Name: Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer de snelle isolatie van mitoribosomen uit HEK293S-cellen via stikstofcavitatie. Deze methode levert hoogwaardige, zuivere ribosomen op voor structurele studies en onderzoek naar mitochondriale eiwitsynthese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Zweedse Foundation voor strategisch onderzoek (toekomst leiders Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Stichting (Fellowship in geneeskunde M44/16), Zweedse Onderzoeksraad (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS op lange termijn Fellowship (nv) , H2020-MSCA-ITN-2016 project 721757 (VS).

Alle zoogdiercellen cultuur werkzaamheden moet worden uitgevoerd binnen een biologische veiligheidskast. Het gebruik van steriel injectiemateriaal als contact met cellen. Nitril handschoenen en een laboratoriumjas dragen en volg goede weefselkweek praktijk.
1. de celkweek
<ol><li>HEK293S ophanging cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% tetracycline-vrije foetale runderserum (FBS), 5 μg/mL blasticidin en 200 μg/mL azithromycine, bij 37 ° C en 5% CO2handhaven.</li>
	<li>Schalen tot 9 x T175 kolven. Bij 90% confluentie, oogst cellen en draai ze naar beneden bij 500 x g gedurende 5 min. resuspendeer de Ingehuld cellen in Freestyl aangevuld met 5% FBS tetracycline-vrij. Cellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter tellen en cel concentratie aan 1.5 x 106 cellen/mL in een geventileerde schudden kolf aan te passen. Opmerking: Dit komt meestal overeen met een startende volume van 300 mL in een geventileerde maatkolf van 1000 mL.</li>
	<li>Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37 ° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).</li>
	<li>Na 2 dagen de cellen tellen en overgaan tot de cellen splitsen als de celdichtheid 3.0 x 106 cellen/mL bedraagt. De cellen splitsen door het draaien van de cultuur van de cel van 2 x 150 mL in 2 x 250 mL conische flessen bij 500 g gedurende 5 min. resuspendeer cellen in 2 x 10 mL verse media en overbrengen naar een 2 x 1, 000 mL ontlucht kolven met het juiste volume voor een definitieve celdichtheid van 1.5 x 106 cellen/mL, bijvoorbeeld 2 x 300 mL van een startende celdichtheid van 3.0 x 106 cellen/mL.</li>
	<li>Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37 ° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).</li>
	<li>Na twee dagen de cellen tellen en overgaan tot de cellen splitsen als de celdichtheid 3.0 x 106 cellen/mL bedraagt. Split de cellen door spinnen beneden 4 x 150 mL celcultuur in 4 x 250 mL conische flessen bij 500 g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 2 x 10 mL verse media en overbrengen naar 2 x 2.000 mL ontlucht kolf met het juiste volume voor een definitieve celdichtheid van 1.5 x 106 cellen/mL, bijvoorbeeld 2 x 700 mL van een startende celdichtheid van 3.0 x 106 cellen/mL.</li>
	<li>Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37 ° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).</li>
	<li>Na twee dagen de cellen tellen en overgaan tot de cellen splitsen als de celdichtheid 3.0 x 106 cellen/mL bedraagt. De cellen splitsen door het gieten van de 2 x 700 mL ontlucht celcultuur in 2 x 2800 mL kolven en bijvullen met 2 x 300 mL verse media te bereiken van een volume van 2 x 1 L.</li>
	<li>Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).</li>
	<li>Na 24 h cellen tellen en oogsten van de cellen als de celdichtheid 3.0-4.0 x 106 cellen/mL bedraagt.</li>
</ol>2. de mitochondriën isolatie
<ol><li>Buffers vereist Opmerking: De hoeveelheden worden gegeven voor een bereiding op basis van 2 L cellen. De onderstaande voorraadoplossingen tevoren voor mitochondriale isolatie buffer (MIB), sacharose/mannitol buffer (SM4), experimentele buffer (MIBSM), resuspensie buffer (SEM) voor te bereiden.<ol>
<li>Make 0.5L MIB buffer: 50mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteaseinhibitors.</li>
		<li>100 mL SM4 buffer maken: 840 mM mannitol, sacharose 280 mM, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteaseinhibitors.</li>
		<li>Make 160 mL MIBSM buffer: 120 mL MIB buffer + 40 mL SM4 buffer.</li>
		<li>Opslaan van 200 mL PBS bij 4 ° C.</li>
		<li>Maken van 5 mL SEM buffer: 250 mM sacharose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA.</li>
		<li>Maken van stamoplossingen van de 4 x 10 mL voor het verloop van de stapsgewijze sacharose met 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA en 60% / 32% /23% en 15% sucrose, respectievelijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitochondriën isolatie Opmerking: Het is belangrijk dat het werk snel en houd alles op ijs tijdens de gehele procedure.</li>
	<li>Precool de stikstof cavitatie kamer vóór gebruik.<ol>
<li>2 x 1 L cellen (3-4 x 109 cellen per centrifugebuis) oogsten door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 7 minuten, 4 ° C.</li>
		<li>Decanteren zorgvuldig het supernatant en resuspendeer de Ingehuld cellen snel in 2 x 100 mL PBS. Het zwembad van de cellen.</li>
		<li>Centrifugeer de geresuspendeerde cellen bij 1.200 x g gedurende 10 min, 4 ° C.</li>
		<li>Giet het supernatant zorgvuldig en weegt de pellet (~ 20 g).</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 120 mL MIB buffer.</li>
		<li>Toestaan dat cellen om te zwellen door zachtjes roeren in een koude kamer voor 10 min.</li>
		<li>Plaats de stikstof cavitatie zaal op het ijs en de swelled cellen overbrengen in de stikstof cavitatie kamer. Toevoegen van 45 mL SM4 buffer (1/3 van het uiteindelijke volume van de geresuspendeerde cellen, ongeveer 140 mL, opbrengst een eindconcentratie van 70 mM sucrose en 210 mM mannitol).</li>
		<li>Zet vast de stikstof cavitatie kamer en vullen met stikstof tot de druk 500 psi bereikt. Sluit kranen en houden geïsoleerd op het ijs gedurende 20 minuten.</li>
		<li>Langzaam de druk in de stikstof cavitatie zaal vrij en verzamelen de lysate (ongeveer 185 mL).</li>
		<li>Centrifugeer het lysed materiaal om te verwijderen van het puin van de cel en de kernen bij 800 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof verzamelen door het door de kaasdoek gieten in een bekerglas van gehouden op ijs. Gooi niet de pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 90 mL MIBSM buffer (1/2 de vorige volume). Meng met behulp van Teflon/glas Dounce homogenizer en herhaal het centrifugeren bij 800 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof verzamelen door het door de kaasdoek gieten in een bekerglas van gehouden op ijs. Combineer deze supernatant met het supernatant uit stap 2.2.11.</li>
