Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt
1 juni 2018
Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en fabriceren van een embryo van de zebravis arraying sjabloon, gevolgd door een gedetailleerde procedure op het gebruik van deze sjabloon voor hoge doorvoer zebrafish embryo arraying in een 96-wells-plaat.
Deze methode kan de Zebravis embryo arraying procedure aanzienlijk versnellen en Zebravis echt geschikt maken voor high throughput screening. Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van een 3D geprint sjabloon om Zebravis embryo's vooraf te arrayen in een 96 of 384 well matrix, wat een zeer efficiënt plate voorbereidingsproces mogelijk maakt. We hadden eerst het idee voor de methode terwijl we de screening van nanodeeltjes uitvoerden door handmatig individuele embryo's in elke put van een modulaire plaat te kiezen en selecteren en wilden de efficiëntie verhogen.
Naast Tianyu zal mede-afgestudeerde Yue Jiang de procedure demonstreren. Begin deze procedure met het ontwerp van de arraying sjabloon met een twaalf bij acht 96 well lay-out die past op een standaard 96 well plaat. Zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.
Gebruik een 3D printer met een nauwkeurigheid van 0,1 millimeter om de sjabloon af te drukken. Enkele belangrijke componenten van de sjabloon zijn de opvangkamer, de opvangput, de vacuümkamer en de luchtuitlaat. Om de Zebravis embryo kuitzetting uit te voeren, scheid eerst mannetjes en vrouwtjes door een doorzichtige plastic verdeler.
Plaats vervolgens twee paar mannetjes en vrouwtjes per kweekbak één dag voor de kuitzetting. Op de dag van kuitzetting, verwijder de verdelers in de ochtend om mannetjes en vrouwtjes te mengen. Verwijder de mannetjes en vrouwtjes en verzamel Zebravis embryo's met behulp van een fijnmazige zeef.
Was de embryo's met 250 milliliter eierwater. Breng de verzamelde embryo's over naar Petri-schijven met Holtfreter's Oplossing. Verwijder de dode en onbevruchte embryo's met behulp van een stereomicroscoop.
Plaats de embryo's in een incubateur van 28,5 graden Celsius. Vier uur na bevruchting, observeer de embryo's en verwijder eventuele dode en ongezonde embryo's. De embryo's zijn nu klaar voor de volgende stap.
Was de sjabloon twee tot drie keer met 500 milliliter gedeïoniseerd water voordat u deze in de droogoven plaatst gedurende vijf minuten. Plak vervolgens de onderste kamer af met een stuk afdichtfilm. Verbind een vacuümpomp via de luchtuitlaat aan de onderkant van de sjabloon om negatieve druk te genereren in de kamer die is afgedicht door de afdichtfilm.
Plaats ongeveer 150 embryo's in de sjabloon met behulp van een plastic overdrachtspijpje. Schud de hele sjabloon horizontaal totdat elke put één embryo heeft opgevangen. Bij deze stap is het van cruciaal belang om elke beschikbare Zebravis embryo te controleren en te controleren.
Als de Holtfreter buffer erg laag was, zou men extra buffer kunnen toevoegen door de sjabloon te schudden. Gooi overtollig Holtfreter's Oplossing en embryo's die niet in de putten zijn opgevangen weg. Schakel de vacuümpomp uit en koppel deze los.
Plaats een standaard 96 well plaat ondersteboven tegen de sjabloon en draai beide tegelijkertijd. Tik op de onderkant van de sjabloon of sluit de luchtuitlaat aan op een gecomprimeerde gasdoos om alle opgevangen embryo's van de sjabloon naar de 96 well plaat over te brengen. Verwijder ten slotte de afdichtfilm en was de sjabloon drie keer van boven naar beneden met 500 milliliter gedeïoniseerd water voor toekomstig gebruik.
Hier is het gedeeltelijke beeld van een 96 well plaat weergegeven die is gearrayed door de sjabloon. Omgekeerd toont dit beeld het gedeeltelijke beeld van een 96 well plaat die handmatig is gearrayed. De algehele gezondheidsstatus van de embryo's na het plateren door middel van handmatige en arraying sjabloon methoden wordt hier weergegeven.
