Name: Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer celmechanica meten in levende Drosophila-embryo's met behulp van optische pincetten en lichtveldmicroscopie. Deze minimaal invasieve methode maakt real-time meting van spanning en stijfheid mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door een FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (op P.-F.L.). Wij erkennen de Frankrijk-BioImaging infrastructuur ondersteund door het Franse nationale Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringen voor de toekomst»). Wij danken Brice Detailleur en Claude Moretti van de PICSL-FBI-infrastructuur voor technische bijstand.

<ol><li>Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation%2C+transmission%2C+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li>
<li>Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li>
<li>Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).</li>
<li>Campàs, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li>
<li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004(2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li>
<li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+state%2C+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface+%2F+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li>
<li>Etournay, R., Popović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090(2015).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li>
<li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li>
<li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883(2017).</li>
<li>Campàs, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li>
<li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li>
<li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512(2012).</li>
<li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+theoretical+biology%22%5BJournal%5D)">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li>
<li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellFIT%3A+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116(2014).</li>
<li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7919782">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li>
<li>Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li>
<li>Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342(2014).</li>
<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li>
<li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%22%5BJournal%5D)">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Optisch pincet wil absolute mechanische metingen rechtstreeks in de ontwikkelingslanden embryonale epitheel uitvoeren op een niet-invasieve wijze. In die zin presenteert het voordelen ten opzichte van andere methoden zoals laser ablatie, die zijn invasief en verstrekken van relatieve metingen, magnetische krachten, waarvoor injecties, of dwingen gevolgtrekking, die gebaseerd op sterke veronderstellingen is en bieden ook relatieve metingen.
Het protocol bevat een paar kritische stappen. Eerst, ...