		<li>Centrifugeer het gecombineerde supernatant bij 1.000 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof verzamelen door het door de kaasdoek gieten in een bekerglas van gehouden op ijs.</li>
		<li>Negeren van de pellet en Centrifugeer het supernatant met ruwe mitochondriën bij 10.000 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C. Opmerking: De pellet zal doorgaans bestaan uit twee delen: losse en strak.</li>
		<li>Zorgvuldig wassen de losse pellet zonder verstoring van de strakke gedeelte. Resuspendeer de strakke pellet in 10 mL MIBSM buffer.</li>
		<li>Het uitvoeren van een eiwit concentratie assay met een commerciële eiwit Assay Kit of soortgelijke methode. De opbrengsten van de typische concentratie van 2 L beginnen cultuur zijn ~ 2 mg/mL.</li>
		<li>Voeg 200 eenheden van RNase vrije DNase en laten draaien op een roller in de koude kamer voor 20 min te mengen gelijkmatig de DNase voor verwijdering van de genomic DNA.</li>
		<li>Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C en resuspendeer de pellet in 2 mL SEM buffer. Meng zachtjes met een klein Teflon/glas Dounce homogenizer resuspendeer de resterende aggregaten. Voer niet meer dan vijf en neergaande passen om te voorkomen dat de breuk. Houd op ijs.</li>
		<li>Bereid het verloop van de sucrose in 14 mL SW40 buizen door zorgvuldig pipetteren 1,5 mL voor 60% sacharose voorraad buffer in de onderkant van de buis. Voeg voorzichtig 4.5 mL van de 32% sacharose voorraad buffer op de top van de fluctuatiemarge van 60% zonder verstoring van het. Herhaal met 1,5 mL 23% sacharose voorraad buffer en opnieuw met 1,5 mL 15 gewichtspercenten sacharose voorraad buffer.</li>
		<li>Laden van de hele mitochondriale schorsing (ongeveer 3 mL) op de top van het verloop van sacharose.</li>
		<li>Centrifugeer in SW40 rotor op 139, 065 x g voor 60 min.</li>
		<li>Zorgvuldig verzamelen de bruine band migreren naar de interface van 32% en 60% sacharose met behulp van een pipet van de overdracht, meestal 2-3 mL.</li>
		<li>Module-freeze de gezuiverde mitochondriën in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Mitoribosome voorbereiding
<ol><li>Buffers vereist Opmerking: De onderstaande voorraadoplossingen tevoren voor de lysis-buffermengsel, sacharose kussen/verloop en resuspensie buffer te bereiden.<ol>
<li>10 mL lysis-buffermengsel maken: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, 2% polyethyleenglycol octylphenyl ether, 2 mM DTT, proteaseinhibitors.</li>
		<li>10 mL sacharose kussen buffer maken: 1 M sacharose (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% polyethyleenglycol octylphenyl ether, 2 mM DTT.</li>
		<li>Maken van 5 mL resuspensie buffer: 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT</li>
		<li>Maak 15% - 30% lineaire sacharose verlopen met resuspensie buffer in TLS-55 polycarbonaat buizen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitoribosome reiniging<ol>
<li>Ontdooi bevroren mitochondria op ijs.</li>
		<li>2 delen van de lysis-buffermengsel toevoegen,bijvoorbeeld het toevoegen van 6 mL lysis-buffermengsel aan 3 mL mitochondriën. Meng onmiddellijk door het omkeren van de buis meerdere malen.</li>
		<li>Meng met een kleine Teflon/glas dounce homogenizer om te helpen de lysis en incubeer gedurende 5-10 min op ijs aan het voltooien van de lysis.</li>
		<li>Centrifugeer het lysed materiaal (ongeveer 9 mL) bij 30.000 x g gedurende 20 min, 4 ° C tot het verwijderen van de onoplosbare materiaal. Giet het supernatant zorgvuldig uit de pellet en gooi de pellet.</li>
		<li>Herhaal het centrifugeren op 30.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C om verduidelijking van de bovendrijvende substantie. Giet het supernatant zorgvuldig uit de pellet en gooi de pellet.</li>
		<li>Het kussen van de sucrose in TLA 120,2 buizen (ultra-heldere) bereiden: 0.4 mL-kussen van de sacharose per buis. Één tube per mL lysed materiaal voor te bereiden.</li>
		<li>Lysed mitochondriën op de kussens van sacharose laag: ongeveer 1 mL per buis, resulterend in een lysate: kussen ratio van 2.5:1.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 231, 550 x g gedurende 45 min. in TLA120.2 rotor bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en spoel de buizen opeenvolgend met 100 µl van de resuspensie buffer te verwijderen van de resterende sacharose.</li>
		<li>Resuspendeer de pellets in totaal 100 µl resuspensie buffer.</li>
		<li>Vortex op lage snelheid voor 30 s tot ontbinding van de resterende aggregaten samen en centrifugeer bij 17,949 x g gedurende 10 minuten in microtube centrifuge bij 4 ° C.</li>
		<li>Zorgvuldig verzamelen van het supernatant en herhaal het centrifugeren.</li>
		<li>Meten mitoribosome absorptie bij A260. Opmerking: De typische opbrengst is 7 A260, met A260: A280 verhouding van 1.3.</li>
		<li>Het laden van het gehele monster op een enkele lineaire sacharose kleurovergang buis. Centrifugeer in TLS-55 rotor op 213, 626 x g gedurende 120 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Fractionate het verloop, de optische dichtheid bij A260 te bepalen en de breuk die overeenkomt met de piek van nucleïnezuur samen bundelen. Opmerking: De typische A260: A280 verhouding van de piek is > 1.6.</li>
		<li>De buffer zonodig met behulp van een methode van keuze uit te wisselen. De eindconcentratie berekenen met behulp van de conversie 1 A260 = 0,1 mg/mL.</li>
		<li>Module bevriezen het gezuiverde mitoribosome monster in de resuspensie buffer en winkel bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ott, M., Amunts, A., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+mitochondrial+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis.</a> Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).</li>
<li>Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+human+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the human mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6230), 95-98 (2015).</li>
