Name: Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Verken SANS-analyse van membraaneiwitten met contrast-matching wasmiddel en deuteriumlabeling. Deze methode maakt wasmiddelen onzichtbaar en onthult eiwitstructuur, oligomeerstatus en conformatie in oplossing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De Office van biologische en milieuonderzoek in steun voor onderzoek op het Chicago Center voor structurele moleculaire biologie (CSMB) en Bio-SANS met behulp van faciliteiten ondersteund door de wetenschappelijke gebruiker voorzieningen Division, Office of Basic Energy Sciences, ons departement van energie. Ruwbouw op membraaneiwitten in het lab Lieberman werd ondersteund door de NIH (DK091357, GM095638) en de NSF (0845445).

De auteurs Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss en Ryan C. Oliver zijn gecontracteerd door UT-Battelle met ons DOE ter ondersteuning van het Neutron Science gebruikersprogramma en Bio-SANS instrument bij het Oak Ridge National Laboratory gebruikt in dit artikel.
Dit manuscript heeft mede geschreven door UT-Battelle, LLC, onder contract DE-AC05-00OR22725 met de ons Department of Energy (DOE). De Amerikaanse regering behoudt en de uitgever, door het aanvaarden van het artikel voor publicatie, erkent dat de Amerikaanse regering een niet-exclusieve, gestorte, onherroepelijke, wereldwijde licentie behoudt te publiceren of reproduceren van het gepubliceerde formulier van dit manuscript, of toestaan anderen doen, voor de Amerikaanse regering doeleinden. DOE zal zorgen voor toegang tot deze resultaten van federale overheid gesponsorde onderzoek overeenkomstig het Plan bij DOE-toegang van het publiek. 82

Structurele biologie onderzoekers profiteren van aanvullende structurele technieken zoals oplossing verstrooiing verkrijgen van biochemische en structurele informatie (zoals de totale omvang en vorm) van biomoleculen in oplossing. SANS is een bijzonder aantrekkelijk techniek voor het bepalen van de lage resolutie structuren van membraaneiwitten, een kern focus van moderne structurele biologie en biochemie. SANS vereist hoeveelheden van gezuiverde eiwitten die vergelijkbaar zijn met die van kristallografische proeven (1 m...

