Name: Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer hoe je eiwitcomplexen analyseert met biolayer interferometrie, elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Deze methode volgt de dynamische assemblage van toxines in verschillende pH-omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Madison en Lila zelf Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomedisch onderzoek opleiding programma (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU overbruggen van fondsen en de Biomolecuul interactie technologieën Center (BITC) Grant ( CT en MTF). De auteurs bedank Barbara Fegley KUMC elektronenmicroscopie kern voor hulp bij TEM Beeldacquisitie.

1. assemblage van gedefinieerde macromoleculaire complexen op Biolayer Interferometry (BLI) Biosensor oppervlakken
<ol><li>
Vergadering van prepore miltvuur toxine complex op een amine PDEA gemodificeerde reactieve biosensor oppervlak
	<ol>
<li>Hydrateer een amine reactieve tweede generatie (AR2G) BLI biosensor tip in 250 µL van water gedurende tien minuten.</li>
		<li>Stap tijden, vermeld in tabel 1, op de controle van de eenheid BLI software Program (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Start de BLI gerund door het onderdompelen van de biosensor tip in 250 µL water voor 30 s voor het meten van een eerste basislijn van biosensor dikte en dichtheid.</li>
		<li>De biosensor activeren door de tip onder te dompelen in 250 µL 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) en 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) voor 7 minuten.</li>
		<li>Dompel de geactiveerde biosensor in 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) opgelost in 0,1 M boraat buffer (pH 8,5) gedurende 5 minuten voor het genereren van een geactiveerde thiol-reactief oppervlak.</li>
		<li>De geactiveerde thiol-reactieve biosensor onderdompelen in 250 µL oplossing met 100 nM E126C LFN in 10 mM natrium acetaat pH 5.0, 100 mM NaCl, buffer voor 5 minuten.</li>
		<li>Dompel de LFN tip in 50 mM L-cysteïne, 1 M NaCl, 0,1 M Natriumacetaat, pH 5.0, 4 minuten, om eventuele resterende reactieve gratis thiol-reactieve groepen quench.</li>
		<li>Dompel de gehard LFN tip in 50 mM Tris, 50 mM NaCl gedurende 2 minuten om buffer basislijn.</li>
		<li>Dompel de gehard LFN tip in 0,5 µM beschermende antigeen prepore (PAprepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl voor 5 minuten om te maken de LFN-PAprepore complex.</li>
		<li>Eenmaal PAprepore is gekoppeld, het uiteinde van de PAprepore oplossing verwijderen en de tip onderdompelen in 50 mM Tris, 50 mM NaCl gedurende 30 seconden naar het wegwassen van alle niet-specifiek gebonden PAprepore.</li>
		<li>Dompel de LFN-PAprepore complex in 0,5 µM CMG2 receptor (zonder de transmembrane domein), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, voor 5 minuten.</li>
		<li>Dompel de LFN-PAprepore -CMG2 complex in 50 mM Tris, 50 mM NaCl gedurende 30 seconden om weg te wassen niet-afhankelijke CMG2 naar formulier pre-endosomal complex.</li>
		<li>EM p.a., laat de LFN-PAprepore-CMG2 complex uit de biosensor tip door de tip onder te dompelen in 5 µL van 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, binnen een PCR-buis.</li>
		<li>Voor tandem MS analyse van de peptiden van het complex, laat de LFN-PAprepore-CMG2-complex van de biosensor tip door de biosensor onder te dompelen in 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratine-vrij), 25 mM Ammoniumbicarbonaat pH 8,0 binnen een PCR tube . Dit wordt uitgevoerd op een verschillende biosensor dan degene die worden gebruikt voor analyse van de EM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vergadering van porie miltvuur toxine complex op PDEA gemodificeerde amine reactieve biosensor oppervlak
	<ol>
<li>Om weer te geven het complex na de overgang van de pH, stappen 1.1.1-1.1.12 uitvoeren in de vorige sectie voor het genereren van de LFN-PAprepore-CMG2 complex.</li>
		<li>Dompel de biosensor tip in een 10 mM acetaat pH 5.0 voor 5 minuten tot de overgang van de PA-prepore PAporie overgang. Deze overgang wordt aangegeven doordat de amplitude (ongeveer 0,2 nm) gevolgd door een grotere daling van de amplitude die hypothetische is om ingrijpende be- of volledige receptor dissociatie wijten aan verminderde bindende affiniteit.</li>
		<li>Onderdompelen LFN-PAporie tip in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, gedurende 30 seconden om het zure buffer afwassen.</li>
		<li>Voor de EM analyse steekproef, dompel de biosensor tip in een oplossing met 1.25 mM micellen (2.5 mM MSP1D1, 25 mM nb-cholate, 162.5 mM POPC) gedurende 5 minuten om te voorkomen dat samenvoeging in oplossing na bisulfide release.</li>
		<li>EM p.a., release de LFN-PAporie -micel complex uit de biosensor tip door de tip onder te dompelen in 5 µL van 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl binnen een PCR-buis.</li>
