangende stuifmeel (N = 8), en (ii) niet-host pollen (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
7. aan de achterkant en observeren van de larven
<ol><li>Plaats een willekeurig geselecteerde mannelijke ei op de bovenkant van de stuifmeel-bepaling met behulp van een schone fijne kwast. Zodra de eieren hebben gelegd op alle bepalingen, vervangt u de deksel van de cel cultuur plaat, vastzetten met het labelen van tape op de hoeken.</li>
	<li>Plaats de platen goed op een schone lade en bedek het met een donker doek te dwarsbomen contact met direct licht. Plaats een 6 goed plaat met 30 mL steriel water binnen de lade om uitdroging te voorkomen. Incubatie dienbladen ongestoord binnen een incubator verlaten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Observeer goed platen dagelijks onder een ontleden Microscoop zonder het verwijderen van het deksel van de goed platen. Ervoor zorgen dat de larven leven door te controleren voor verkeer. Als er geen beweging is gedetecteerd, gooi de tin cup met de dode larven en de resterende stuifmeel-bepaling. Toestaan van alle overlevende larven te ontwikkelen binnen de goed platen ongestoord tot ze de prepupal fase te bereiken.</li>
	<li>De larve van de tin cup verwijderen zodra zij de prepupal fase41 tot. Gebruik een borstel schoon om het even welk te poepen van de zijde cocon. Zorgvuldig gesneden door de zijde cocon met behulp van een Microscoop ontleden en uittreksel van de prepupa met rubber pincet.</li>
	<li>Omgaan met de prepupa voorzichtig om ervoor te zorgen dat de hulpmiddelen niet het zachte lichaam doen doorboren. Record het verse gewicht van de prepupa (prepupal biomassa) en de ontwikkelings tijd van ei naar de prepupal fase (larvale ontwikkelings tijd). Opmerking: Elke dode larve moet onmiddellijk worden weggegooid om te voorkomen dat ongewenste microbiële groei op de cadaver en overgebleven stuifmeel bepaling. Dit vermindert het risico van infectie op de resterende gezonde larven.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Fokken van bijen buiten hun natuurlijke nesten rieten, onder laboratoriumomstandigheden, kan het testen van meerdere hypotheses met betrekking tot larvale fitness. In de mate dat onbekende factoren blijven veroorzaken bijensterfte, lopen het risico-evaluatieonderzoek met behulp van in vitro kunt experimenten identificeren van potentiële bedreigingen en informeren beheerspraktijken voor deze soortenrijke groep wilde bestuivers 12 ,38,<sup clas...