<li>Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+structure+of+the+55S+mammalian+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6232), 303-308 (2015).</li>
<li>Greber, B. J., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial ribosome.</a> Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).</li>
<li>Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+large+subunit+of+the+mammalian+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome.</a> Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).</li>
<li>Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+ribosomes+can+switch+their+structural+RNA+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338(2016).</li>
<li>Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+ribosomes+can+switch+structural+tRNAs-but+when+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why?</a> RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).</li>
<li>Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Genome+Engineering%3A+The+Revolution+May+Not+Be+CRISPR-Ized%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized.</a> Trends in Genetics. , (2017).</li>
<li>Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+mitochondrial+ribosome+in+native+states+of+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866(2017).</li>
<li>Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin%3A+high-level+expression+of+rhodopsin+with+restricted+and+homogenous+N-glycosylation+by+tetracycline-inducible+N-acetylglucosaminyltransferase+I-negative+HEK293S+stable+mammalian+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).</li>
<li>Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+large+ribosomal+subunit+from+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria.</a> Science. 346 (6210), 718-722 (2014).</li>
<li>O'Brien, T. W., Kalf, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+from+rat+liver+mitochondria+I.+Isolation+procedure+and+contamination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).</li>
<li>Spremulli, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+mitochondrial+ribosomes+from+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondria%3A+Practical+Protocols%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues.</a> Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).</li>
<li>Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRice%2C+JE+%22Subcellular+Fractionation%3A+A+Practical+Approach%22">Subcellular Fractionation: A Practical Approach</a>. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).</li>
<li>Attardi, G., Ching, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+mitochondrial+proteins+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells.</a> Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Adachi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cavitation+for+cell+disruption+to+obtain+mitochondria+from+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells.</a> Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).</li>
<li>Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+fatty+acids+and+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+by+isolated+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).</li>
<li>Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li>
<li>Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+and+cancer+metabolism+in+the+tumor+microenvironment%3A+markers%2C+models%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).</li>
<li>Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+translation+as+a+therapeutic+strategy+for+human+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).</li>
<li>Boczonadi, V., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+impaired+mitochondrial+translation+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).</li>
</ol>

Met betrekking tot de bron van de grondstof, hoewel de relatief gemakkelijke beschikbaarheid van dierlijke weefsels die bekend is dat ze een rijke bron van mitochondriën, maakt het een populaire keuze voor mitoribosomes3,5,12, 13, ze genetisch niet kunnen worden bewerkt en weergegeven in het lab gemakkelijk. Vandaar, is er een duidelijke praktische noodzaak voor het ontwikkelen van protocollen waarbij homogeen gekweekte menselijke cellijnen. Het grote verschil tussen de protocollen omgaan met weefsels en gekweekte cellen is de wijze van lysis en homogenisering. Voor gekweekte cellen gegroeid als een enkelgelaagde, is een typische methode Teflon/glas dounce homogenisering14. De oorspronkelijke voorbereiding protocollen terwijl efficiënte werden ontwikkeld voor kleine schalen15. Een directe schaalvergroting dienst van een homogenizer met een capaciteit van 500 mL is mogelijk11, echter het vereist ~ 2 h van handenarbeid tot lysis van de 80%. Dit leidt op zijn minst drie kwesties: samenvoeging van organellen als gevolg van de lange wachttijden, niet-homogene lysis als gevolg van zware materiaal zinken naar de bodem van een groot schip, Verwarming van het monster als gevolg van de noodzaak van meerdere streken. Een beter methode van lysis van de maakt daarom gebruik van stikstof cavitatie, die is gebaseerd op decompressie van een hydrofoor vaartuig16,17. Bij deze methode worden cellen eerst gepofte op de koude kamer om te verzachten van de cellen en hen vatbaarder voor lysis. Als ze zijn geplaatst in het stikstof cavitatie apparaat een buffer met sacharose en mannitol wordt toegevoegd teneinde een osmotische druk, die zal helpen mitochondriën intact te houden. De stikstof cavitatie apparaat is dan onder druk met een groot volume van zuurstofvrije stikstof, die in de cellen oplost. Als het druk vrijgegeven stikstof bubbels uit oplossing wat resulteert is in het bezwijken van de celmembranen. Deze methode biedt diverse voordelen ten opzichte van mechanische homogenisator methoden waarbij schuifspanningen en wrijving als volgt: 1) elke externe fysieke spanning op de cellen wordt vermeden; 2) een adiabatische expansie dat koelt het monster, garandeert geen warmte schade aan organellen; 3) celbestanddelen worden beschermd tegen oxidatie door het inerte stikstofgas; 4) geen wijziging van de pH van het opschorten medium; 5) het proces is uniform en reproduceerbare omdat dezelfde ontwrichtende krachten worden toegepast binnen elke cel en de rest van het monster; 6) het proces is snel en binnen 20-30 min kan worden voltooid.
