Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie
August 6th, 2018
Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.
Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische assemblage van eiwitcomplexen in verschillende pH-omgevingen te observeren met behulp van biolayer interferometrie en de componenten te bevestigen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Het identificeren en begrijpen van de specificiteit die de vorming en assemblage van eiwitcomplexen bepaalt, is van groot belang voor biochemisch onderzoekers. De methodologie waar we het vandaag over hebben, stelt onderzoekers in staat om voorspelde macromoleculaire complexen te assembleren, visualiseren en valideren.
De complexe aard van het biosensoroppervlak stelt onderzoekers vervolgens in staat om gemakkelijk geassembleerde complexen vrij te geven in kleine microvolumes voor elektronenmicroscopie en massaspectrometrie analyse. In deze demonstratie volgden we de kinetiek van pH-geïnduceerde structurele herschikkingen van het anthrax toxine complex en bevestigden deze herschikkingen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie methoden, terwijl we aggregatie vermijden. Het demonstreren van de anthrax toxine assemblage op het BLI biosensoroppervlak, macro monster vrijgave en EM-negatief kleuringsprocedures zullen Alexandra Machen en Pierce O'Neil zijn, afstudeerstudenten van mijn laboratorium.
Dr. Antonio Artigues is essentieel bij het analyseren en identificeren van de door BLI vrijgegeven micromonsters, met behulp van de Orbitrap Fusion Lumos massaspectrometer. Om te beginnen, hydrateert u een amine reactieve tweede generatie BLI biosensor tip door deze te onderdompelen in 250 microliter water en incubeert deze gedurende 10 minuten. Programmeer in de Blitz software de stap tijden zoals vermeld in deze tabel.
Start de BLI run door de biosensor tip 30 seconden in 250 microliter water te onderdompelen om een initiële baseline van biosensor dikte en dichtheid te meten. Activeer vervolgens de biosensor door de tip gedurende zeven minuten in 250 milliliter 50 millimolair NHS en 200 millimolair EDC te onderdompelen. Onderdompel vervolgens de geactiveerde biosensor in 50 millimolair PDEA opgelost in 0,1 molair boraat buffer, pH 8,5, gedurende vijf minuten om een geactiveerd bioreactief oppervlak te genereren.
Dompel nu de geactiveerde bioreactieve biosensor vijf minuten lang in 250 microliter van een oplossing die 100 nanomolair E126C LFn bevat in 10 millimolair natriumacetaat pH vijf, 100 millimolair natriumchloride buffer. Dompel de LFn tip vier minuten lang in 50 millimolair L-cysteïne, 1 molair natriumchloride, 0,1 molair natriumacetaat pH vijf om eventuele resterende vrije thiolerende groepen te dempen. Nadat u de gekwelde LFn tip in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride hebt ondergedompeld om een buffer baseline vast te stellen, dompelt u de tip gedurende vijf minuten in 0,5 micromolair beschermend antigeen prepore, 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride om het LFn PA-prepore complex te creëren.
Zodra PA-prepore geassocieerd is, verwijdert u de tip uit de PA-prepore oplossing en dompelt u de tip gedurende 30 seconden in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride om eventuele niet-specifiek gebonden PA-prepore weg te spoelen. Dompel het LFn PA-prepore complex gedurende vijf minuten in 0,5 micromolair CMG2 in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride. Dompel het LFn PA-prepore CMG2 complex gedurende 30 seconden in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride om eventuele ongebonden CMG2 weg te spoelen om een pre-endosomal complex te vormen.
Voor EM-analyse, zet het LFn PA-prepore CMG2 complex vrij van de biosensor tip door de tip in een PCR buis te dompelen die vijf microliter 50 millimolair DTT, 50 millimolair Tris en 50 millimolair natriumchloride bevat. Voor tandem MS-analyse van de peptiden uit het complex, zet het LFn PA-prepore CMG2 complex vrij van de biosensor tip door de biosensor in een PCR buis te dompelen die vijf microliter 50 millimolair DTT, zes molair keratinevrije guanidinehydrochloride en 25 millimolair ammoniumbicarbonaat, pH acht bevat. Om het complex na pH-transitie te bekijken, monteer het LFn PA-prepore CMG2 complex op de biosensor, zoals zojuist is gedemonstreerd.