Gezien hun rol als de dominante groep van insecten bestuivers1, vormt het wereldwijde verlies in bijenvolken een bedreiging voor de voedselzekerheid en ecosysteem stabiliteit2,3,4,5,6 ,7. De dalende trends in beide beheerde en wilde bijenvolken zijn toegeschreven aan verschillende gedeelde risicofactoren, met inbegrip van habitatfragmentatie, opkomende parasieten en ziekteverwekkers, verlies van genetische diversiteit, en de introductie van invasieve soorten3 ,4,7,8,9,10,11,12. In het bijzonder is de dramatische toename van het gebruik van pesticiden, (bijvoorbeeld neonicotinoids) rechtstreeks gekoppeld aan schadelijke gevolgen onder bijen13,14,15. Verschillende studies hebben aangetoond dat de synergie tussen neonicotinoids en ergosterol-biosynthese-remmende (EBI) fungiciden tot hoge mortaliteit over meerdere bee soorten16,17,18 leiden kan , 19 , 20 , 21 , 22. niettemin, fungiciden, lange tijd beschouwd als 'bee-veilig', nog steeds worden gespoten op in-bloei gewassen zonder veel controle23. Foerageren bijen zijn gedocumenteerd routinematig terug te brengen stuifmeel ladingen besmet met fungicide residuen24,25,26. De consumptie van dergelijke fungicide-ladenpollen kan leiden tot hoge sterfte onder de larven bijen27,28,29,30, en een suite van subletale effecten onder de volwassen bijen16 , 31 , 32 , 33 , 34. een recente studie suggereert dat fungiciden bijen verliezen door een wijziging van de microbiële Gemeenschap in korf-opgeslagen stuifmeel, waardoor het verstoren van de kritische symbiose tussen bijen en stuifmeel overgedragen microben35kunnen veroorzaken.
Hoewel Solitaire bijen essentieel voor de bestuiving van verschillende planten wild en landbouw36,37,zijn heeft38, deze diverse groep van bestuivers veel minder aandacht gekregen in bestrijdingsmiddelen controle studies. Het nest van een volwassen eenzame vrouw bevat 5-10 verzegelde brood kamers, elk gevuld met een eindige hoeveelheid maternally verzamelde stuifmeel en nectar, en een enkel ei39. Na het uitkomen, de larven zijn afhankelijk van de toegewezen stuifmeel bepaling, en de bijbehorende stuifmeel overgedragen microbiota verkrijgen van voldoende voeding40,41. Wegens hun gebrek aan de voordelen van een sociale levensstijl, Solitaire bijen meer kwetsbaar zijn voor bestrijdingsmiddelen blootstelling42. Bijvoorbeeld, terwijl de tekorten in de sociale bijen na een spray kan worden vergoed aan sommige uit te breiden door werknemers en nieuwe opkomende brood, de dood van een enkele volwassen eenzame vrouw eindigt alle reproductieve activiteit43. Dergelijke verschillen in gevoeligheid wijzen op de noodzaak om op te nemen van uiteenlopende bee taxa in ecotoxicologische onderzoeken om adequate bescherming voor zowel beheerde en wilde bijen. Echter, afgezien van een handvol studies, onderzoek naar de effecten van fungicide blootstelling heeft voornamelijk gericht is op sociale bijen18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.
Solitaire bijen die behoren tot het geslacht Osmia (Figuur 1) zijn opgebruikt wereldwijd als efficiënte bestuivers van verschillende belangrijke vruchten en noten gewassen39,50,51,53, 53. als groepen met andere beheerde pollinator24,54,55,56,,57,58, volwassen Osmia bijen zijn routinematig blootgesteld aan fungiciden gespoten op in-bloei gewassen44. Volwassen vrouwtjes foerageren op onlangs gespoten gewassen kunnen verzamelen en voorraad hun brood kamers met fungicide-beladen stuifmeel, die later het enige dieet voor de ontwikkeling van de larven vormt. De bepalingen van de verontreinigde stuifmeel consumeren kan vervolgens de larven fungicide residuen42worden blootgesteld. Het risico van blootstelling mogelijk hoger onder oligolectic soorten, die slechts op een paar nauw verwante host planten59,60,,61foerageren. De bijen van bepaalde megachilid, bijvoorbeeld, verschijnen bij voorkeur voedergewassen voor het stuifmeel van de Asteraceae van lage kwaliteit, als een middel van vermindering van parasitisme62. Echter, de mate waarop invloed fungiciden larvale fitness onder oligolectic Solitaire bijen heeft niet empirisch gekwantificeerd. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een protocol om te testen van de belangrijkste en interactieve effecten van fungicide blootstelling en pollen bron op de geschiktheid van in vitro gefokt Solitaire bijen. Om te onderzoeken, eieren van O. ribifloris sensu lato (s.l.) kunnen worden verkregen commercieel (tabel of Materials). Deze populatie is ideaal vanwege het belang ervan als een native pollinator, en haar sterke voorliefde voor de nectar-rijke Mahonia aquifolium (Oregon druif) gevonden binnen de regio53,63,64 (Figuur 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> Figuur 1. Een foto met hoge resolutie van een volwassen Osmia ribifloris. Foto krediet Dr. Jim Cane, onderzoek de entomoloog, USDA-ARS <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> Figuur 2. Phragmite nesten van riet van Osmia ribifloris (s.l.) met een geneste vrouw op de voorgrond. Kamer partities en terminal stekkers voor de rieten zijn opgebouwd uit wat bladeren. Foto credit Mr. Kimball Clark, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De eerste doelstelling van deze studie is om te evalueren van het effect van het nuttigen van stuifmeel fungicide-behandeld op larvale fitness (gemeten in termen van ontwikkeltijd en prepupal biomassa). Terwijl blootstelling aan de algemeen toegepaste fungicide propiconazool is gekoppeld aan een verhoogde sterfte onder de volwassen bijen over verschillende soorten 23,24,32,44,45, 54,55,56,,57,58,65,66,,67, het effect ervan op de larvale bijen is minder bekend. De tweede doelstelling van deze studie is om te evalueren van de effecten van de consumptie van niet-host pollen op larvale fitness. Eerdere studies blijkt dat de larven van oligolectic bijen niet ontwikkelen wanneer gedwongen om te consumeren niet-host stuifmeel68. Dergelijke resultaten kunnen worden toegeschreven aan variaties in bee fysiologie69, stuifmeel biochemie70en de gunstige microbiome natuurlijke stuifmeel bepalingen71is gekoppeld. De derde doelstelling van deze studie is om te evalueren van de interactieve effecten van fungicide behandeling en dieet stuifmeel op larvale fitness.
