Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over integrale membraaneiwitten zoals de oligomeric toestand, hun grootte, algehele vorm en lage resolutie structuur in oplossing. Oplossingsstudies van membraaneiwitten vereisen stabiliserende moleculen zoals detergentia. Deze techniek heeft als voordeel dat het wasmiddelen onzichtbaar maakt en het signaal van het membraaneiwit benadrukt.

De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot vele biologische en medische onderzoeksvragen omdat meer dan 1/3 van de eiwitten zich in membranen bevinden waar ze veel vitale cellulaire functies uitvoeren. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de deuterium-etiketterings- en neutronenverstrooiingsstappen moeilijk te leren zijn omdat zeer weinig instellingen training in deze technieken aanbieden. Om te beginnen bepaal je neutronenverstrooiingslengtedichtheden of SLD's met behulp van de webapplicatie MULCh, modules voor de analyse van contrastvariatiegegevens.

Open de contrastmodule door op contrast in het linkernavigatiedeelvenster te klikken. Geef tekst op voor een projecttitel en voer de onderstaande gegevens in voor twee componenten als subunit één en subunit twee. Voer de moleculaire formule voor elk onderdeel in het tekstvak formule in.

Voer vervolgens het volume in kubieke angstroms voor elk onderdeel in het vak onder het volume. Voer ten slotte de details in voor buffercomponenten. Klik op verzenden om de neutronencontrastberekeningen uit te voeren.

Er wordt een resultatenpagina gegenereerd die een tabel met spreidingslengtedichtheid en contrastmatchpunten biedt, evenals formules voor het bepalen van deze parameters op een bepaald percentage D2O in de buffer. Bekijk de verstrooiingsparameters met bijzondere aandacht voor de contrastpunten van de component. Kweek E.coli cellen die een inducible uitdrukkingsvector voor de doeleiwitopeenvolging in LB-medium herbergen tot een optische dichtheid op 600 nanometer of OD 600 van ongeveer één.

Pas E.coli-cellen aan op deuteriumgelabeld medium voorafgaand aan schaalvergroting voor meer dan expressie van een gedeutereerd eiwit door de LB-cultuur één tot 20 in drie milliliters van minimaal medium te verdunnen. Na het groeien tot een OD 600 van ongeveer een, herhaal de een tot 20 verdunningen met behulp van minimale medium met 50, 75, en 100%D2O. Eenmaal aangepast, blijven groeien van de cultuur in een bioreactor om de opbrengst van deuterated celmassa te verhogen.

Naarmate de D2O-inhoud wordt verhoogd, zullen de groeipercentages afnemen. Overgaan tot het oogsten, lyse en zuiveren van cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Volgende equilibrate een grootte uitsluiting kolom met meer dan twee kolom volumes van de uiteindelijke uitwisseling buffer met behulp van een snelle eiwit vloeistof chromatografie systeem.

Voer na het injecteren van het monster de kolom in isolerende breuken uit die overeenkomen met het eiwit van belang. Reserveer een aliquot van overeenkomende buffer voor kleine hoek neutronenverstrooiing of SANS achtergrond aftrekken. Als u SANS-gegevens wilt verzamelen, laadt u eerst monsters en buffers in kwartscellen.

Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de balksluiter gesloten is, nadert u het monsteromgevingsgebied en plaatst u de kwartscellen in de monsterwisselaar. Neem de positie van de monsterwisselaar voor elke monstercel op. Controleer het gebied en zorg ervoor dat het balkpad vrij is van obstructie voordat u het monsteromgevingsgebied verlaat.

Open vervolgens de balkluik. Voer een tabelscan uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling. Volg de instructies voor de werking van het instrument die door de neutronenverstrooiingswetenschapper wordt verstrekt.

Gebruik Mantid Plot-software en Python-script voor het verminderen van SANS-gegevens van een 2D-afbeelding naar een 1D-plot. Log hiervoor in op het externe analysecluster en voer mantid-plot uit vanaf de opdrachtregel. Open vervolgens het meegeleverde gebruikersreductiescript en plaats de bijbehorende scannummers of identificatie voor het monster in bufferparen in de juiste lijst.

Voer het script uit om minder gegevens te genereren als een tekstbestand met vier kolommen op de opgegeven locatie. Klik met de rechtermuisknop op de juiste werkruimte en Mantid plot en selecteer plot met fouten voor een eerste onderzoek van de verstrooiing profielen. Download de ATSAS-softwaresuite en gebruik PRIMUS voor het plotten van gegevens, bufferschaling en aftrekking en Guinier-analyse.

Start de toepassing ATSAS- en SAS-gegevensanalyse en laad de beperkte gegevensbestanden die overeenkomen met het voorbeeld- en bufferpaar. Als u de buffer goed wilt schalen, selecteert u het gegevensbereik op hoge Q, waarbij beide profielen in flat zijn vergelijkbaar en klikt u op de schaalknop onder het tabblad Bewerkingen. Vergroot het gegevensbereik om alle punten weer te geven, klik op aftrekken om deze bewerking uit te voeren.

