Name: Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Leer hoe u reactieve zuurstofsoorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype kwantitatief meet in WI-38 menselijke fibroblasten tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie met behulp van flowcytometrie, real-time PCR en ELISA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Research Foundation Korea (2015R1D1A1A01060839) (voor de jonge Yeon Kim) en door een subsidie van de National Research Foundation van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (tot op Jeanho Yun).

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we methoden voor controle van intracellulaire ROS niveaus tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie in WI-38 normale menselijke fibroblasten gepresenteerd. Intracellulaire ROS niveaus in levende cellen kunnen worden gemeten met behulp van de cel-permeabele reagens DCF-DA kwantitatief en stroom cytometry. Op cellulaire opname, is DCF-DA door intracellulaire esterasen deacetylated en vervolgens geoxideerd door ROS te vormen zeer fluorescerende 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). DCF-fluorescentie kan worden gedetect...

Meer dan 50 jaar geleden, bleek Hayflick en Moorhead dat normale cellen onomkeerbare groei arrestatie op de uitputting van hun proliferatieve potentieel na een bepaald aantal celdelingen1 invoeren. Dit fenomeen is nu bekend als Dr. senescentie en gelooft te sterk correleren met organisch veroudering2. Hoewel de geleidelijke erosie van de telomeren wordt beschouwd als een belangrijke oorzaak van Dr. senescentie, zijn diverse cellulaire benadrukt, zoals DNA schade oncogene activering en oxidatieve stress, voor het opwekken van een ander type van cellulaire senescentie gemeld "voorbarig senescentie" of "stress-induced senescentie" genoemd. Interessant, speelt voortijdige senescentie een potente tumor-onderdrukkende rol bij de activering van oncogenen zoals H-Ras en BRAF. Studies van Muismodellen en menselijke weefsels hebben sterke aanwijzingen dat biomarkers voor cel senescentie waren voornamelijk aanwezig in Premaligne laesies waar oncogene Ras en BRAF worden geactiveerd maar werden afgenomen in kwaadaardige kanker die ontwikkeld op basis van Deze letsels3,4,5. Naast haar rol in veroudering en onderdrukking van de tumor, is cellulaire senescentie aangetoond in eerdere studies een rol te spelen in verschillende fysiologische processen, met inbegrip van wondgenezing, weefselherstel, immuun toezicht en embryonale ontwikkeling6.
Hoewel groei arrestatie heeft uitvoerig bestudeerd als een stempel van cellulaire senescentie7, suggereert een aanzienlijke hoeveelheid bewijs dat intracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) draagt ook bij tot cellulaire senescentie8. De hoogte van ROS niveaus tijdens verschillende soorten cellulaire senescentie, met inbegrip van Dr. senescentie en oncogen-geïnduceerde senescentie (OIS), werd oorspronkelijk gemeld decennia geleden9,10. Een meer direct, exogene behandeling met een subletale dosis H2O2 induceert senescentie11,12. De remming van ROS-opruiming enzymen, zoals SOD1, veroorzaakt ook voorbarig senescentie13. In tegenstelling, lage omgevingstemperatuur zuurstof voorwaarden en het vergroten van ROS opruiming vertraging het intreden van senescentie10,14,15. Deze resultaten geven ongetwijfeld dat ROS belangrijk bemiddelaars of determinanten van cellulaire senescentie inductie zijn. Echter hoe ROS bijdragen tot de inductie van cellulaire senescentie en hoe ROS niveaus zijn verheven tijdens cellulaire senescentie nader onderzoek.
Recente studies is gebleken dat verouderend cellen potente paracrine activiteiten op naburige cellen en weefsels door een SASP16,17 hebben. In leeftijd weefsel bevorderen verouderend cellen leeftijdsgebonden weefsel disfuncties via vele paden door SASP naast een autonome uitputting van de proliferatieve cellen. Verschillende proinflammatoire factoren, zoals IL-6, IL-8, TGFβ en matrix metalloproteinasen (MMP), uitgescheiden door verouderend cellen, veroorzaken de dysfuncties van de leeftijdsgebonden weefsel door de verslechtering van de weefsel homeostase, vernietiging van het weefsel architectuur, senescentie van naburige cellen en steriele ontsteking18,19. Echter kan SASPs hebben gunstige effecten afhankelijk van de biologische context. Bovendien, hangt de aard van de heterogenetic van de SASPs af van het celtype verouderend en de cel fase, nadruk op de noodzaak van verder onderzoek19.
Hier beschrijven we snelle en gevoelige cytometry gebaseerde technieken voor de beoordeling van intracellulaire ROS niveaus tijdens OIS. Bovendien, de methoden voor de analyse van SASP factoren met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) en ELISA zijn ingevoerd.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta; D-galactopyranoside (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferricyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-pure distilled water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6 ELISA assay</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-8 ELISA assay</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;m syringe filter</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax microplate reader</td><td></td></tr></tbody></table>

