Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen
June 26th, 2018
Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van alpha-synucleïne, zoals het verduidelijken van het mechanisme van aggregatieverspreiding en toxiciteit van alpha-synucleïne in vivo. Het grote voordeel van deze techniek is dat het geen tijdrovende zuivering van alpha-synucleïne preformed fibrils vereist. De procedure zal worden gedemonstreerd door Lucia Rota, een afstudeerstudent van het COLA Lab.
Om de procedure te beginnen, bereidt u de homogenisatiebuffer voor en bewaart deze op ijs. Homogeniseer vervolgens het verse of bevroren weefsel in een volume van één op tien van ijskoude homogenisatiebuffer met behulp van een Teflon stamper homogenisator met 10 tot 15 slagen. Breng vervolgens het hele initiële homogenaat over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 1.000 keer G op vier graden Celsius om kernen en ongebroken cellen in de resulterende pellet te verwijderen.
Gooi vervolgens de resulterende pellet weg. Breng vervolgens het supernatant over naar een schone microcentrifugebuis en centrifugeer het gedurende 20 minuten bij 10.000 keer G op vier graden Celsius met behulp van een gekoelde centrifuge om het tweede supernatant en de pellet te verkrijgen. Breng vervolgens dit supernatant over naar een polycarbonaat fles en centrifugeer het gedurende één uur bij 100.000 keer G op vier graden Celsius met behulp van een ultracentrifuge en een vaste hoekrotor.
Resuspendeer het P100 ruwe pellet met 500 microliters van de homogenisatiebuffer. Breng het P100 ruwe pellet over naar een schone microcentrifugebuis en centrifugeer het gedurende 20 minuten bij 10.000 keer G op vier graden Celsius in een gekoelde centrifuge. Gooi na 20 minuten het supernatant weg en resuspendeer P100 met 100 microliters homogenisatiebuffer.
Soniceer vervolgens het monster gedurende twee seconden op ijs en bewaar het op min 80 graden Celsius. Om Western Blot uit te voeren, giet een gradiënt van vier tot 20% tris-glycine polyacrylamide gel op een verticaal elektroforeseapparaat. Los één microgram van microsomen-geassocieerde alpha-synucleïne fracties op in de denaturerende monsterbuffer en laad het op de gel.
Laad in een andere put vijf microliters van een proteïne-standaardmarker op. Laat de gel draaien bij 100 volt in een tris-glycine SDS draaibuis tot de proteïnemarker het einde van de gel bereikt. Breng vervolgens de proteïnen over naar een nitrocellulose membraan met behulp van een basische koolzuurbuffer.
Bewaar het monster een nacht in de koude kamer met een constante stroom ingesteld op 200 milliamps. Blokkeer de volgende dag het membraan met PBS-T met 5% vetvrije melkpoeder op een orbitale schudder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens het membraan kort met PBS-T.
Incubeer het membraan met SIN-1 bij een op 5.000 of P-Ser129 alpha-synucleïne antilichaam bij een op 5.000 in 2,5% vetvrije melkpoeder in PBS-T gedurende een nacht in de koude kamer of koelkast op vier graden Celsius op een orbitale schudder. Was het volgende dag het membraan gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met PBS-T op een orbitale schudder. Incubeer het membraan met anti-muis of anti-konijn HRP-geconjugeerd secundair antilichaam bij een op 3.000 in 2,5% vetvrije melkpoeder in PBS-T gedurende één uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudder.
Was vervolgens het membraan gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met PBS-T op een orbitale schudder drie keer. Verkrijg het signaal door middel van de reguliere chemiluminescentie kit. Om de neuronen te behandelen, trek de microsomen-geassocieerde alpha-synucleïne aggregaten verkregen uit het ruggenmerg van drie verschillende zieke transgene muizen om een oplossing van één microgram per microliter te verkrijgen, verdund met de originele homogenisatiebuffer.
Verwijder vervolgens een derde van het medium en vervang het voorzichtig met vers neuronenmedium. Voeg één microgram van gepoolde microsomen-geassocieerde alpha-s aggregaten toe aan het celmedium. Breng de neuronen terug in de incubator op 37 graden Celsius.
Voeg een derde van vers medium toe aan het monster zonder het medium eenmaal per drie dagen gedurende een week te vervangen. Na een week behandeling, verwijder een derde van het medium en vervang het voorzichtig met vers medium dat 2% B27, 10 microgram per milliliter gentamicine en twee millimolair glutamine bevat. Herhaal dit elke drie dagen gedurende een week voordat u de cellen fixeert.
Voer immunofluorescence uit door de neuronen in een chemische afzuigkap te fixeren met 2% paraformaldehyde en PBS in 5% sucrose oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden. Verwijder na 15 minuten de fixeeroplossing en spoel de neuronen kort drie keer met PBS. Permeabiliseer vervolgens de neuronen met 0,3% van niet-ionische surfactin in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Was vervolgens de neuronen kort drie keer met PBS. Incubeer de neuronen met 3% FBS en PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder om onspecifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Incubeer vervolgens de neuronen met een geschikt primair antilichaam opgelost in 3% FBS en PBS gedurende een nacht in de koude kamer of koelkast gedurende een nacht bij vier graden Celsius op een orbitale schudder.