Membraaneiwitten worden gecodeerd door een naar schatting 30% van alle genen1 en vertegenwoordigen een grote meerderheid van de doelen voor de moderne geneesmiddelen. 2 deze eiwitten voeren een breed scala van vitale cellulaire functies,3 maar ondanks hun overvloed en belang — vertegenwoordigen slechts ongeveer 1% van de totale structuren die zijn neergelegd in de voor structurele Bioinformatics (RCSB) eiwit Collaboratory onderzoek Gegevens Bank. 4 vanwege hun gedeeltelijk hydrofobe aard, structurele bepaling van membraan-gebonden eiwitten is buitengewoon uitdagende. 5 , 6 , 7
Zoals vele biofysische technieken monodispers deeltjes in oplossing voor meting vereisen, isoleren van membraaneiwitten van inheemse membranen en het stabiliseren van deze eiwitten in een oplosbare nabootsen van de inheemse membranen geweest een actief gebied van het onderzoek in de afgelopen decennia. 8 , 9 , 10 deze onderzoeken hebben geleid tot de ontwikkeling van vele nieuwe amfifiele samenstellingen aan membraaneiwitten, zoals nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 solubilize en amphipols. 16 , 17 het gebruik van detergenten micellen blijft echter een van de meest voorkomende en eenvoudige manieren om te voldoen aan de eisen van de oplosbaarheid van een bepaald eiwit. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 helaas geen enkele wasmiddel of magische mengsel van detergentia momenteel bestaat die voldoet aan alle membraaneiwitten; Dus, deze voorwaarden moeten empirisch worden gescreend voor de unieke vereisten van elke proteïne. 26 , 27
Detergentia monteren zelf in oplossing boven hun kritische micel concentratie aan statistische structuren vorm genaamd micellen. Micellen zijn samengesteld uit vele wasmiddel monomeren (meestal variërend van 20-200) met hydrofobe alkyl-ketens vormen een micel kern en hydrofiele kop groepen gerangschikt in een micel shell laag geconfronteerd met de waterige oplosmiddelen. Het gedrag van detergentia en micel vorming is klassiek beschreven door Charles Tanford in The hydrofobe Effect,28 en maten en vormen van micellen van veelgebruikte detergentia in membraan eiwit studies zijn gekenmerkt met behulp van kleine-hoek verstrooiing. 29 , 30 wasmiddel organisatie over membraaneiwitten is ook onderzocht, en de vorming van eiwit-wasmiddel complexen (PDC's) met wasmiddel moleculen rond het eiwit in een rangschikking die lijkt op het keurige wasmiddel wordt verwacht micellen. 31
Een toegevoegd voordeel bij het gebruik van detergentia is dat de resulterende micel eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd door de integratie van andere detergentia. Veel detergenten vertonen ideale mengen, en selecteer Eigenschappen van gemengde micellen kunnen zelfs worden voorspeld op grond van de onderdelen en de verhouding van het mengen. 22 echter de aanwezigheid van wasmiddel kan nog presenteren uitdagingen voor biofysische karakterisaties door bij te dragen aan de algehele signaal. Bijvoorbeeld met x-stralen en lichtverstrooiing technieken is signaal van wasmiddel in de PDC vrijwel niet te onderscheiden van eiwit. 32 onderzoeken met single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) meestal rekenen op gevangen (bevroren) deeltjes; structurele details van het eiwit zijn nog steeds verduisterd door bepaalde wasmiddelen of een hoge concentratie van wasmiddel die wordt toegevoegd aan de achtergrond. 33 alternatieve benaderingen naar het interpreteren van de volledige structuur van de PDC (met inbegrip van het wasmiddel) zijn aangebracht door middel van computationele methoden die willen reconstrueren het wasmiddel rond een bepaald membraan eiwit. 34