		<li>Voor tandem MS analyse van de peptiden van het complex, de LFN-PApoore complexe (geen micel) uit de biosensor tip door de biosensor onder te dompelen in 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratine-vrij), 25 mM Ammoniumbicarbonaat pH 8,0 binnen een PCR buis. Dit wordt uitgevoerd op een verschillende biosensor dan degene die worden gebruikt voor analyse van de EM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. visualiseren en valideren vrijgegeven macromoleculaire assemblages van BLI biosensoren door negatieve vlek elektronenmicroscopie
<ol><li>Gloed kwijting een koolstof-gecoate Cu 300 raster. Typische gloed geen kwijting instellingen zijn 0.38 mBar stabiele atmosfeer druk, negatieve 15 mAmps, 20 seconden, vervolgens ontluchting met lucht.</li>
	<li>Veilige raster tussen een paar schone pincet.</li>
	<li>Pipetteer 4 µL van vrijgegeven complexe monster in PCR buis op het raster en adsorptie voor 60s toestaan.</li>
	<li>Pit weg resterende vloeistof met een filtreerpapier wig.</li>
	<li>Vlek het raster door pipetting 5 µL van 0,75% 0,02 micron gefilterd uranyl formate en wicking weg overtollige vlek na 5 seconden. Toestaan raster te drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bekijk gebeitst monster rasters met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.</li>
</ol>3. identificatie van Anthrax op volledige toxine van de Pre-endosomal Complex (LFN-Paprepore-CMG2) en Transitioned complexe (LFN-Paporie zonder CMG2) met behulp van spectrometrie van de massa.
<ol><li>Verdun 20 µL vrijgegeven monsters en incubeer gedurende 1 uur.</li>
	<li>Voeg 2 µL van iodoacetamide van 55 mM, 25 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8,0 en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in donker (bedekt met aluminiumfolie).</li>
	<li>Verdun het monster met 100 µL van 25 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8.0, om de guanidine hydrochloride concentratie minder dan 1 M.</li>
	<li>Voeg 5 µL van rang bewerkt trypsine op 20 ng/µL sequencing en Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Ijsazijn toevoegen om een eindconcentratie van 5% om de pH op < 3, vervolgens het volume te verlagen tot 10 µL in vacuüm concentrator.</li>
	<li>Breng de peptide oplossing aan de monster-plaat op de autosampler van de uHPLC nLC 1200.</li>
	<li>Laden 5 µL de peptide-oplossing op een uHPLC reversed-phase kolom gemonteerd op het podium van ionisatie van de MS.</li>
	<li>Was de kolom met 15 µL van 0,1% mierenzuur met een maximale snelheid van 5 µL/min en/of maximale druk van 800 psi.</li>
	<li>Elueer peptiden uit de reversed-phase C18-kolom op een debiet van 350 nL/min gedurende 90 min met behulp van een lineaire verloop van 5% tot 40% van oplosmiddel B in A + B (oplosmiddel A: 0,1% mierenzuur; oplosmiddel B: 95% acetonitril met 0,1% mierenzuur).</li>
	<li>Analyseren eluerende peptiden op regel met behulp van tandem MS.<ol>
<li>De ionisatie-bron ingesteld op 2500 Volt en ion overdracht temperatuur tot 250 ° C.</li>
		<li>Werken de massaspectrometer onder automatische controle voortdurend één MS scan gevolgd door zoveel tandem MSMS mogelijk gedurende een 3 s, uit te voeren met behulp van de CID en een genormaliseerde botsing energie van 35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificeren van peptide en proteïne onderdelen met behulp van standaard methoden. Voor dit werk, werden twee sets van peptide en proteïne analyse uitgevoerd.</li>
</ol>

<ol><li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li>
<li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS%3A+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li>
<li>Pall. BLI Technology. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fortebio.com/bli-technology.html">http://www.fortebio.com/bli-technology.html</a> (2018).</li>
<li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+anthrax+toxin+pore%3A+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li>
<li>Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+periplasmic+production+of+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+%28G-CSF%29+in+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens.</a> Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABRF-MIRG+benchmark+study%3A+Molecular+interactions+in+a+three-component+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li>
<li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li>
<li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li>
<li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA%5BTitle%5D)+AND+%22Site-Specific+Protein+Labeling%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).</li>
<li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li>
<li>Bandyopadhyay, A., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminoboronate-based+peptide+cyclization+that+responds+to+pH%2C+oxidation%2C+and+small+molecule+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).</li>
<li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li>
<li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Tomography%3A+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li>
</ol>

Geen informatie op dit moment.