Embryonale ontwikkeling is een zeer reproduceerbaar proces waarin de cellen en weefsels vervormen om het toekomstige dier vorm te geven. Dergelijke vervormingen hebben aangetoond dat vereist de actieve generatie van krachten op de cel niveau1,2. Om te begrijpen morfogenetische processen waarin cellen en weefsels hun vorm wijzigen, is daarom sleutel tot het beoordelen van de mechanische eigenschappen van de cellen die betrokken zijn, en voor het meten van de krachten binnen het weefsel tijdens het proces3,4 . Epitheelweefsel lagen, met name in Drosophila, hebben grote schaal onderzocht als gevolg van hun quasi-2D-geometrie en hun gemakkelijke manipulatie.
Een aantal technieken hebben dus ontwikkeld door ons en anderen om te beoordelen epitheliale mechanica in vivo tijdens de ontwikkeling. Zullen wij een snel overzicht van de drie belangrijkste technieken gebruikt in epitheliale weefsels. Laser ablatie, een veel gebruikte methode, maakt het mogelijk om het onthullen van de lokale mechanische stress op cel kruispunten5,6,7,8 of op grotere schaal9,10,11 door het uitvoeren van lokale bezuinigingen die de mechanische integriteit van het doel verstoren. De dynamiek van de opening na de cut vindt u informatie over de voorafgaande ablatie van stress, zowel de reologie van het weefsel12,13. Een nadeel van laser ablatie is dat het invasieve, daar het vereist dat de lokale verstoring van de cortex van de cel. Vandaar, kan een alleen een beperkt aantal ablations uitvoeren, als men wil weefsel integriteit behouden blijft. Een ander nadeel is dat ablations alleen schattingen op te relatieve van spanning op de contacten van de cel, leveren omdat de opening snelheid is afhankelijk van viskeuze wrijving, dat over het algemeen niet bekend is. Magnetische manipulatie heeft ook ontwikkeld en gebruikt in Drosophila, waarbij het gebruik van ferrofluids14 of15van de ultramagnetic liposomen. Ze bieden absolute metingen16,17, maar zijn ook invasief in de zin dat zij de injectie van sondes op de gewenste locatie vereisen. Dit kan erg lastig zijn afhankelijk van het systeem, dat niet altijd vatbaar voor precieze injecties is. Een derde techniek, volledig niet-invasieve, is kracht gevolgtrekking18,19,20. Kracht gevolgtrekking is gebaseerd op de veronderstelling van mechanisch evenwicht op driedubbele punten (tricellular verbindingen, of hoekpunten) en kunt afleiden spanningen helemaal cel contacten (en eventueel druk in alle cellen) door een omgekeerde probleem op te lossen. Voor spanningen biedt elke vertex twee vergelijkingen (X en Y). Dit levert een grote stelsel van lineaire vergelijkingen, die onder bepaalde omstandigheden te beoordelen van spanning op alle contacten van de cel kan worden omgekeerd. Terwijl deze methode zeer aantrekkelijk, is omdat het vereist alleen een gesegmenteerde afbeelding en geen extra experiment of setup, de juistheid ervan is nog te bepalen, en opnieuw het levert alleen relatieve waarden, tenzij een absolute kalibratie-meting is uitgevoerd.
Om sommige van deze beperkingen te overwinnen, voeren we in dit artikel een opstelling van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop toe te passen gecontroleerde krachten op de schaal van de cel in de embryonale epitheel van Drosophila melanogaster. Optisch pincet zijn gebruikt voor tal van biologische toepassingen met inbegrip van de metingen op één eiwitten en manipulatie van organellen en cellen21. Hier, rapporteren we toegepaste krachten in de range van een paar dozijn pN, die klein is nog voldoende induceren van lokale deformaties van mobiele contacten en mechanische metingen in vivouitvoeren. Wij gebruiken meestal loodrecht doorbuiging van cel contacten, gevolgd door de analyse van kymographs, kracht op vervorming. Nog belangrijker is, vereist onze opstelling geen injectie van kralen op de gewenste locatie in het weefsel, aangezien optisch pincet kunnen direct oefenen krachten op cel contacten. De koppeling van de optisch pincet om een lichte blad Microscoop kan men voor het uitvoeren van snelle beeldvorming (aantal frames per seconde), die zeer merkbaar voor een mechanische analyse op korte tijd schalen, en met beperkte fototoxiciteit, sinds de verlichting van is de monster is beperkt tot het vlak van imaging22.
Algemene, optisch pincet zijn een niet-invasieve manier toe te passen gecontroleerde krachten op cel contacten in vivo in de Drosophila embryo, en mechanische gegevens zoals stijfheid en spanning op cel contacten23, Rheologische eigenschappen extraheren 24, en verloop- of anisotropie van spanning23.

<table><tbody><tr><td>Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td><td>IPG Laser</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>inclusief collimator LP: straal D = 1,6 mm en rode geleidingslaser</td></tr><tr><td>&Oslash;1/2" Optische Stralensluiter</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Straaldiameter Galvanometer Systemen</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 voor X-verplaatsing, 1 voor Y-verplaatsing</td></tr><tr><td>1D of 2D Galvo Systeem Lineaire Voeding</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>galvanometervoeding</td></tr><tr><td>2 lenzen f = 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>relaistelescoop tussen 2 galva</td></tr><tr><td>Lens f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2,5X telescoop</td></tr><tr><td>Lens f = 500 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2,5X telescoop</td></tr><tr><td>Rechthoekige Kinematische Elliptische Spiegel Montage met Beitelgaten</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td><td>Periscoop</td></tr><tr><td>Laser Veiligheidsbrillen, Licht Groene Lenzen, 59% Zichtbare Lichttransmissie, Universele Stijl</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, 50,0 mm Diameter, Hot Mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>Multifoton-Emitter HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>CompactDAQ Chassis</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>C Serie Spanningsuitgangsmodule</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263</td><td>Analoge uitgangsmodule</td></tr><tr><td>C Serie Spanningsingangsmodule</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>Analoge ingangsmodule</td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylaat-Gemodificeerd Microsferen, 0,5 &micro;m, rood fluorescent (580/605), 2% vaste stoffen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td><td>kaliberbead</td></tr><tr><td>C++ (Qt) zelfgemaakte optische pincet software</td><td></td><td></td><td>ontwikkeld door Olivier Blanc en Claire Chard&egrave;s. Alternatieve oplossing: labview</td></tr></tbody></table>

indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de drosophila embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morfogenese vereist coördinatie tussen genetische patronen en mechanische krachten krachtig vorm van de cellen en weefsels. Vandaar, is een uitdaging voor een beter begrip morfogenetische direct cellulaire krachten en de te meten mechanische eigenschappen in vivo tijdens de embryogenese. Hier presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, waarmee direct toepassen krachten op cel contacten van het vroege embryo van de Drosophila , terwijl beeldvorming bij een snelheid van verschillende frames per seconde. Deze techniek heeft het voordeel dat het niet nodig de injectie van parels in het embryo, meestal gebruikt als tussenliggende sondes waarop optische krachten worden uitgeoefend. We stap voor stap de uitvoering van de installatie in detail te beschrijven, en voorstellen voor methoden om mechanische informatie extract van de experimenten. Door het toezicht op de verplaatsingen van cel-cel contactpersonen in real time, kan een spanning metingen uitvoeren en cel contacten reologie onderzoeken.

Figuur 5 toont experimentele gegevens die zijn verkregen door het opleggen van een sinusoïdale beweging aan de val. De val produceert een afbuiging van de interface is, zoals door de 3 momentopnamen tonen 3 opeenvolgende interface-posities (figuur 5A)23. Opgenomen films worden gebruikt voor het genereren van een Kymograaf (figuur 5B) en zijn verder geanalyseerd om te bepalen d...

Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in weefselmechanica, zoals hoe eigenschappen van celcelcontacten veranderen in ruimte en tijd tijdens weefselmorfogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zwak invasief is en compatibel is met live beeldvorming zoals lichtplaatmicroscopie. Deze techniek vereist geen injectie van kralen in het weefsel.Meestal gebruikt als demiere sondes waarop froses te krijgen, ik ben opgewonden. Het aantonen van het proces zal Chardes, een ingenieur, en Raphael Clement, onderzoeker van mijn niveau van het terrein. Om te beginnen, het opzetten van een rechte microscoop voor lichtplaat microscopie in de horizontale vlakte, dan bereiden de laser en optica om op te treden als de optische pincet.Vervolgens pijp uit een micro-liter van 500 nanometer tl-kralen in een glazen cuvette, en voeg 10 milliliter gedestilleerd water. Plaats de cuvette in de cuvettehouder onder het doel en pas de focus van het doel aan, zodat het doel het wateroppervlak raakt. Open nu de Integrated Development Environment QT Creator die wordt gebruikt om de acquisitiesoftware te beheren.Open de acquisitiesoftware door de microRheo te openen.

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Het gebrek aan instrumenten voor het meten van de materiaaleigenschappen en spanning parameters in vivo kunnen valideren hun rol tijdens de ontwikkeling. Wij werkzaam atomaire kracht microscopie (AFM) en nanoparticle-tracking te kwantificeren van mechanische functies op de intact zebrafish embryo dooier cel tijdens epiboly. Deze methoden zijn betrouwbaar en breed toepasbaar vermijden opdringerig interventies.

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een verbeterde test voor mechanische nociceptie in Drosophila-larven kan worden uitgevoerd. We gebruiken de test hier om aan te tonen dat mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) bestaat in Drosophila-larven.

Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer celmechanica meten in levende Drosophila-embryo's met behulp van optische pincetten en lichtveldmicroscopie. Deze minimaal invasieve methode maakt real-time meting van spanning en stijfheid mogelijk.

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Meer video's verkennen