Voor het geval van neutronen verstrooiing produceert de rangschikking van de kern-shell van wasmiddel in de micel een form-factor die tot de waargenomen verstrooiing bijdraagt. Gelukkig, kunnen oplossing onderdelen worden gewijzigd, zodat ze niet aan de netto waargenomen verstrooiing bijdragen. Dit proces van "contrast overeenkomende" wordt bereikt door het vervangen van deuterium voor waterstof te bereiken een verstrooiing lengte dichtheid die overeenkomt met de achtergrond (buffer). Een verstandige keuze van wasmiddel (met beschikbare Halfzwaar tegenhangers) en hun verhouding van mengen moeten worden beschouwd. Voor detergentia micellen, kan deze vervanging worden uitgevoerd met een sopje met dezelfde hoofd groep maar met een Halfzwaar alkylketen (d-staart in plaats van h-staart). Aangezien de detergentia goed gemengd zijn,35 hun aggregaten zal een soortelijke massa hebben verstrooiing lengte die is de mol-fractie gewogen gemiddelde van de twee componenten (h vliegengordijn en d vliegengordijn). Wanneer dit gemiddelde contrast consistent met die van de hoofd groep is, kunnen de uniforme statistische structuren gekoppeld worden volledig als u wilt verwijderen van alle bijdragen aan waargenomen verstrooiing.
Wij presenteren hier een protocol om te manipuleren het neutron contrast van wasmiddel micellen door integratie van chemisch identiek wasmiddel moleculen met deuterium-geëtiketteerden alkyl ketens. 19 , 36 , 37 dit toestaat volledige gelijktijdige contrast matching van micel kern en shell, dat een unieke mogelijkheid van neutronen verstrooiing is. 35 , 38 met deze aanzienlijk verfijnd detailniveau, contrast bijpassende kunnen anders onhaalbaar studies van membraan eiwit structuren. Bovendien, kan deze contrast-matching aanpak worden uitgebreid naar andere systemen waarbij wasmiddel, zoals polymeer uitwisseling reacties39 en olie-water dispergeermiddelen,40 of zelfs andere solubilizing agenten, zoals bicelles,41 nanodiscs,42 of blok copolymeren. 43 A vergelijkbare aanpak zoals omschreven in dit manuscript, maar het tewerkstellen van een enkele wasmiddel soorten met gedeeltelijke deuterium substituties op de alkyl-keten en/of hoofd-groep, werd onlangs gepubliceerd. 37 terwijl dit verwacht kan worden dat de willekeurige verdeling van waterstof en deuterium gedurende het wasmiddel verbeteren ten opzichte van de hier gepresenteerde benadering het beperkte aantal beschikbare posities over het wasmiddel voor vervanging en in twee stappen wasmiddel synthese vereist poses extra uitdagingen voor behandeling.
Stap 1 en 2 van het protocol hieronder vaak overlappen omdat eerste experiment plannen gebeuren moet een kwaliteit wijzigingsvoorstel in te dienen. Indiening van het voorstel is echter hier als de eerste stap om te benadrukken dat dit proces ruim van tevoren een neutron experiment moet worden gestart. Ook opgemerkt moet worden dat een vereiste stap, die moet worden aangetoond door het voorstel, is dat de biochemische en fysische karakterisering (met inbegrip van de zuiverheid en stabiliteit) van het monster ter ondersteuning van de noodzaak van studies van de neutron. Een algemene discussie van small-angle neutron verstrooiing (SANS) valt buiten het bestek van dit artikel. Een korte maar grondige inleiding is beschikbaar in het referentiewerk Karakterisering van materialen door Kaufmann,44 en een leerboek gericht op biologische kleine-hoek totaaloplossing verstrooiing is onlangs verschenen. 45 meer aanbevolen lectuur wordt verwezen in de sectie discussie. Kleine hoek verstrooiing gebruikt de zogenaamde verstrooiing vector Q als het centrale aantal dat het proces van de verstrooiing beschrijft. Dit artikel maakt gebruik van de algemeen aanvaarde definitie Q = 4π zonde (θ) / λ, waar θ de helft van de hoek tussen inkomende en verspreide lichtbundel en λ is de golflengte van de neutronenstraling in Angstroms is. Andere definities bestaan dat gebruik verschillende symbolen zoals de ' voor de verstrooiing vector, en die verschillen kunnen met een factor 2π of met behulp van nanometer in plaats van Angstrom (Zie ook bespreking van Figuur 10).