een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Cellulaire senescentie is beschouwd als een staat van onomkeerbare groei arrestatie na uitputting van de proliferatieve capaciteit of blootstelling aan verschillende benadrukt. Recente studies hebben uitgebreid de rol van cellulaire senescentie naar verschillende fysiologische processen, met inbegrip van de ontwikkeling, wondgenezing, immuun toezicht en leeftijdsgebonden weefsel dysfunctie. Hoewel celcyclus arrestatie een essentieel kenmerk van cellulaire senescentie is, heeft een verhoogde intracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) productie ook aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Recente studies bleek bovendien dat verouderend cellen krachtige paracrine activiteiten op naburige cellen en weefsels via een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP exposeren). De scherpe stijging van de rente met betrekking tot therapeutische strategieën tegen cellulaire senescentie onderstreept de noodzaak van een nauwkeurig inzicht in senescentie mechanismen, met inbegrip van intracellulaire ROS en de SASP. We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van kwantitatief intracellulaire ROS niveaus tijdens H-Ras-geïnduceerde cellulaire senescentie met behulp van ROS-gevoelige fluorescente kleurstof en stroom cytometry. Daarnaast introduceren we gevoelige technieken voor de analyse van de inductie van mRNA uitdrukking en secretie van SASP factoren. Deze protocollen kunnen worden toegepast op verschillende cellulaire senescentie modellen.

Een voorbeeld van H-Ras-geïnduceerde senescentie is weergegeven in Figuur 1. Een infectie van het normale menselijke fibroblasten WI-38 met de H-RasV12-retrovirus geïnduceerde dramatische morfologische veranderingen (figuur 1B). Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 1 c, SA β-gal kleuring activiteit was opmerkelijk steeg op H-RasV12 expressie. Meer dan 70% van de cellen toonde SA β-gal kleuring activite...