Deze demonstratie ziet u hoe macromoleculaire complexvorming kan gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van biolayer interferometrie, gevisualiseerd met behulp van EM, en gecontroleerd met MS, allemaal met microvolumes in een korte tijdsspanne. Structurele montage en waargenomen complexen volgen de biologisch relevante voorspellingen, deze gecombineerde methodologie verder te valideren. Zoals vermeld in het gedeelte ' resultaten ', vereist het belangrijkste element voor het succes van de vergadering rationeel gemanipuleerde cysteïne mutagenese om ervoor te zorgen dat de complexe eiwit-eiwitinteractie interfaces goed georiënteerde uit de buurt van het oppervlak van de biosensor.
Eerdere systemen hebben BLI en MS-technieken gebruikt voor het evalueren van de binding aan eiwitten van twee en drie componentsystemen en integriteit van receptor binden van uitgedrukt eiwit, maar in beide gevallen, de methoden werden niet ontwikkeld om te profiteren van de tandem EM/MS 8,9te benaderen. Het alleen andere interferometrie systeem dat MS analyse om te helpen met het karakteriseren van interacties gecombineerd was een dual-polarisatie interferometrie10. Helaas, dit systeem is niet langer beschikbaar voor algemeen gebruik. Zoals vermeld in de inleiding, zijn er een aantal studies voltooid waar monsters werd opgericht op SPR-achtige biosensor oppervlakken en verwijderd uit MS analyse. Geen van deze voorbeelden resulteerde in complexen gevisualiseerd met behulp van EM.
De beperkingen van deze opeenvolgende methode kunnen talrijke maar oplosbaar zijn. Voor de eerste immobilisatie en daarom Stichting stap van de vergadering, zou een gebrek aan kennis van de structurele interactie oppervlakken zeker vooruitgang die is gekoppeld aan het toezicht van eerste montage fasen belemmeren. Het gebrek aan informatie van de structuur kan worden aangepakt door het ontwerpen van een gemanipuleerde Stichting bouwen waar bijlage chemicaliën (bijvoorbeeld sulfaatzuurstof groep voor bisulfide verbanden / zijn-gelabeld positionering) kunnen worden verplaatst naar de verschillende regio's binnen de kern montage systeem. In het geval van de bloedzweer toxine complexe had het geluk dat de structuur van LFN gebonden aan PAprepore beschikbaar11 is. Rationele plaatsing van de gemanipuleerde cysteïne was gelokaliseerd aan regio's van de PAprepore bindende gezicht af. Met cysteïne koppeling Doorgaan is het beter dat geen andere reactieve cysteines op het oppervlak van het eiwit aanwezig zijn.
Er zijn verschillende bijlage chemicaliën die kunnen worden gebruikt om specifieke site op de oppervlakken van een eiwit. Een van de populairste specifieke bijlagen gaat positionering van een groep van biotine op een specifiek gedefinieerde locatie op de oppervlakte van eiwit12. Helaas, Biotine binding aan een streptavidine of avidin gecoate oppervlakken is vrij krap. Omkering van de bindende interactie is niet eenvoudig. Het gebruik van een gemanipuleerde zijn-tag op de N - of C-terminus en het verdere gebruiksgemak gehechtheid aan Ni-NTA oppervlakken is een meer universele toepassing van affiniteit immobilisatie. Natuurlijk, is een van de waarschuwingen voor engineering vergadering bijlage sites met zijne-gelabeld systemen de eis dat de N - en C-termini van het core vergadering eiwit blijven blootgesteld en gescheiden zodat de bijlage eenvoudig is. Als met alle assemblage processen, moet de interface van de interactie van de kern vergadering eiwit beschikbaar blijven als het complexe vergadering vordert.
Misschien is de meest voorkomende zorg van het gebruik van biosensor oppervlakte chemicaliën aspecifieke bindend. Daar tips zijn vaak een bron van aanzienlijke niet-specifieke bindende gevolgen. Bisulfide gekoppeld Biotine kan worden gebruikt om zeer specifieke complexen weggaand achter de verminderde S-Biotine koppeling strak gebonden aan geïmmobiliseerdet daar biosensoren13vrij te geven. Er zijn andere omkeerbare oplossingen steeds beschikbaar zoals iminoboronates en aan een mindere mate ketoamide14. Dit veld is momenteel onderontwikkeld, maar er is van groot belang voor de verdere ontwikkeling van omkeerbare covalente protocollen om te voorkomen dat af-target drug toxiciteitseffecten die vaak gepaard gaan met het gebruik van covalente gerichte Geneesmiddelenontwikkeling.