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>labware</td></tr><tr><td>Ammoniumcitraat dibasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Bioflo 310 Bioreactor System</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02025</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>EMD Millipore</td><td>3130</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Kobalt (II) chloride</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Koper (II) sulfaat</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Drierite Gas Purifier</td><td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, dinatrium, dihydraat</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>&Auml;kta Purifier UPC100</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>medium component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17116701</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>Ijzer (III) chloride hexahydraat</td><td>MP Biochemicals</td><td>ICN19404590</td><td>medium component</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Mangan (II) sulfaat monohydraat</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>medium component</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-d25-&beta;-D-maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>medium component</td></tr><tr><td>RC 6 Plus Centrifuge</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>medium component</td></tr><tr><td>Steriele 25mm spuitfilter met 0.2&micro;m PES membraan</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>labware</td></tr><tr><td>Steriele wegwerpflesetje met 0.2&micro;m PES membraan</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>labware</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>Superose-12 10/300 GL column&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10 Cell Density Meter</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>Zinksulfaat monohydraat</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>medium component</td></tr></tbody></table>

contrast-matching wasmiddel in small-angle neutron scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de ab initio

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

De biologische small-angle neutron scattering instrument bij de High-Flux isotoop Reactor van Oak Ridge National Laboratory is gewijd aan het onderzoek van biologische materialen, verwerking biobrandstoffen en bio-geïnspireerde materialen ter bekleding van nanometer te micrometer lengte schalen. De methoden die hier gepresenteerd voor het onderzoek van de fysische eigenschappen (dat wil zeggen, de grootte en vorm) van membraaneiwitten (hier, MmIAP, een intramembrane aspartyl protease vanaf Methanoculleus marisnigri) in oplossingen van micel-vormende wasmiddelen zijn zeer geschikt voor deze small-angle neutron scattering instrument, onder anderen. Andere biofysische karakterisering technieken worden belemmerd door hun onvermogen om aan te pakken van het wasmiddel bijdragen in een complexe structuur van de proteïne-wasmiddel. Daarnaast biedt toegang tot de Bio-Deuteration Lab unieke mogelijkheden voor de voorbereiding van grootschalige teelten en uiten van deuterium-geëtiketteerden eiwitten voor verbeterde verstrooiing signaal van het eiwit. Terwijl dit techniek biedt geen structurele details in hoge resolutie, de structurele kenniskloof voor membraaneiwitten bevat vele adresseerbare onderzoeksgebieden zonder in de buurt van de atomaire resolutie. Bijvoorbeeld, deze gebieden bepaling van oligomere Staten, complexvorming, conformationele wijzigingen tijdens perturbation, en vouwen/ontvouwen evenementen te omvatten. Deze onderzoeken kunnen gemakkelijk worden bereikt door de toepassingen van deze methode.

Een lichtbundel tijd en instrument voorstel moet duidelijk overbrengen van alle informatie die nodig is aan de Commissie ter beoordeling zodat een geldige van de voorgestelde experiment kunnen worden beoordeeld. Communicatie met een NSS is zeer aanbevolen voor onervaren gebruikers. De NSS kan beoordelen eerste haalbaarheid en gids voorstel indienen om te benadrukken van de haalbaarheid, veiligheid en het potentieel voor hoge impact wetenschap. De informatie in het voorstel moet bevatten a...