Isolatie van de mitochondriën van gekweekte cellen en weefsels is beschreven in de literatuur uitgebreid, en het is gebaseerd op een verstoring van de zachte cel gevolgd door een reeks van differentiële centrifugations. De meeste van de momenteel gebruikte protocollen volgen de oorspronkelijke procedures ontwikkeld in het midden van de vorige eeuw18. Terwijl de biochemische basisoplossingen kloppen, zijn er verschillende misvattingen die zijn gemarkeerd in de literatuur en onopgemerkt bleef. Voor het optimaliseren van het protocol voor mitoribosomes, wij systematisch onderzocht de gerapporteerde algemene beginselen en concluderen dat: 1) opname van Mg2 + - en K+ in de buffer is niet cruciaal. Het heeft betoogd dat de KCl helpt om te voorkomen dat cytoplasmatische eiwitten vormen een gel19, echter een voldoende verdunning zoals beschreven in ons protocol, verstrekt dit fenomeen doet zich niet voor. Bovendien, uitsluiting van Mg2 + is nuttig om verontreinigingen door cytoplasmatische ribosomen20; 2) er is niet nodig om te houden van maximale mogelijke volumeverhouding van cellen naar medium ter bescherming van de vrijgegeven organellen van de hypo-osmotische milieu. De osmotische in ons protocol wordt voldoende ondersteund in sacharose-bevattende buffers, als met de verdunning van cellen met mitochondriën isolatie buffer (2.II.5 stap) is essentieel voor de efficiënte scheiding van organellen in een grootschalige preparaat.
De pH van mitochondriën isolatie buffer is dicht bij fysiologische waarden, d.w.z. 7.5, ook de optimale pH voor de volgende mitoribosome voorbereiding. Bindmiddelen EDTA en de EGTA worden toegevoegd aan de isolatie media chelaat contaminerende ionen, en ze chelaat gratis magnesium en calcium, respectievelijk. Het is al besproken dat opneming van EDTA kan leiden tot de beschadiging van het innerlijke mitochondriale membraan14, dus de concentratie is beperkt tot 1 mM als een voorzorgsmaatregel. We hebben geen verschil niet waargenomen bij het gebruik van 5 mM EDTA in de definitieve zuivering van sacharose dichtheid verloop.
Het protocol beschreven gebruikt hierin HEK293S-afgeleide menselijke cellen voor zuivering van de mitoribosome. De kwaliteit van de voorbereiding kan het verkregen monster biochemically en structureel atomaire resolutie worden onderzocht. Hierdoor kan men de methode toepassen op menselijke mitoribosomal vertalen complexen, kwaliteitscontrole assemblages en mitoribosomal subeenheden tussenproducten. Bovendien, omdat kankercellen hebben versterkte OXPHOS capaciteit en verhoogde mitochondrial eiwit vertaling in vergelijking met aangrenzende stromale weefsel21, mitoribosomes zijn gevestigde drug doelen voor kanker22. Daarom, met behulp van dit protocol voor specifieke zuivering van mitoribosomes in aanwezigheid van remmers moeten medische toepassingen. Mitoribosomal mutaties zijn ook gekoppeld aan erfelijke mitochondriale ziekten23. Aangezien deze mutaties directe gevolgen voor de structuur hebben, zal de hier gepresenteerde benadering nuttig zijn voor hun structurele karakterisering. Het protocol kan experimenteel worden uitgebreid en toegepast op een aantal wetenschappelijke vragen het fundamentele begrip van vertaling in menselijke mitochondriën en het medisch belang ervan aan te pakken.

Het proces van mitochondriale eiwitsynthese is gebaseerd op 13 essentiële mt-mRNAs die zijn vertaald door een gespecialiseerde membraan-ingeschreven mitoribosome om te vormen van de katalytische kern van de respiratoire keten. Het gewijzigde mitochondriaal genoom en de noodzaak voor de eiwitten in het membraan co-translationally invoegen hebben aanzienlijk de architectuur van de mitochondriale ribosomen1gevormd. Recente hoge resolutie structuren van de zoogdieren mitoribosome toonde een opvallend verschillende uiterlijk naar de bacteriële tegenhanger2,3. In het bijzonder worden ten minste 36 mitochondriën-specifieke eiwitten toegevoegd, bij te dragen ~ 1 MDa extra moleculaire massa, terwijl mt-rRNA is verminderd door tweeledig en sterk afweek. De structurele herschikkingen veranderen bijna alle kritische functies die eerder in het algemeen aanvaard om universeel geconserveerd4.