Dompel de biosensor tip vijf minuten lang in 10 millimolair acetaat pH vijf om de overgang van PA-prepore naar PA-pore te initiëren. Deze overgang wordt aangegeven door een toenemende amplitude, gevolgd door een grotere amplitudedaling die wordt verondersteld substantieel te zijn voor volledige receptordissociatie als gevolg van verminderde bindingsaffiniteit. Voor EM-analyse, dompelt u de biosensor tip vijf minuten lang in een oplossing die 1,25 millimolair micellen bevat, om aggregatie in oplossing na disulfiedvrijlating te voorkomen.
Om negatieve kleuring elektronenmicroscopie uit te voeren, begint u door een koolstof gecoat koper 300 raster bij 0,38 mbar stabiele atmosfeer druk en min 15 milliamps gedurende 20 seconden te ontladen, en vervolgens het apparaat met lucht te ontluchten. Bevestig het raster tussen een paar schone pincetten. Pipet vervolgens vier microliter van het vrijgegeven complex monster op het raster en laat adsorptie gedurende 60 seconden toe.
Wikt met een filterpapier wig het resterende vocht weg. Kleur vervolgens het raster door vijf microliter 0,75% punt nul twee micron gefilterd uranylformiaat erop te pipetten en wikt na vijf seconden de overtollige kleur weg. Laat het raster op kamertemperatuur drogen terwijl het bedekt is.
Gebruik vervolgens de transmissie-elektronenmicroscoop om het monster te bekijken. Ten slotte, na het voorbereiden van monsters voor massaspectrometrie volgens het tekstprotocol, bedient u de massaspectrometer met behulp van CID en een genormaliseerde botsingsenergie van 35 onder automatische controle om continu één MS-scan uit te voeren, gevolgd door zoveel mogelijk tandem MS-MS scans in een periode van drie seconden. De BLI sensogram trace is een real-time uitlezing van de amplitude veranderingen als gevolg van de specifieke toevoeging van de anthrax toxine componenten.
De eerste stijging is LFn lading op de tip. Na het dempen en baseline, bindt PA-prepore aan LFn, gevolgd door de toevoeging van oplosbaar CMG2, wat resulteert in het geassembleerde pre-endosomale complex. Het complex wordt vervolgens
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het monitoren van de samenstelling en ontbinding van het anthrax toxine met behulp van biolayer interferometrie (BLI). De methodologie maakt het mogelijk om eiwitcomplexen te visualiseren en te identificeren door middel van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie.
Belangrijkste Onderdeel van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Structuurbiologie
- Eiwitdynamiek
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitcomplexformatie is cruciaal voor biochemisch onderzoek.
- Biolayer interferometrie biedt een platform voor real-time observatie van eiwitinteracties.
- Elektronenmicroscopie en massaspectrometrie zijn essentieel voor het valideren van complexe structuren.
- Het anthrax toxine dient als model voor het bestuderen van eiwitassemblagedynamiek.
Doel van het Onderzoek
- Om de dynamische samenstelling van eiwitcomplexen onder verschillende pH-condities te observeren.
- Om de componenten van het anthrax toxinecomplex te bevestigen met behulp van geavanceerde beeldtechnieken.
- Om het begrip van de specificiteit in eiwitcomplexformatie te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Biolayer interferometrie voor het monitoren van samenstelling/ontbindingskinematica.
- Elektronenmicroscopie voor de visualisatie van eiwitcomplexen.
- Massaspectrometrie voor de identificatie van complexe componenten.
- Gecontroleerde pH-omgevingen om structurele herschikkingen te bestuderen.
Belangrijkste Resultaten
- De succesvolle samenstelling van het anthrax toxinecomplex werd aangetoond.