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over integrale membraaneiwitten zoals de oligomeric toestand, hun grootte, algehele vorm en lage resolutie structuur in oplossing. Oplossingsstudies van membraaneiwitten vereisen stabiliserende moleculen zoals detergentia. Deze techniek heeft als voordeel dat het wasmiddelen onzichtbaar maakt en het signaal van het membraaneiwit benadrukt.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot vele biologische en medische onderzoeksvragen omdat meer dan 1/3 van de eiwitten zich in membranen bevinden waar ze veel vitale cellulaire functies uitvoeren. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de deuterium-etiketterings- en neutronenverstrooiingsstappen moeilijk te leren zijn omdat zeer weinig instellingen training in deze technieken aanbieden. Om te beginnen bepaal je neutronenverstrooiingslengtedichtheden of SLD's met behulp van de webapplicatie MULCh, modules voor de analyse van contrastvariatiegegevens.Open de contrastmodule door op contrast in het linkernavigatiedeelvenster te klikken. Geef tekst op voor een projecttitel en voer de onderstaande gegevens in voor twee componenten als subunit één en subunit twee. Voer de moleculaire formule voor elk onderdeel in het tekstvak formule in.Voer vervolgens het volume in kubieke angstroms voor elk onderdeel in het vak onder het volume. Voer ten slotte de details in voor buffercomponenten. Klik op verzenden om de neutronencontrastberekeningen uit te voeren.Er wordt een resultatenpagina gegenereerd die een tabel met spreidingslengtedichtheid en contrastmatchpunten biedt, evenals formules voor het bepalen van deze parameters op een bepaald percentage D2O in de buffer. Bekijk de verstrooiingsparameters met bijzondere aandacht voor de contrastpunten van de component. Kweek E.coli cellen die een inducible uitdrukkingsvector voor de doeleiwitopeenvolging in LB-medium herbergen tot een optische dichtheid op 600 nanometer of OD 600 van ongeveer één.Pas E.coli-cellen aan op deuteriumgelabeld medium voorafgaand aan schaalvergroting voor meer dan expressie van een gedeutereerd eiwit door de LB-cultuur één tot 20 in drie milliliters van minimaal medium te verdunnen. Na het groeien tot een OD 600 van ongeveer een, herhaal de een tot 20 verdunningen met behulp van minimale medium met 50, 75, en 100%D2O. Eenmaal aangepast, blijven groeien van de cultuur in een bioreactor om de opbrengst van deuterated celmassa te verhogen.Naarmate de D2O-inhoud wordt verhoogd, zullen de groeipercentages afnemen. Overgaan tot het oogsten, lyse en zuiveren van cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Volgende equilibrate een grootte uitsluiting kolom met meer dan twee kolom volumes van de uiteindelijke uitwisseling buffer met behulp van een snelle eiwit vloeistof chromatografie systeem.Voer na het injecteren van het monster de kolom in isolerende breuken uit die overeenkomen met het eiwit van belang. Reserveer een aliquot van overeenkomende buffer voor kleine hoek neutronenverstrooiing of SANS achtergrond aftrekken. Als u SANS-gegevens wilt verzamelen, laadt u eerst monsters en buffers in kwartscellen.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de balksluiter gesloten is, nadert u het monsteromgevingsgebied en plaatst u de kwartscellen in de monsterwisselaar. Neem de positie van de monsterwisselaar voor elke monstercel op. Controleer het gebied en zorg ervoor dat het balkpad vrij is van obstructie voordat u het monsteromgevingsgebied verlaat.Open vervolgens de balkluik. Voer een tabelscan uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling. Volg de instructies voor de werking van het instrument die door de neutronenverstrooiingswetenschapper wordt verstrekt.Gebruik Mantid Plot-software en Python-script voor het verminderen van SANS-gegevens van een 2D-afbeelding naar een 1D-plot. Log hiervoor in op het externe analysecluster en voer mantid-plot uit vanaf de opdrachtregel. Open vervolgens het meegeleverde gebruikersreductiescript en plaats de bijbehorende scannummers of identificatie voor het monster in bufferparen in de juiste lijst.Voer het script uit om minder gegevens te genereren als een tekstbestand met vier kolommen op de opgegeven locatie. Klik met de rechtermuisknop op de juiste werkruimte en Mantid plot en selecteer plot met fouten voor een eerste onderzoek van de verstrooiing profielen. Download de ATSAS-softwaresuite en gebruik PRIMUS voor het plotten van gegevens, bufferschaling en aftrekking en Guinier-analyse.Start de toepassing ATSAS- en SAS-gegevensanalyse en laad de beperkte gegevensbestanden die overeenkomen met het voorbeeld- en bufferpaar. Als u de buffer goed wilt schalen, selecteert u het gegevensbereik op hoge Q, waarbij beide profielen in flat zijn vergelijkbaar en klikt u op de schaalknop onder het tabblad Bewerkingen. Vergroot het gegevensbereik om alle punten weer te geven, klik op aftrekken om deze bewerking uit te voeren.Voer een Guinier-analyse uit van de afgetrokken voorbeeldgegevens van de buffer met behulp van het tabblad analyse van de SAS-gegevensanalysetoepassing. Zorg ervoor dat het juiste bestand is geselecteerd in de lijst en klik straal van gyration. Een geautomatiseerde poging om een Guinier fit uit te voeren zal worden verstrekt door te klikken op de automatische RG-knop.Breid het bereik van