Talrijke biologische eigenschappen met inbegrip van maternale lichaamsgrootte, zijn inrichten van tarief, foerageren strategie en stuifmeel hoeveelheid72,73,74,75 beïnvloeden larvale fitness onder Solitaire bijen bekend. Deze factoren kunnen leiden tot aanzienlijke variabiliteit tussen riet, die een uitdaging bij de ontwikkeling van verdedigbaar experimentele designs bij de beoordeling van larvale gezondheid. Bovendien, gezien het feit dat larvale ontwikkeling binnen verzegelde nesten riet optreedt, de effecten van dergelijke variabiliteit bij het nageslacht zijn moeilijk te visualiseren en gekwantificeerde zonder gebruik te maken van niet-dodelijke technieken (Figuur 3). Om te overwinnen deze uitdaging, zijn alle hypothesen binnen deze studie getest met behulp van larven gefokt buiten hun nesten riet. De proefopzet vertegenwoordigt een volledig gekruiste 2 × 2 factoriële set-ups, met elke factor die bestaat uit 2 verdiepingen; Factor 1: Fungicide blootstelling (Fungicide; Geen fungicide); Factor 2: Stuifmeel bron (gastheer pollen, stuifmeel van de Non-host). Bijen zijn verhoogd van het ei tot de prepupal fase in steriele multiwell cel cultuur platen onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Elk is goed afzonderlijk gevuld met een gestandaardiseerde hoeveelheid stuifmeel bepaling en een enkel ei. Na het uitkomen, de larve voedt zich met het toegewezen stuifmeel binnen de put larvale ontwikkeling voltooit en initieert verpopt. Afgelopen studies hebben aangetoond dat onverklaarbare sterfte lager onder bijen aan de orde gesteld binnen deze omgeving kunstmatig fokken dan die aangetroffen in het wild49,-76is. Het gebruik van in vitro-gefokte bijen heeft diverse voordelen ten opzichte van veld gebaseerde studies: 1) het minimaliseert de storende effecten van natuurlijke variabiliteit en ongecontroleerde factoren meestal gekoppeld veld gebaseerde studies; 2) hierdoor meerdere niveaus van manipulatie voor elke factor(en) van belang zijn voor het gelijktijdig worden beproefd over behandelgroepen; 3) het aantal replicatieonderzoeken kan vooraf bepaald worden, en experimentele factoren voor elk replicatieonderzoek individueel kunnen worden gemanipuleerd; 4) larval reactie variabelen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd en onafhankelijk geregistreerd zonder storende aangrenzende larven; 5) het protocol kan worden gewijzigd voor complexere experimentele designs waarbij meerdere factoren en antwoord variabelen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> Figuur 3. Inhoud binnen een natuurlijke nesten reed van Osmia ribifloris (s.l.). Close up van (A) een ontleed riet met afzonderlijke ruimten, stuifmeel bepalingen, en partities, en (B) vers geoogst stuifmeel bepalingen, en de bijbehorende eieren (aangegeven door een zwart bolletje). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>eieren van O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td></tr><tr><td>Osmia rietjes</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Frisch ingeplugde rietjes</td></tr><tr><td>Dissectieset</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>Steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Langneusnapers</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>6 wel culture plates</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Steriel verzegeld</td></tr><tr><td>48 wel culture plates</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Steriel verzegeld</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>25373100</td><td>Steriel verzegeld</td></tr><tr><td>Vierkante weegboten</td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Kamelhaarbreek</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>Tin capsules</td><td>EA Consumables</td><td>D1021</td><td>Steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazool 14,3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazool 14,3%</td></tr><tr><td>Bijenhoning pollen</td><td>Bee energised</td><td>897098001244</td><td>Onbehandeld, natuurlijk, rauw pollen</td></tr><tr><td>Microbalans</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td>30334913</td><td></td></tr><tr><td>Houten stokjes</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Steriliseer voor gebruik</td></tr><tr><td>Sealing tape</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Plantenbak</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuis</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Microsyringe</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Rubber pincet</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Spuitnaalden</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Vriesdroger</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Statistisch software</td><td>SPSS</td><td>Versie 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro fokken van solitaire bijen: een instrument voor de beoordeling van larvale risicofactoren