- Real-time monitoring van structurele overgangen werd bereikt.
- Elektronenmicroscopie bevestigde de structurele integriteit van vrijgekomen complexen.
- Massaspectrometrie leverde een gedetailleerde identificatie van complexe componenten op.
Conclusies
- Het protocol bewaakt effectief de dynamiek van eiwitcomplexen.
- Het combineren van BLI met EM en MS biedt een uitgebreide analyse van eiwitinteracties.
- Deze methodologie kan worden toegepast op andere eiwitcomplexen voor soortgelijke studies.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time monitoring of pH-induced protein complex assembly and disassembly, providing critical insights into target validation and mechanistic de-risking for toxin-based therapeutic development. By combining label-free BLI with EM and MS, it supports predictive confidence in early discovery by confirming complex identity and structural transitions under disease-relevant conditions. The approach addresses a key discovery inflection point: verifying that predicted macromolecular interactions occur with correct stoichiometry and environmental responsiveness before advancing to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by validating the assembly of specific protein complexes under controlled pH conditions that mimic endosomal environments.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of binding kinetics and complex stability, reducing mechanistic ambiguity in toxin-receptor interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming whether toxin components engage receptors with expected affinity shifts upon acidification, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by releasing defined complexes into microliter volumes suitable for structural and compositional analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential, easy-to-replicate procedures that yield quantifiable BLI sensogram traces correlating with complex formation.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse, as the BLI biosensor surface can be regenerated and reused for multiple rounds of complex assembly and release.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by modeling anthrax toxin endosomal transition, a mechanism applicable to other bacterial toxins and viral entry proteins.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural and compositional verification of complexes before and after pH transition.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by using EM and MS to confirm complex identity and receptor dissociation, reducing false positives in downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through real-time complex monitoring.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by allowing researchers to assemble, visualize, and validate predicted macromolecular complexes in a controlled, label-free format.
- Screening: Describes assay readiness through the release of assembled complexes into microvolumes for EM and MS analysis, ensuring reproducibility and quantitative output.
- Analytics: Highlights measurements such as BLI amplitude changes, EM density patterns, and MS peptide coverage (e.g., 60.46% for LFn, 67.97% for PA, 54.15% for CMG2 in pre-endosomal complexes) that enable teams to compare conditions and confirm complex integrity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by confirming structural transitions (e.g., prepore to pore) and compositional changes (e.g., loss of CMG2 signal post-acidification) that mirror endosomal events.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability, noting that the BLI biosensor surface can be regenerated and the release protocol adapted to other pH-sensitive protein systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein complex formation, and confirmation of structural dynamics under disease-relevant conditions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of complex assembly and release procedures across runs and laboratories.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency through early de-risking, and reduced late-stage biological failure by validating complex behavior before investment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed complex assembly, pH responsiveness, and component identity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biolayer interferometry, protein labeling and coupling, and interpretation of real-time binding kinetics.
- Dependent on instrumentation including BLI systems, transmission electron microscopes, and high-resolution mass spectrometers (e.g., Orbitrap Fusion Lumos).
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, pH shift timing, and release protocols to ensure consistent complex recovery for EM and MS.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other model systems, particularly regarding biosensor surface chemistry and stability of complexes under acidic or micelle-containing conditions.
- Includes practical limitations such as the need to prevent aggregation post-release (addressed by micelle inclusion) and the requirement for sufficient complex stability during transfer to analysis platforms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:28
Assembly of Prepore Anthrax Toxin Complex on a PDEA-modified Amine Reactive Biosensor Surface
4:37
Assembly of Pore Anthrax Toxin Complex on PDEA-modified Amine Reactive Biosensor Surface
5:26
Identification of Released Macromolecular Assemblies from BLI Biosensors by Negative Stain Electron Microscopy and Mass Spectrometry
6:50
Results: Analysis of Dynamic Protein Complexes by Biolayer Interferometry, Electron Microscopy, and Mass Spectrometry
8:29
Conclusion