de gegevens die worden gebruikt om alle lage Q-gegevens op te nemen en begin met het verkleinen van het gegevensbereik door hoge Q-punten weg te nemen totdat de Q max times RG-limiet lager is dan 1,3. Gebruik de plot met resten om te controleren of gegevens lineair zijn in het geschikte bereik. Breng kleine aanpassingen aan het geschikte gebied aan en controleer de gevoeligheid van deze waarden voor het bereik van gegevens die in de pasvorm worden gebruikt.Verkrijg de waarschijnlijkheidsverdelingsfunctie P van R in kabouter. Start nu de wizard afstandsverdeling op het tabblad Analyse. Het verkrijgen van een goede pasvorm aan de gegevens is essentieel voor het verkrijgen van een kwaliteitsmodel.Bepaal Dmax, de maximale interatomaire afstand binnen het molecuul. Schat een waarde voor Dmax door het selectievakje uit te schakelen om Rmax te forceren gelijk aan nul en een grote waarde voor Dmax in te voeren. De eerste X onderschepping in het perceel van P van R levert deze schatting op.Breng incrementele wijzigingen aan in deze Dmax-waarde en het bereik van gegevens dat wordt gebruikt voor het aantal punten dat wordt gebruikt om de gnome te optimaliseren die past bij de gegevens en de resulterende P van R-curve. Start de wizard PRIMUS-vorm via de dammif-knop op het analysetabblad van SAS-gegevensanalyse en gebruik een handmatige selectie van parameters. Definieer het Guinier-bereik van de pasvorm en ga naar de volgende stap met behulp van de navigatieknoppen.Definieer geschikte waarden uit het P-plot van R en ga naar de volgende stap. Geef parameters voor het ab initio modelleringsproces. Start vervolgens het proces met behulp van de commit-knop.Overlay en superimpose de laatste sans envelop met een gerelateerde hoge resolutie model met behulp van supcomb binnen ATSAS. Plaats een kopie van het PDB-model met hoge resolutie dat moet worden aangepast aan de SANS-enveloppe in de werkmap. Voer vervolgens supcomb uit vanaf de opdrachtregel met de PDB-bestandsnamen als twee argumenten met de sjabloonstructuur die eerst wordt vermeld.Tot slot visualiseren van de ab initio model resultaten met behulp van PyMOL, een 3D moleculaire grafische kijkprogramma. Zodra de SANS-envelop en hoge resolutie structuur zijn bovenop, kunnen deze modellen worden gevisualiseerd met behulp van een moleculaire grafische weergave programma. Er wordt een overzicht van het PyMOL-visualisatieproces getoond.Zodra de PDB-structuurbestanden in PyMOL zijn geopend, moeten de modellen zichtbaar zijn in het PyMOL-viewervenster. De weergaven van elk model kunnen worden gewijzigd met de S-knop naast elke bestandsnaam. Hier wordt een oppervlaktevertegenwoordiging gebruikt voor de envelop SANS en een beeldverhaalvertegenwoordiging wordt gebruikt voor de eiwitbackbone van het hoge resolutiemodel.Een geschikt kleurenschema kan worden geselecteerd uit de opties die beschikbaar zijn onder de C-knop. Voor eiwitketens, een kettingboog kleuren biedt een kleurverloop van N naar C eindpunt om interpretatie te helpen. Transparantie wordt toegepast op de oppervlakteweergave om een betere visualisatie van de eiwitstructuur binnen de envelop mogelijk te maken.Voor publicatieafbeeldingen wordt een witte achtergrond aanbevolen. Zodra deze visualisatiesignalen zijn toegepast, kunnen de 3D-structuren worden onderzocht door op de structuur te klikken en te slepen. Manipulaties van het perspectief en molecuul rotatie en vertaling kan worden uitgevoerd.Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om het neutronencontrast van de wasmiddelkop- en staartgroepen nauwkeurig te matchen met het D2O H2O-oplosmiddel. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor het verkennen van de structuur van intramembrane asparto proteases. Deze eiwitten zijn betrokken bij de immuunrespons, hepatitis C en de ziekte van Alzheimer.Vergeet niet dat werken in biochemische laboratoria en in neutronenbundels gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het volgen van alle veiligheidsregels voor de faciliteit en radiologische boekingen zijn verplicht tijdens het uitvoeren van deze procedure.

contrast-matching-detergent-small-angle-neutron-scattering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van de structuur en dynamiek van twee modeleiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke gezondheid. De techniek combineert bench-top biofysische karakterisering met neutronenspinechospectroscopie om toegang te krijgen tot de dynamiek op tijd- en lengteschalen die relevant zijn voor eiwitinterdomeinbewegingen.

Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Deze studie beschrijft de procedure voor het reconstitueren van het membraaneiwit TWIK-gerelateerd zuurgevoelig K+ -kanaal 2 (Task2) in nanodiscs. De succesvolle assemblage werd bevestigd door single-particle cryo-elektronenmicroscopie, die goed gedefinieerde tweedimensionale klassegemiddelden opleverde.

Een techniek voor het stabiliseren van membraaneiwitten in nanodiscs

Verken SANS-analyse van membraaneiwitten met contrast-matching wasmiddel en deuteriumlabeling. Deze methode maakt wasmiddelen onzichtbaar en onthult eiwitstructuur, oligomeerstatus en conformatie in oplossing.

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio (Video) | JoVE Journal

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Meer video's verkennen