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Hoewel Solitaire bijen cruciale bestuiving dienstverlening voor wild en beheerde gewassen, deze soortenrijke groep heeft grotendeels over het hoofd gezien in bestrijdingsmiddelen verordening onderzoeken. Het risico van blootstelling aan residuen fungicide is waarschijnlijk vooral hoog als de spray alleen op of in de buurt van de waardplanten optreedt, terwijl de bijen stuifmeel verzamelen om het inrichten van hun nesten. Voor de soorten van Osmia die consumeren van stuifmeel van een selecte groep van planten (oligolecty), kan de onmogelijkheid tot gebruik van stuifmeel van niet-gastheerplanten hun risicofactor voor fungicide-gerelateerde toxiciteit verhogen. Dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te oligolectic mason bijen, Osmia ribifloris sensu lato, van ei tot prepupal fase in cel cultuur platen onder gestandaardiseerde laboratoriumomstandigheden met succes aan de achterkant. De in vitro-gefokte bijen worden vervolgens gebruikt om te onderzoeken van de effecten van de blootstelling en pollen bron fungicide op bee fitness. Op basis van een 2 × 2 volledig gekruist faculteit ontwerp, bespreekt het experiment de belangrijkste en interactieve effecten van fungicide blootstelling en pollen bron op larvale fitness, gekwantificeerd door prepupal biomassa, larvale ontwikkelings tijd en nabestaanden. Een groot voordeel van deze techniek is dat met behulp van in vitro-gefokte bijen vermindert natuurlijke achtergrond variabiliteit en de gelijktijdige manipulatie van meerdere experimentele parameters. Het beschreven protocol biedt een veelzijdig instrument voor hypotheses testen waarbij de suite van factoren die de gezondheid van de bijen. Voor pogingen tot instandhouding te worden voldaan, met aanzienlijke en blijvende succes, zal dergelijke inzichten in het complexe samenspel van fysiologische en ecologische factoren rijden bee dalingen blijken te zijn kritisch.