Nieuwe hoofdelementen zijn verkregen door elk van de subeenheden van mitoribosomal, bijvoorbeeld, de kleine subeenheid een intrinsieke GTPase eiwit mS29 heeft opgenomen in haar regio 'hoofd'. GTPase activiteit is niet gevonden in andere vertaalsystemen en de structuur geeft aan dat de GTPase een rol in de subeenheid vergadering2 wellicht. De 5S rRNA die werd verondersteld te zijn een bezienswaardigheid van alle bekende ribosomal grote subeenheden, vormen de kern van de centrale uitsteeksel, ontbreekt in de zoogdieren mitoribosome en heeft aangenomen mt-tRNA-Val als een integraal bouwsteen in plaats daarvan2. Verbod en collega's toonde aan dat de varkens mitoribosome mt-tRNA-Phe heeft en niet-Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk en collega's over deze gegevens opgevolgd en gevonden dat mitoribosomes van patiënten met gecompromitteerde mt-tRNA-Val stabiliteit is in principe geschikt voor mt-tRNA-Phe6,7. Waarom de mitoribosomes hebben opgenomen deze specifieke elementen en welke trajecten en trans-factoren zijn vereist voor deze unieke assemblages onbekend blijven.
Over het geheel genomen de hoge complexiteit van de menselijke mitoribosome, nieuwe proteïne componenten en de unieke vereniging van de mt-tRNA als een constructiedeel impliceert de betrokkenheid van als-nog-unknown mitochondriën-specifieke trans -factoren. Echter, omdat veel van de functies van dit systeem uniek voor de mitochondriën, die van oudsher moeilijk zijn te onderzoeken8, is weinig bekend over de moleculaire en kwaliteitscontrole mechanisme. Met de ontwikkeling van hoge-resolutie één deeltje analyse door elektron cryo-microscopie (cryo-EM)20, nu ontstaan kansen om te uitvoerig bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vergadering, de actie en de kwaliteitscontrole van de mens mitoribosome. Ons verslag van de eerste structuur van de menselijke mitoribosome vergadering tussenliggende biedt de erkenning dat het mogelijk is om te visualiseren hoe de menselijke mitoribosome wordt gevormd en toont dat cryo-EM is behulpzaam bij de identificatie van nieuwe trans- waarnemend vergadering factoren9.
Uit te breiden op deze eerste poging, beschrijven we een snelle protocol voor de zuivering van het menselijke mitoribosome in detail. In het eerste deel van het protocol, wordt een grootschalige isolatie zeer zuivere intacte mitochondria uit schorsing cellen beschreven. Deze procedure kan vereist 9u en gemakkelijk gewijzigd en aangepast aan de verschillende soorten cellen en schalen. Een belangrijke stap in dit protocol is het gebruik van stikstof cavitatie open te breken de cellen. Het tweede deel van het protocol werd ontwikkeld om te zuiveren van mitoribosomes. Deze procedure vereist 7 h en levert van een voldoende hoeveelheid mitoribosomes voor biochemische en structurele studies. Gebruik van zuivere mitochondriën en een grondstof biedt kwalitatief hoogwaardige laatste voorbereidingen kan worden geëxtrapoleerd naar andere mitochondriale macromoleculen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin selection reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25001</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Freestyle 293 Expression medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>12338026</td><td></td></tr><tr><td>T175 tissue culture flask with vented cap</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.002</td><td></td></tr><tr><td>Shaker flasks with vented cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td><td></td></tr><tr><td>250 ml conical bottle tubes, sterile</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Eve automated cell counter</td><td>NanoEnTek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen cavitation cell disruption vessel</td><td>Parr Instruments</td><td>4635, 4639</td><td>safety volume: 40ml, 600ml respectievelijk</td></tr><tr><td>Dnase (RNA-free)</td><td>HT Biotechnology</td><td>N401a</td><td></td></tr><tr><td>Teflon/glass dounce homogenizers</td><td>Cambridge Glassblowing Limited</td><td></td><td>Maat ontworpen op aanvraag</td></tr><tr><td>SW40 tubes for mitochondria gradient</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td>Polypropylene, dunne wand</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.2 tubes for cushion</td><td>Beckman</td><td>343778</td><td>Polycarbonaat, dikke wand</td></tr><tr><td>TLS-55 tubes for gradient</td><td>Beckman</td><td>347356</td><td>Ultra-clear</td></tr><tr><td>Gradient Station IP</td><td>BioComp</td><td>153-002</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle isolatie van de mitoribosome van hek cellen

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

De menselijke mitochondriën bezitten een specifieke set van ribosomen (mitoribosomes), die 13 essentiële proteïne componenten van de complexen van de oxidatieve fosforylatie gecodeerd door het mitochondriaal genoom te vertalen. Aangezien alle eiwitten gesynthetiseerd door menselijke mitoribosomes integraal membraaneiwitten, zijn menselijke mitoribosomes vastgebonden aan de mitochondriale binnenste membraan tijdens de vertaling. Vergeleken met het cytosolische ribosoom heeft de mitoribosome een coëfficiënt van sedimentatie van 55-plussers, halve de rRNA inhoud, geen 5S rRNA en 36 extra eiwitten. Zorg daarom voor een hogere eiwit-naar-RNA-ratio en een atypische structuur de menselijke mitoribosome aanzienlijk verschillend van zijn cytosolische tegenhanger.