Voer een Guinier-analyse uit van de afgetrokken voorbeeldgegevens van de buffer met behulp van het tabblad analyse van de SAS-gegevensanalysetoepassing. Zorg ervoor dat het juiste bestand is geselecteerd in de lijst en klik straal van gyration. Een geautomatiseerde poging om een Guinier fit uit te voeren zal worden verstrekt door te klikken op de automatische RG-knop.

Breid het bereik van de gegevens die worden gebruikt om alle lage Q-gegevens op te nemen en begin met het verkleinen van het gegevensbereik door hoge Q-punten weg te nemen totdat de Q max times RG-limiet lager is dan 1,3. Gebruik de plot met resten om te controleren of gegevens lineair zijn in het geschikte bereik. Breng kleine aanpassingen aan het geschikte gebied aan en controleer de gevoeligheid van deze waarden voor het bereik van gegevens die in de pasvorm worden gebruikt.

Verkrijg de waarschijnlijkheidsverdelingsfunctie P van R in kabouter. Start nu de wizard afstandsverdeling op het tabblad Analyse. Het verkrijgen van een goede pasvorm aan de gegevens is essentieel voor het verkrijgen van een kwaliteitsmodel.

Bepaal Dmax, de maximale interatomaire afstand binnen het molecuul. Schat een waarde voor Dmax door het selectievakje uit te schakelen om Rmax te forceren gelijk aan nul en een grote waarde voor Dmax in te voeren. De eerste X onderschepping in het perceel van P van R levert deze schatting op.

Breng incrementele wijzigingen aan in deze Dmax-waarde en het bereik van gegevens dat wordt gebruikt voor het aantal punten dat wordt gebruikt om de gnome te optimaliseren die past bij de gegevens en de resulterende P van R-curve. Start de wizard PRIMUS-vorm via de dammif-knop op het analysetabblad van SAS-gegevensanalyse en gebruik een handmatige selectie van parameters. Definieer het Guinier-bereik van de pasvorm en ga naar de volgende stap met behulp van de navigatieknoppen.

Definieer geschikte waarden uit het P-plot van R en ga naar de volgende stap. Geef parameters voor het ab initio modelleringsproces. Start vervolgens het proces met behulp van de commit-knop.

Overlay en superimpose de laatste sans envelop met een gerelateerde hoge resolutie model met behulp van supcomb binnen ATSAS. Plaats een kopie van het PDB-model met hoge resolutie dat moet worden aangepast aan de SANS-enveloppe in de werkmap. Voer vervolgens supcomb uit vanaf de opdrachtregel met de PDB-bestandsnamen als twee argumenten met de sjabloonstructuur die eerst wordt vermeld.

Tot slot visualiseren van de ab initio model resultaten met behulp van PyMOL, een 3D moleculaire grafische kijkprogramma. Zodra de SANS-envelop en hoge resolutie structuur zijn bovenop, kunnen deze modellen worden gevisualiseerd met behulp van een moleculaire grafische weergave programma. Er wordt een overzicht van het PyMOL-visualisatieproces getoond.

Zodra de PDB-structuurbestanden in PyMOL zijn geopend, moeten de modellen zichtbaar zijn in het PyMOL-viewervenster. De weergaven van elk model kunnen worden gewijzigd met de S-knop naast elke bestandsnaam. Hier wordt een oppervlaktevertegenwoordiging gebruikt voor de envelop SANS en een beeldverhaalvertegenwoordiging wordt gebruikt voor de eiwitbackbone van het hoge resolutiemodel.

Een geschikt kleurenschema kan worden geselecteerd uit de opties die beschikbaar zijn onder de C-knop. Voor eiwitketens, een kettingboog kleuren biedt een kleurverloop van N naar C eindpunt om interpretatie te helpen. Transparantie wordt toegepast op de oppervlakteweergave om een betere visualisatie van de eiwitstructuur binnen de envelop mogelijk te maken.

Voor publicatieafbeeldingen wordt een witte achtergrond aanbevolen. Zodra deze visualisatiesignalen zijn toegepast, kunnen de 3D-structuren worden onderzocht door op de structuur te klikken en te slepen. Manipulaties van het perspectief en molecuul rotatie en vertaling kan worden uitgevoerd.

Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om het neutronencontrast van de wasmiddelkop- en staartgroepen nauwkeurig te matchen met het D2O H2O-oplosmiddel. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor het verkennen van de structuur van intramembrane asparto proteases. Deze eiwitten zijn betrokken bij de immuunrespons, hepatitis C en de ziekte van Alzheimer.

Vergeet niet dat werken in biochemische laboratoria en in neutronenbundels gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het volgen van alle veiligheidsregels voor de faciliteit en radiologische boekingen zijn verplicht tijdens het uitvoeren van deze procedure.