Larvale fitness werd gekwantificeerd aan de hand van drie statistieken (i) larval ontwikkelings tijd, (ii) prepupal biomassa en (iii) percentage overlevingspensioen. Een two-way ANOVA werd uitgevoerd met behulp van Fungicide blootstelling (twee niveaus: geen fungicide, Fungicide) en stuifmeel bron (twee niveaus: Host stuifmeel, Non-host stuifmeel) als de onafhankelijke variabelen, en larvale ontwikkelings tijd als de afhankelijke variabele. Het belangrijkste effect voor Fungicide blootste...

Fungicide sprays op tweezaadlobbige planten kunnen Solitaire bijen aan hoge concentraties van stuifmeel overgedragen fungicide residuen blootstellen. Met behulp van laboratorium gebaseerde experimenten waarbij in vitro-gefokte bijen larven, deze studie onderzoekt de interactieve effecten van de consumptie van fungicide-behandelde stuifmeel afkomstig van planten van de host en niet-host.

In Vitro Fokken van Solitaire bijen: een instrument voor de beoordeling van larvale risicofactoren

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Solitair levende bijensoorten vertegenwoordigen de meest diverse groep bijen op de planeet, maar het kan vrij moeilijk zijn om de larven onder zeer gecontroleerde omstandigheden met succes op te kweken. We hebben een methode ontwikkeld voor de in vitro-kweek van solitaire bijensoorten, waardoor we risicofactoren die samenhangen met hun microbiële symbionten kunnen isoleren en meten. Bij bepaalde solitaire bijensoorten die nesten in stengels is het van cruciaal belang dat de kweektechnieken zowel de jonge larven als hun pollen-gedragen microbiële symbionten aanspreken.Hier hebben we de belangrijkste en interactieve effecten van meerdere stressfactoren belicht, waardoor we kunnen onderscheiden of de stressfactoren grotendeels alleen of samenwerken. Molly Bidwell en Prarthana Dharampal, beide uit mijn laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Gebruik een gesteriliseerde scalpel om vers geplaatste Osmia-nestrieten te dissecteren.Splits de rieten in twee delen in de lengte om de individuele kamers bloot te leggen. Nesten bevatten meestal acht tot veertien kamers met één ei per kamer. Identificeer de mannelijke eieren met behulp van de standaardmethode.Alleen mannelijke eieren worden gebruikt in dit experiment vanwege seksevoorkeur in de grootte van de pollenvoorziening. Mannelijke voorzieningen zijn meestal kleiner dan vrouwelijke voorzieningen. Verwijder vervolgens met een gesteriliseerd instrument elke pollenvoorziening samen met het bijbehorende ei en plaats ze in een schone weegschaal.In de weegschaal scheid je voorzichtig het ei van de voorziening. Weeg vervolgens de pollenvoorziening en het ei apart. Werk snel met de Osmia-eieren om hun tijd buiten de pollen te minimaliseren.Voor de bereiding van gastpollenvoorzieningen inspecteer je eerst visueel het door de moeder verzamelde pollen van de gastplant dat uit de nestkamers is gegraven op parasieten. Om eventuele vooringenomenheid van de moeder te verminderen, combineer je vervolgens de pollenvoorzieningen tot een enkele massa en meng ze met behulp van een gesteriliseerde naald. Verdeel vervolgens het gastpollen in nieuwe voorzieningen van standaardmassa.Om niet-gastplant pollenvoorzieningen te bereiden, verpulver je commercieel gekocht honingbijenpollen tot een fijn poeder met behulp van een standaard laboratoriumbotenmolen. Hydrateer vervolgens het pollenpoeder op basis van het vochtgehalte van de gastpollenvoorzieningen met behulp van een gesteriliseerde 40% suikeroplossing. Meng dit tot een deegelijk consistentie.Maak vervolgens niet-gastpollenvoorzieningen die even zwaar zijn als de door de moeder verzamelde voorzieningen. Voor de behandelingsplaat bekleed je afzonderlijke putjes van een 48-putjes kweekplaat met geautoclaveerde blikken bekertjes. Bereid aparte platen voor de behandelings- en