Ondanks het cruciale belang van de mitoribosome tot leven waren geen protocollen beschikbaar voor het zuiveren van het intact complex van menselijke cellijnen. Traditioneel mitoribosomes werden geïsoleerd uit de mitochondriën-rijke dierlijke weefsels die kilogram vereist van de grondstof. We gemotiveerd dat mitochondriën in het verdelen van de HEK293-afgeleide menselijke cellen gekweekt in voedselrijke expressie medium zou een actieve mitochondriale vertaling, en daarom zou een geschikte bron van materiaal voor de structurele en biochemische studies van de mitoribosome. Om te onderzoeken zijn structuur, ontwikkelden we een protocol voor grootschalige reiniging van intacte mitoribosomes van HEK cellen. Hierin voeren wij stikstof cavitatie methode als een snellere, minder arbeidsintensief en efficiënter alternatief voor traditionele mechanische schuintrekken gebaseerde methoden voor lysis van de cel. Dit resulteerde in de voorbereidingen van het mitoribosome dat is toegestaan voor structurele vastbesloten te zijn op hoge resolutie, waaruit de samenstelling van de intact menselijke mitoribosome en haar vergadering tussenproducten. Hier, we follow-up van deze werkzaamheden en presenteren een geoptimaliseerde en meer kosteneffectieve methode waarbij alleen ~ 1010 gekweekte cellen van het HEK. De methode kan worden gebruikt voor het zuiveren van menselijke mitoribosomal vertalen complexen, mutanten, kwaliteitscontrole assemblages en mitoribosomal subeenheden tussenproducten. De zuivering kan worden lineair opgeschaald vertienvoudigd als nodig, en ook op andere typen cellen toegepast.

Verdelen en zeer levensvatbare cellen is een essentieel vertrekpunt voor zuivering van actieve mitoribosomes. Dit protocol is van toepassing op alle HEK293 schorsing cellen. We zijn met behulp van in-house cellijn T501, die stabiel is het uiten van een transporter onder tetracycline-afleidbare controle. De ouderlijke cellijn is10cellen (Tabel of Materials) HEK293S-GnTI- . Tijdens de celgroei en uitbreiding in het FreeStyle 293 expressie Medium de minimale dichtheid dient te worden bewaard bij 1.5 x 106 cellen/mL, teneinde een verdubbeling tarief van elk twee dagen, terwijl de maximale celdichtheid mag niet meer dan ~ 5 x 106 cel / mL. bij het bereiken van een celdichtheid boven 3 x 106 cellen/mL zijn de cellen Ingehuld en geresuspendeerde in een frisse, voorverwarmde media in een uitgebreide volume om de dichtheid van de minimumgrootte voor een cel van 1.5 x 106 cellen/mL. Deze splitsing wordt uitgevoerd herhaaldelijk om 2-3 dagen tot een gewenste cel massa onder de regeling wordt bereikt. De celdichtheid van de laatste in het bereik van 3-4,5 x 106 cellen/mL kan variëren, en ten minste 2 liter is vereist als uitgangspunt voor de isolatie van de mitochondriën. De levensvatbaarheid van de cellen in het algemeen moet worden gehandhaafd > 90%, en voor de definitieve cultuur die wordt geoogst > 95%. Behandeling van de grootschalige celcultuur met antibiotica wordt niet aanbevolen.
Na de reeks van differentiële centrifugations, het volume van de mitochondriale schorsing na stap 2.2.20 is meestal in het bereik van 3-5 mL. De mitochondriën zijn dan van andere organellen gescheiden op de helling van sacharose (Figuur 1). Het verloop van de stapsgewijze sacharose bereid is zodanig dat het volume van het verloop en het volume van de mitochondriale schorsing samen opwaarts naar de centrifugeren buis tot zijn maximale volume vullen. Hier speciale aandacht nodig is voor het verzamelen van de bruine band migreren naar de 60% / 32% interface met minimale besmetting uit de omliggende buffer. Dit is belangrijk om te houden van constant eiwit: wasmiddel verhouding in de volgende stap van de solubilisatie van de mitochondriën. Het wordt geadviseerd om te beoordelen van de mitochondriale eiwitconcentratie in dit stadium, en een typische rendement van 15-20 mg totale mitochondriale eiwit verwachting uit ~ 1010 gekweekte HEK cellen.
Na succesvolle mitochondriën isolatie, ze zijn lysed door toevoeging van polyethyleenglycol octylphenyl ether, en mitoribosomes worden gescheiden door een kussen van sacharose (Figuur 2). Als u wilt scheiden mitoribosomes uit de hydrofobe membraanachtig stof, pellets zijn geresuspendeerde in de buffer niet met wasmiddel en Ingehuld hydrofobe complexen zijn door middel van centrifugeren. Deze procedure wordt herhaald, en de mate van zuivering van mitoribosomes wordt gekwantificeerd door A260/A280 verhouding, die naar verwachting worden ~ 1.3. Typische opbrengst is 7 A260 van een 2 L cultuur beginnen. Dit gedeelte van de mitoribosomal bevat ook extra grote oplosbare mitochondriale complexen, zoals pyruvaat dehydrogenase en Glutamaat dehydrogenase. Om te mitoribosomes scheiden van de oplosbare mitochondriale complexen, wordt het supernatant toegepast op een kleurovergang met sacharose dichtheid. Breuken met de mitoribosome liggen over het algemeen aan de onderkant van de buis derde. De versplintering van het verloop van sacharose kan dan worden gedaan met een geautomatiseerde zuiger of handmatig door het zorgvuldig nemen 50 µL breuken met een pipet of door de onderkant van de buis met een naald 21 G ponsen en het verzamelen van de druppels.