Verwijder de volgende dag de antilichaamoplossing en was de cellen kort drie keer met PBS. Incubeer vervolgens de neuronen met het juiste fluorescente secundaire antilichaam opgelost in 3% FBS en PBS gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker op een orbitale schudder. Verwijder de antilichaamoplossing en was kort drie keer met PBS.
Kleur vervolgens de neuronen met DAPI-oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker op een orbitale schudder. Verwijder na 15 minuten de antilichaamoplossing en was kort drie keer met PBS. Monteer de dekvlakken op de glijbaan met behulp van anti-fade montagemedium.
In deze studie induceert toediening van één microgram van gepoolde microsomen-geassocieerde alpha-synucleïne aggregate
Overzicht
Deze studie presenteert een cel-gebaseerd model voor het onderzoeken van de in vivo vorming van alpha-synucleïne aggregaten, gebruikmakend van primaire neuronen. Door gebruik te maken van exogeen toegediende alpha-synucleïne aggregaten van zieke transgene muizen, probeert het onderzoek de mechanismen die ten grondslag liggen aan aggregaatverspreiding en toxiciteit te verduidelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Neurodegeneratieve ziekten
Achtergrond
- Alpha-synucleïne is betrokken bij neurodegeneratieve ziekten.
- Begrip van het aggregatieproces is cruciaal voor therapeutische interventies.
- Huidige methoden voor het bestuderen van aggregatie vereisen vaak uitgebreide zuivering.
Doel van het onderzoek
- Om een vereenvoudigd protocol te ontwikkelen voor het bestuderen van alpha-synucleïne-aggregatie.
- Om de propagatie en toxiciteit van alpha-synucleïne-aggregaten in neuronale omgevingen te onderzoeken.
- Om een betrouwbaar systeem te bieden dat de noodzaak voor complexe zuiveringsprocessen omzeilt.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van primaire neuroncultuurs om intracellulaire aggregatie te onderzoeken.
- Microcentrifugering en ultracentrifugering worden gebruikt om microsomen-geassocieerd alpha-synucleïne te isoleren van zieke transgene muizen.
- Western blotting en immunofluorescentie-assays worden gebruikt om eiwitaggregaten te analyseren.
- Neuronen worden gedurende een periode van twee weken behandeld met aggregaten, met mediaveranderingen elke drie dagen.
Belangrijkste resultaten
- De behandeling met alpha-synucleïne aggregaten leidt tot een tijdsafhankelijke vorming van distincte inclusies in neuronen.
- Aanvankelijk verschijnend als verspreide punten, ontwikkelen deze aggregaten zich in de loop van de tijd tot meer volwassen structuren.
- De aanwezigheid van deze inclusies werd bevestigd met behulp van aggregaat-specifieke antilichamen.
Conclusies
- De studie toont een nieuwe benadering voor het modelleren van alpha-synucleïne-aggregatie in vitro.
- Deze methode verhoogt het begrip van de mechanismen achter alpha-synucleïne-pathologie.
- De bevindingen hebben belangrijke implicaties voor toekomstig onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten en potentiële therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method provides a physiologically relevant cell model for studying pathogenic alpha-synuclein aggregation directly from diseased tissue, bypassing recombinant fibril production. It enables mechanistic de-risking of alpha-synuclein-targeted therapeutics by using authentic seeding species that mimic in vivo inclusions. The approach supports target validation and phenotypic screening in Parkinson's disease research with improved predictive confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using endogenous, disease-derived alpha-synuclein aggregates.
- Operational Value: Eliminates time-consuming recombinant fibril purification, accelerating target engagement studies.
- Predictive Value: Uses pathogenic seeding species isolated from transgenic mice, improving translational relevance for target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-dependent intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated alpha-synuclein.
- Operational Value: Produces a standardized, reproducible readout for compound screening in primary neurons.
- Assay Readiness: Supports scalable platform development for evaluating aggregation inhibitors or modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models intracellular inclusion formation that colocalizes with presynaptic and neurite markers, reflecting pathogenic spread.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of aggregation over two weeks with defined media replenishment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo-like pathology using tissue-derived aggregates from diseased models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through phenotypic screening of aggregation modulators in a disease-relevant neuronal system.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on aggregation mechanisms and toxicity using authentic seeding species.
- Screening: Provides assay-ready neuronal cultures with quantifiable inclusion formation as a functional readout.
- Analytics: Enables Western blot and immunofluorescence detection of aggregate-specific and phosphorylated alpha-synuclein.
- Translational Research: Uses microsomes-associated aggregates from diseased tissue to enhance preclinical predictive value.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal model for iterative target de-risking across alpha-synuclein-focused programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via disease-relevant, endogenous alpha-synuclein species.
- Operational Value: Standardized isolation and administration protocol improves reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by using pathogenic aggregates over artificial fibrils.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on aggregation inhibition in a physiologic model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuron culture and subcellular fractionation techniques.
- Dependent on access to transgenic mouse tissue rich in pathological alpha-synuclein inclusions.
- Necessitates ultracentrifugation equipment for microsomes-associated aggregate isolation.
- Requires optimization of aggregate-to-neuron ratio based on plating density.
- Limited by tissue availability and need for fresh or frozen diseased tissue sources.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Isolation of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates from Diseased A53T Alpha-synuclein Transgenic Mic
2:30
Western Blot
4:32
Neurons Treatment
5:40
Immunofluorescence
7:45
Results: Time-dependent Induction of Alpha-synuclein Deposition After Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates
8:35
Conclusion