controlegroepen.Vervolgens vouw je met behulp van steriele pincetten voorzichtig de bovenrand van de bekertjes uit zodat ze de pollenvoorziening kunnen bevatten. Laad vervolgens afzonderlijke pollenvoorzieningen in de blikken bekertjes. Maak nu in elke pollenmassa een centraal geplaatste depressie met behulp van een steriele houten stok.Gebruik voor elke pollenvoorziening een nieuwe stok. Voeg in de depressie de juiste volumes van behandelingsoplossing toe, zoals fungicide en steriele water voor controles. Na elke toevoeging knijp je de depressie dicht met schone, steriele pincetten.Laad vervolgens elke behandelingsplaatput met een willekeurig geselecteerd mannelijk ei. Plaats het op de pollenvoorziening met behulp van een schone fijne verfkwast. Zodra de eieren zijn geplaatst, bevestig je het deksel op de plaat met behulp van tape op de hoeken.Plaats vervolgens elke voorbereide plaat in een incubator die op kamertemperatuur wordt gehouden. Neem een zes-putjes plaat opgeladen met steriele water op om uitdroging te voorkomen. Laat de platen ongestoord in de incubator staan.Controleer de plaat dagelijks onder een dissectiemicroscoop zonder het deksel te verwijderen. Als de larven levend zijn, zullen ze zich bewegen. Als er geen beweging wordt waargenomen, gooi je het blikken bekertje met de dode larve en de resterende pollenvoorziening weg.Wanneer een larve de prepupale fase bereikt, verwijder je hem uit het blikken bekertje en gebruik je een borstel om het fras van de zijden cocon te verwijderen. Knip vervolgens met behulp van een dissectiemicroscoop voorzichtig door de zijden cocon en haal de prepupa eruit met behulp van gewichtloze pincetten. Behandel de prepupa voorzichtig om schade aan zijn lichaam te voorkomen.Noteer nu de massa van de prepupa en de ontwikkelingstijd van het ei tot de prepupale fase. De larvale fitheid werd gekwantificeerd met behulp van de ontwikkelingstijd van de larve en de biomassa van de prepupa. Er was een significant negatief verband tussen de ontwikkelingstijd van de larve en de biomassa van de prepupa tussen de met fungicide behandelde en onbehandelde groepen.Hoewel er een significant negatief verband was voor larven die op niet-gastpollen werden grootgebracht, werd een dergelijke relatie niet waargenomen voor larven die op gastpollen werden grootgebracht. De pollenbron had een significant hoofdeffect op de bijenfitheid. Wanneer op niet-gastpollen grootgebracht, nam de ontwikkelingstijd van de larve significant toe, terwijl de prepupa-biomassa significant afnam in zowel de met fungicide behandelde als onbehandelde groepen in vergelijking met larven die op gastpollen werden grootgebracht.Fungicide-blootstelling had geen significant hoofdeffect op de fitheid. Er was geen statistisch significant verschil in ontwikkelingstijd en prepupa-biomassa voor behandelingen die op gast- en niet-gastpollen werden grootgebracht, in zowel de met fungicide behandelde als onbehandelde groepen. Er was geen significant interactief effect van fungicide-blootstelling en pollenbron op de ontwikkelingstijd van de larve en prepupa-biomassa.Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je solitair levende bijenlarven met succes onder in vitro-omstandigheden kunt opkweken. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt om bijen onder in vitro-omstandigheden op te kweken vanaf het ei tot de popstadium met minimale mortaliteit door omgaansstress. Bij het gebruik van deze procedure is

in-vitro-rearing-solitary-bees-tool-for-assessing-larval-risk

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Het Proboscis Extension Response (PER) conditioneringsprotocol, ontwikkeld voor de honingbij (Apis mellifera), biedt een ecologisch relevante en gemakkelijk kwantificeerbare manier om verschillende mechanismen van leren bij veel insectensoorten te bestuderen.