Twee grote mitoribosomal populaties worden geïdentificeerd in het verloop: monosome 55-plussers en grote subeenheid 39S, zoals geïllustreerd in Figuur 3 en 4 van de figuur. De aanwezigheid van de grote subeenheid breuk suggereert dat cellen in een zeer actieve scheidingslijn staat11worden geoogst. De verhouding tussen de monosome en de grote subeenheid pieken kan veranderen. Een extra piek ligt dichter naar de bodem mogelijk weergegeven in preparaten met contaminerende cytoplasmatische ribosomen 80S. Gelieve nota dat de kleine sacharose verloop met behulp van de swingende emmer rotor TLS-55 zorgt voor de snelle reiniging van ~ 1 mL van de mitoribosomes op een optische dichtheid van 0.4-1 een260. De scheiding tussen de monosome en de grote subeenheid pieken kan enigszins variëren afhankelijk van de fractionering, maar meestal is er enige overlapping van de twee bergtoppen. Vandaar, welke breuken te verzamelen, en zwembad in overweging moet worden genomen met het oog op het hoogste percentage monosome, of u kunt ook grote subeenheid, in de steekproef. Voor hoge resolutie cryo-EM studies is de scheiding tussen de twee mitoribosomal populaties niet absoluut nodig (als gevolg van extra in silico operaties). Als betere scheiding nodig is, is het echter raadzaam om grotere buizen en bijbehorende keren wordt uitgevoerd te gebruiken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg"> Figuur 1 : Zuivering van mitochondriën op een helling van sacharose. Subcellular organellen van een 2 L beginnen cultuur waren gefractioneerde door middel van een reeks van differentiële centrifugations zoals beschreven in het protocol, en mitochondriën zijn gescheiden op een discontinue sacharose verloop. De gezuiverde mitochondriën zijn te vinden in de onderste band op het raakvlak van 32% / 60%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg"> Figuur 2 : Zuivering van mitoribosomes op een kussen van sacharose. Ruwe mitoribosomes uit een 2 L startende cultuur zijn gesedimenteerd via 1 M sacharose kussen. De pellets zijn geresuspendeerde in een buffer wasmiddel-vrije en mitoribosomes worden verduidelijkt door twee centrifugations zoals beschreven in het protocol. De absorptie is opgenomen om te beoordelen van de kwaliteit van de voorbereiding en de typische A260/A280 verhouding van ~1.3 (rechtervenster) verklaart een rijke mitoribosome-Fractie. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg"> Figuur 3 : Fijn zuivering van mitoribosomes op een helling van sacharose. Trace van de extinctie van een 2 L cultuur beginnen. Breuken worden genummerd vanaf de bovenkant naar de bodem van het verloop. Twee grote mitoribosomal populaties worden geïdentificeerd: grote subeenheid (piek 1) en monosome 55-plussers (piek 2). De verhouding tussen de bevolking kan veranderen. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg"> Figuur 4 : Opname van het elektron, 2D klassen en 3D reconstructie. Linker paneel: een opname met het monster uit de monosome piek 2 op een geijkte vergroting van 1.23 A / pixel. Midden paneel: Een representatieve post-processing gegevens (2D klassen) onthullen intact monosomes. Rechter paneel: 3D reconstructie. <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Mitochondriën zijn ribosomen die afweek van hun tegenhangers bacteriële en cytoplasmatische gespecialiseerd. Hier laten we zien hoe de mitoribosomes van hun inheemse compartiment in HEK cellen kan worden verkregen. Bij deze methode wordt isolatie van mitochondriën uit schorsing cellen en daaruit voortvloeiende zuivering van mitoribosomes.

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Het algemene doel van deze procedure is om ribosomen te zuiveren uit mitochondriën van menselijke cellijnen op grote schaal die voldoende is voor structurele studies. Deze mitochondriale ribosome zuiveringsmethode maakt de karakterisering van het vertalen van complexen, mutanten, kwaliteitscontrole assemblages, en mitoribosomale subunit tussenproducten. Deze kunnen worden gebruikt om belangrijke vragen over eiwitsynthese in mitochondriën te beantwoorden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stikstof cavitatie wordt gebruikt voor cellyse en slechts 10 tot de 10 kweekcellen nodig zijn om mitoribosomosomen voor te bereiden op hoge resolutie structuur bepaling. Deze techniek kan resulteren in de ontdekking van nieuwe componenten van de mitochondriën vertaalmachines en kan verder worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van kanker. Na het kweken van HEK293S cellen volgens het tekstprotocol, oogst twee een liter buizen van cellen door centrifugatie op 1,000 keer g en vier graden Celsius gedurende zeven minuten.Voorzichtig decanteren van de supernatant en snel resuspend elke pellet in 100 milliliter PBS. Vermaal vervolgens de cellen en vercentrifuge de suspensie op 1, 200 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Vervolgens, na het zorgvuldig decanteren van de supernatant, weeg de pellet.Gebruik vervolgens 120 milliliter MIB-buffer om het opnieuw op te hangen en laat de geresuspendeerde cellen 20 minuten in de koude ruimte zwellen. Breng de opgezwoken cellen over naar een vooraf gekoelde stikstofholtekamer op ijs. Voeg vervolgens 45 milliliter SM4-buffer toe aan de cellen.Maak de stikstofholtekamer vast en vul deze met stikstof tot de druk 500 PSI bereikt. Sluit vervolgens de kranen en houd het 20 minuten op ijs. De stikstofholtecellysemethode voorkomt externe fysieke belasting van de cellen, voorkomt hitteschade aan organellen en het stikstofgas beschermt de cellen tegen oxidatie.Bovendien is het een zeer reproduceerbare methode. Laat langzaam de druk in de kamer los en verzamel het lysaat. Vervolgens, om de cel puin en kernen te verwijderen, centrifuge het lysed materiaal op 800 