Op basis van het uitkomen, de overleving en de misvormingspercentages van de embryo's, werden in beide gevallen geen significante effecten op de algehele gezondheid van de embryo's waargenomen. Eenmaal beheerst, zal deze techniek één 96 of 384 well plaat klaarmaken in slechts twee tot drie minuten als deze correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft dit de weg geëffend voor onderzoekers om ten volle te profiteren van de nieuwe kenmerken van dit modelorganisme en echt in vitro high throughput screening te bereiken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het ontwerpen en fabriceren van een zebrafish embryo arraying template, waardoor high throughput arraying in een 96-well plate mogelijk wordt. De methode verbetert aanzienlijk de efficiëntie van de zebrafish embryo arraying procedure.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- High Throughput Screening
Achtergrond
- Zebravissen worden veel gebruikt in biologisch onderzoek vanwege hun transparante embryo's.
- Efficiënte embryo arraying is cruciaal voor high throughput screening toepassingen.
- Traditionele methoden omvatten handmatige selectie, wat tijdrovend kan zijn.
- De introductie van een 3D geprint template biedt een nieuwe oplossing om de efficiëntie te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor high throughput zebrafish embryo arraying.
- Om een 3D geprint template te gebruiken voor efficiënte embryo plaatsing.
- Om het screening proces te verbeteren voor verschillende toepassingen, inclusief nanoparticle testen.
Gebruikte methoden
- Ontwerp van een 3D geprint arraying template met een 12 bij 8 lay-out.
- Pre-arraying van zebrafish embryo's in een 96 of 384 well matrix.
- Demonstratie van de procedure door afstudeerstudenten.
- Gedetailleerd tekstprotocol voor implementatie.
Belangrijkste resultaten
- Het 3D geprinte template maakt snelle en efficiënte embryo arraying mogelijk.
- Aanzienlijke tijdsbesparing in vergelijking met handmatige methoden.
- Maakt high throughput screening mogelijk.
- Gedemonstreerde effectiviteit bij het voorbereiden van platen voor experimenten.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de efficiëntie van zebrafish embryo arraying.
- Gebruik van een 3D geprint template is een belangrijke innovatie.
- Deze methode is gunstig voor onderzoekers die high throughput screenings uitvoeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High throughput zebrafish embryo arraying is a critical bottleneck in phenotypic screening and early-stage compound evaluation. The introduction of a 3D-printed template with vacuum manipulation enables rapid, reproducible preparation of multi-well plates, directly supporting scalable screening workflows. This innovation enhances operational efficiency and supports portfolio-wide compound triage in discovery-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates preparation of zebrafish embryos for hypothesis-driven compound testing.
- Enables robust phenotypic screening by standardizing embryo placement across wells.
- Supports functional target validation by facilitating high-content, parallelized assays.
Screening & Assay Development
- Delivers rapid, reproducible arraying of embryos for multi-well plate-based screening.
- Improves assay throughput and consistency, reducing manual variability.
- Enables efficient scaling to 96- and 384-well formats for compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Supports disease-relevant phenotypic assays in zebrafish embryos for translational insights.
- Facilitates continuity from early discovery to preclinical model validation.
- Reduces operational barriers to implementing high-throughput in vivo screening platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D-printed template method integrates at the interface of early discovery and screening, enabling seamless transition from embryo collection to high-throughput phenotypic assays.
- Discovery Biology: Streamlines hypothesis testing by enabling rapid setup of parallel experimental conditions.
- Screening: Provides standardized, reproducible embryo arraying for quantitative screening outputs.
- Analytics: Supports consistent measurement of phenotypic endpoints across large sample sets.
- Translational Research: Bridges early discovery and preclinical validation by enabling scalable in vivo assays.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for repeated high-throughput screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological variability in screening assays.
- Operational Value: Standardizes embryo arraying, enabling reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, high-throughput phenotypic data generation.
Implementation Considerations
- Requires access to precision 3D printing and basic vacuum instrumentation.
- Demands operator proficiency in embryo handling and template operation.
- Standardization of washing and transfer steps is critical for reproducibility.
- Adaptable to both 96- and 384-well plate formats for diverse screening needs.
- Template cleaning and maintenance are essential for sustained performance.