Een Proboscis Extension Response Protocol voor het onderzoeken van Behavioral Plasticiteit in Insecten: Toepassing op Basic, Biomedische en Landbouwkundig Onderzoek

Het doel van deze presentatie is in vivo en in vitro technieken voor het opfokken van entomopathogene nematoden aan te tonen. In vivo methoden beschouwen het fokken van deze nematoden met een insect host, terwijl de in-vitro-methoden maken gebruik van rich media-agar.

In vivo en in vitro kweken van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae en Heterorhabditidea)

Hier presenteren we een methode om zowel een individuele honingbij als een bijenkolonie voedsel te geven dat besmet is met pesticiden. De procedure evalueert het effect van pesticiden op individuele honingbijen door in vivo voeding van een basislarvenvoeding en ook op de natuurlijke toestand van de bijenkolonie.

Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level

In dit protocol, worden methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen, en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen, beschreven voor de mier Vollenhovia emeryi. Deze protocollen zijn belangrijk voor experimenten gericht op het begrijpen van de genetische basis van geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen).

Inductie en evaluatie van inteelt kruisen met behulp van de mier, Vollenhovia Emeryi

Hier presenteren we protocollen voor 1) het laboratorium in gevangenschap voortplanting van de federaal bedreigde Miami blauwe vlinder(Cyclargus thomasi bethunebakeri), en 2) de beoordeling van elementaire levensgeschiedenis informatie, zoals onvolwassen ontwikkelingstijd en het aantal larve stadia. Beide methoden kunnen worden aangepast voor gebruik met andere ex situ conserveringsprogramma's.

At-Risk Butterfly Captive propagatie programma's ter verbetering van life history kennis en effectieve Ex Situ Conservation Technieken

Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Dit protocol is ontwikkeld om het begrip te vergroten van hoe agrochemicaliën de reproductie van honingbijen(Apis mellifera)beïnvloeden door methoden vast te stellen om honingbijenkoninginnen en hun werkverzorgers bloot te stellen aan agrochemicaliën in een gecontroleerde, laboratoriumomgeving en zorgvuldig hun relevante reacties te volgen.

Beoordeling van agrochemisch risico voor gepaarde honingbijenkoninginnen

Het huidige protocol legt een methode uit om met pesticiden verontreinigde voorzieningen te voeren aan de larven van de solitaire bijen, Osmia excavata. De procedure onderzoekt de ecotoxiciteit van het bestrijdingsmiddel voor de larven van de solitaire bijen.

Evaluatie van het effect van pesticiden op de larven van de solitaire bijen

Hierin worden twee protocollen beschreven voor het beoordelen van voedselbron- en ovipositievoorkeuren bij larven en vrouwtjes van bromvliegen. Deze bestaan uit vier keuzes met twee factoren die op elkaar inwerken: het type substraat en de temperatuur. De testen maken het mogelijk om de voedselbronvoorkeur van de larven en de voorkeur voor de ovipositieplaats van de vrouwtjes te bepalen.

Onderzoek naar keuzes in de levensgeschiedenis: temperatuur en substraattype gebruiken als op elkaar inwerkende factoren voor voorkeuren van bromvlieglarven en vrouwtjes

We demonstreren een geteste methode voor het veilig omgaan met in het veld verzamelde bijen. Deze methode maakt snelle manipulatie, identificatie, genetische bemonstering en bevestiging van plant-insect-interacties mogelijk via stuifmeel dat tijdens de bemonstering is verzameld. Deze aanpak is gemakkelijk aan te passen en biedt een kosteneffectieve, niet-dodelijke manier om zeldzame insectengroepen te bestuderen.

Een snelle methode om bijen in het veld op te sluiten en veilig te hanteren

Leer in vitro foktechnieken voor solitaire bijen om de effecten van fungiciden op larven en hun microbiële symbionten te onderzoeken. Deze methode helpt onderzoekers bijenpopulaties beter te beschermen.

In Vitro Fokken van Solitaire bijen: een instrument voor de beoordeling van larvale risicofactoren

Meer video's verkennen