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verzamel de supernatant door het gieten door middel van een gevouwen stuk mousseline doek in een beker bewaard op ijs. Gooi de pellet niet weg. Resuspend de pellet in 90 milliliter mibsm buffer.Vervolgens, met behulp van een Teflon glas naar beneden homogenisator, homogeniseren het monster en herhaal de centrifugatie op 800 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Nogmaals, verzamel de supernatant door het door een gevouwen stuk mousselinedoek in een beker te gieten die op ijs wordt gehouden. Combineer deze supernatant dan met de eerste supernatant.Centrifugeren het monster op 1,000 keer g en vier graden celsius gedurende 15 minuten. Verzamel vervolgens de supernatant als voorheen. Na het weggooien van de pellet, centrifugeren de supernatant met ruwe mitochondriën op 10,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.Spoel zorgvuldig elke losse pellet uit zonder het strakke gedeelte te verstoren. Gebruik vervolgens 10 milliliter MiBSM-buffer om de strakke pellet opnieuw op te hangen. Voeg 200 eenheden RNase-Free DNase toe aan het monster om het genomische DNA te verwijderen en draai de buis 20 minuten op een rol in de koude ruimte om het monster gelijkmatig te verteren.Centrifuge het monster op 10,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten en gebruik twee milliliter SEM buffer om de pellet resuspend. Laad de volledige mitochondriale vering bovenop het sacharosegradiënt. Na het draaien van de gradiënt volgens het tekstprotocol, met behulp van een transferpipet, zorgvuldig verzamelen van de bruine band migreren op de interface van 32%en 60%sucrose.Dit protocol maakt gebruik van stikstof cavitatie om de cellen te breken. Eenmaal onder de knie, een grootschalige isolatie van zeer zuivere, intacte mitochondriën kan worden gedaan binnen negen uur en kan gemakkelijk worden aangepast en aangepast voor verschillende celtypes en schalen. Na het ontdooien bevroren mitochondriën op ijs, voeg twee volumes lyse buffer aan drie milliliter mitochondriën.Onmiddellijk mengen door het omkeren van de buis meerdere malen. Gebruik een klein Teflon glas naar beneden homogenisator om te helpen met lyse en het homogenaat in te broeden op ijs gedurende vijf tot 10 minuten om de reactie te voltooien. Centrifugeer het lysaat op 30, 000 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten om het onoplosbare materiaal te verwijderen.Verzamel vervolgens voorzichtig de supernatant en gooi de pellet weg. Herhaal de centrifugatie om de verduidelijking van de supernatant te garanderen. Verzamel vervolgens voorzichtig de supernatant en gooi de pellet weg.Bereid voor elke milliliter lysed materiaal een sacharosekussen in een TLA-120.2 ultraheldere buis door 0,4 milliliter sacharosekussen aan de buizen toe te voegen. Leg ongeveer een milliliter lysed mitochondriën op elk sacharosekussen, wat resulteert in een lysate-to-cushion verhouding van 2,5 tegen één. Centrifuge het monster vervolgens in een TLA-120.2 rotor op 231, 550 keer g en vier graden Celsius gedurende 45 minuten.Gooi de supernatant weg en gebruik 100 microliter van de resuspensiebuffer om de buis te spoelen en de resterende sacharose te verwijderen. Resuspend de pellets en combineren ze in een totaal van 100 microliter van resuspensie buffer. Tijdens het opnieuw opladen van de kussenpellet is het essentieel om op ijs uit te voeren om verwarming van het monster te voorkomen en ook om schuimvorming van het monster te voorkomen om de structurele integriteit van de mitochondriale ribosomen te garanderen.Vortex het monster op langzame snelheid gedurende 30 seconden om de resterende aggregaten op te lossen en centrifugeren de buizen op 17, 949 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verzamel voorzichtig de supernatant en herhaal de centrifugatie. Na het meten van mitoribosome absorptie op A260, laad het hele monster op een enkele lineaire sacharose gradiëntbuis.Centrifugeren het monster in een TLS-55 rotor op 213, 626 keer g en vier graden Celsius gedurende 120 minuten. Om de helling te fractie, punctie de onderkant van de buis en het verzamelen van het monster drop-wise in een 96-put plaat. Mitoribosome zuivering mag niet meer dan zeven uur duren voor een voldoende hoeveelheid mitoribosomes.Zoals aangetoond in deze discontinu sucrose gradiënt, de gezuiverde mitochondriën migreren naar de bruine onderste band op de 32-60%-interface. Na de scheiding van mitoribosomen van oplosbare mitochondriale complexen op een sacharosegradiënt, worden twee belangrijke mitoribosomale populaties geïdentificeerd, de monosom 55S en grote subunit 39S. De aanwezigheid van de grote subeenhedenfractie suggereert dat cellen actief worden geoogst in een actief delende toestand.Dit paneel toont een micrograaf met het monster van monosome piek twee bij een gekalibreerde vergroting van 1,23 angstroms per pixel. Hier worden gegevens weergegeven na de eerste verwerking waaruit intacte monosomen blijkt. Tot slot wordt in dit panel een monosome 3D reconstructie geïllustreerd.Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe intacte menselijke mitoribosomes voor te bereiden op structurele en biochemische studies. Ons protocol biedt hoogwaardige laatste preparaten die kunnen worden geëxtrapoleerd naar andere mitochondriale macromoleculen.

rapid-isolation-of-the-mitoribosome-from-hek-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische...

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer de snelle isolatie van mitoribosomen uit HEK293S-cellen via stikstofcavitatie. Deze methode levert hoogwaardige, zuivere ribosomen op voor structurele studies en onderzoek naar mitochondriale eiwitsynthese.

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

Meer video's verkennen