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Het algemene doel van deze procedure is om gevoelige technieken te bieden voor het monitoren van intracellulaire ROS-niveaus en senescentie-geassocieerde secretoire fenotypen, of SASP, tijdens cellulaire senescentie. Hier laten we zien dat deze methoden succesvol de verhogingen in de niveaus van intracellulair ROS en de SASP-factoren IL-6 en IL-8 onthullen tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie in WI-38 normale menselijke fibroblasten. Deze technieken maken het mogelijk om veranderingen in intracellulaire ROS-niveaus tijdens cellulaire senescentie te monitoren en de expressie van SASP-factoren te analyseren.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat ze kunnen worden toegepast op veel verschillende modellen van cellulaire senescentie. Daarom kan deze methode ons uiteindelijk helpen om de rol van ROS en SASP in cellulaire senescentie te begrijpen en de onderliggende regulerende mechanismen te bestuderen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Young Yeon Kim en Jee-Hyun Um van mijn laboratorium.Begin deze procedure door het H-Ras retrovirus voor te bereiden. Zaai eerst ecotropische BOSC-cellen in een met poly-L-lysine gecoate kweekschaal en kweek één dag bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator. De volgende dag transfecteer de BOSC-cellen met H-Ras retroviraal DNA en verpakkings-DNA's met behulp van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant.Na acht uur transfectie, verwijder het transfectiemedium en voeg acht milliliters vers medium toe. Verzamel het medium dat virale deeltjes bevat 48 uur later, en verwijder cellulaire resten door centrifugatie. Filter vervolgens het virusbevattende medium met een 0,45-micrometer spuitfilter.Plateer WI-38-cellen in een 60-millimeter kweekschaal één dag voor het oogsten van H-Ras retrovirus, en kweek één dag bij 37 graden Celsius in een incubator. De volgende dag verwijder het groeimedium en voeg één milliliter H-Ras-virusmedium toe. Voeg een extra milliliter groeimedium toe met twee microliters polybreen-stockoplossing en incubeer één dag in een CO2-incubator.24 uur na infectie, verwijder het virusmedium, was de cellen twee keer met PBS en voeg het groeimedium toe. Om niet-geïnfecteerde cellen te verwijderen, behandel de cellen gedurende twee dagen met twee microgram per milliliter puromycine. Bereid verse SA beta-gal kleuroplossing voor door de stockoplossing te verdunnen.Verwijder het kweekmedium en was de cellen eenmaal met PBS. Voeg fixeeroplossing met formaldehyde toe en incubeer gedurende vijf minuten. Verwijder de fixeeroplossing van de cellen en was met PBS.Voeg vers bereide SA beta-gal kleuroplossing toe om de schaal te bedekken. Verzegeld de schaal met Parafilm om te voorkomen dat het monster uitdroogt, en incubeer bij 37 graden Celsius in een incubator zonder CO2. Controleer de kleuringsstatus van de cellen onder de microscoop de volgende dag.SA beta-gal-positieve cellen zullen blauw verschijnen in het perinucleaire gebied. Verzamel een afbeelding van SA beta-gal kleuring met een CCD-camera en bereken het percentage SA beta-gal-gekleurde cellen door het aantal SA beta-gal-positieve cellen te tellen onder minimaal 200 totale cellen. Plateer twee keer 10 tot de vijfde WI-38 cellen op een 60-millimeter kweekschaal en induceer senescentie door de cellen te infecteren met H-Ras retrovirus zoals eerder beschreven.Op het gewenste tijdstip voor meting van ROS, verwijder het groeimedium en was één keer met PBS. Los de cellen op door behandeling met trypsine/EDTA-oplossing en bepaal het celtelling. Breng een keer 10 tot de vijfde cellen over in een 15-milliliter conische buis en verzamel de cellen door centrifugatie.Verwijder het groeimedium voorzichtig en voeg één milliliter vers bereide DCF-DA kleuroplossing toe. Hersuspendeer voorzichtig het cellenpellet en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in het donker. Verzamel de cellen door centrifugatie en was één keer met PBS.Hersuspendeer de cellen met één milliliter PBS en breng de monsters over in een FACS-buis. Het DCF-DA-fluorescentiesignaal kan worden gemeten met behulp van een flowcytometer uitgerust met een blauwe laser van 488 nanometer. Voer eerst een niet-gekleurd controlemonster uit.In de dotplot van de voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing, selecteer levende cellen en elimineer dode cellen en celresten door een gatingtool te gebruiken. Vervolgens, in de histogrammen die het DCF-DA-fluorescentiesignaal weergeven, pas de spanning van de blauwe laser aan om de piek van de controlecellen aan de linkerrand te plaatsen. Voer nu elk monster uit dat met DCF-DA is gekleurd en neem minimaal 10.000 gebeurtenissen op.Induceer senescentie door de cellen te infecteren met H-Ras retrovirus zoals eerder beschreven. Een dag voor het oogsten, was de cellen twee keer met PBS. Voeg drie milliliter DMEM zonder FBS toe en kweek de cellen bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator gedurende één dag.Na 24 uur verzamel het geconditioneerde medium en bewaar het bij min 80 graden Celsius voor latere ELISA. Trypsiniseer de cellen en verzamel de cellen in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis door centrifugatie. Bereid totaal RNA voor met behulp van de conventionele RNA-extractiemethode en genereer cDNA van twee microgram totaal RNA via een reverse transcriptiereactie.Voor real-time PCR, bereid SYBR Green PCR Master Mix voor alle reacties voor die de voorwaartse en achterwaartse primers voor IL-6 of IL-8 bevatten. Bereid de reactiemix voor voor elk monster met actine-primers als interne controle. Voeg 48 microliters Master Mix en twee microliters cDNA-producten toe die één tot drie verdund zijn in elke put in een 96-well optische qPCR-plaat.Voer elke reactie uit in drievoudig. Stel het real-time PCR-reactieprogramma in op de thermische cycler en voer real-time PCR uit. Na voltooiing van de run, verzamel de drempelcycluswaarden, of CT-waarden, en bereken de mRNA-niveaus van IL-6 of IL-8 na normalisatie op de actine-niveaus.Ontdooi geconditioneerd medium dat eerd

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

Hier bespreken we een serie van protocollen voor de inductie en validatie van cellulaire senescentie in gekweekte cellen. Wij richten op verschillende senescentie-inducerende prikkels en de kwantificering van gemeenschappelijke senescentie-geassocieerde markers te beschrijven. Wij bieden technische details met behulp van fibroblasten als een model, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan verschillende cellulaire modellen.

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Dit protocol biedt gereflecteerd licht confocale microscopie voor objectieve, enkelceldetectie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-gal) activiteit in de stromale vasculaire fractie die is geïsoleerd uit menselijk vetweefsel. De methode is compatibel met immunocytochemie, bevat pH-controles voor kwantitatieve beoordeling en biedt bovendien een gevoeliger en minder subjectief alternatief voor conventionele SA-β-gal kleuring.

Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

Dit artikel presenteert een levende-cel LysoTracker-protocol om lysosomale hervorming tijdens senescentie in IMR-90 menselijke fibroblasten te meten.

Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Deze methode bestudeert hoe senescente huidfibroblasten gezonde fibroblasten beïnvloeden. Senescentie wordt geïnduceerd door UVB-blootstelling, en het geconditioneerde medium wordt toegepast op normale fibroblasten. Het helpt bij het evalueren van bioactieve verbindingen die gericht zijn op veranderde cel-tot-cel communicatie bij huidveroudering.

Nieuwe combinatie van antioxidanten om gezonde intercellulaire communicatie te herstellen in een in vitro model met behulp van een geconditioneerd medium uit senescente cellen

Leer hoe u reactieve zuurstofsoorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype kwantitatief meet in WI-38 menselijke fibroblasten tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie met behulp van flowcytometrie, real-time PCR en ELISA.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie (Video) | JoVE Journal

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Meer video's verkennen