Een beperking van het gebruik van EM te visualiseren complexen is interpretatie, vooral in gevallen waar de structuren van de geassembleerde complexen zijn niet in eerste instantie bekend. De ruimtelijke locatie van componenten binnen een ongedefinieerde geassembleerde macromoleculaire complex kan worden geïdentificeerd met behulp van monoklonale antilichamen (mAb) als specifieke kinetische en structurele markers. Bijvoorbeeld, zodra een complex wordt gevormd, kunnen monoklonale antilichamen worden toegevoegd die aan specifieke componenten binden. Deze methode wordt het vaak gebruikt in EM om specifieke onderdelen binnen grote verzamelingen15te identificeren. Een andere beperking is gerelateerd aan de grootte van het complex, al zijn er gevallen waar gedefinieerde symmetrische vergaderingen zo klein als 70 kDa (GroES heptamer) zijn gemakkelijk met behulp van opgelost negatieve vlek EM. Geassembleerde complexen die zijn geanalyseerd door EM zijn meestal in de groottewaaier van ~ 100 Å diameter of hoger. Onlangs echter eiwitten zo klein als 20 kDa zijn opgelost en lage resolutie structuren zijn verkregen bij het gebruik van superieure methodologieën16kleuring.
Voor MS-analyse, kan de verhoogde gevoeligheid van huidige MS instrumentatie tot op het niveau van de femtomolar (attomoles) in sommige gevallen de gevoeligheid van BLI detectie verhogen. Het is zeer denkbaar dat eiwit signalen die aantonen dat een minimale maar herhaalbare stijging van de amplitudes leiden identificatie van het eiwit in kwestie tot zal. Bovendien, indringende eiwit-eiwitinteractie met één van de partners die zijn gekoppeld aan de biosensor en de andere in een cellulaire milieu zal in feite leiden tot een zuivering en vervolgens eenvoudiger detectie van het nieuw gevormde complex. Een beperking die kan worden waargenomen met de huidige systemen voor hooggevoelige MS is dat de proteïne van belang kan niet in de database, maar deze constatering zeldzaam is (bv . de proteomes van zeldzame soorten). Als de proteïnes van belang bekend zijn, wordt dit probleem gemakkelijk opgelost door de expressie gebrachte eiwitten aminozuur volgorde in een achtergrond eiwit database (zoals beschreven in dit werk in de sectie protocol). Een andere mogelijke beperking van de resultaten van de methodologie van de weerstand van een eiwit aan trypsinolysis. Spijsvertering van de trypsine is meestal de standaardmethode voor bottom-up eiwit identificatie. Eiwitten kunnen echter resistent tegen trypsine als ze Arg en Leie residuen missen of toegang tot deze residuen worden beperkt door de gevouwen structuur. Deze beperkingen zijn opgelost, respectievelijk door het gebruik van alternatief of een combinatie van proteasen of met inbegrip van een zich ontwikkelende reagens gebruikt wordt (ureum of guanidine HCl, zoals aangegeven in 1.1.14 en 1.2.6) voor enzymatische spijsvertering.
Mogelijke uitbreidingen van deze methodologie opnemen waarmee de gebruiker te volgen en identificeren van cellulaire vergadering complexen van ruwe cellulaire lysates. Het blijkt dat de testen voor montage onderdelen in geconcentreerde extracten van de cellulaire is gemakkelijk uit te voeren met behulp van de biolayer interferometrie procedures. In tegenstelling tot de meer algemeen gebruikte microfluidic gebaseerd methodologieën die naar voren gebogen tot verstopping en gevoelig voor aggregatie, kan de BLI benadering worden gebruikt om te dompelen direct biolayer sensor tips in grove extracten potentieel direct monteren specifieke complexen uit deze geconcentreerde onzuiver monsters. Eenmaal gemonteerd, is het volledig haalbaar met specifiek antilichaam sondes als follow-up van het BLI systeem nader te identificeren en kwantificeren zelfs verdachte componenten in cellulaire extracten die werden geïdentificeerd met behulp van de methode microvolume MS. Nogmaals, de sleutel is hier is het gebruik van gedefinieerde, goed georiënteerde kern eiwitten zoals specifieke affiniteit sondes.
Mogelijkheden voor het weergeven van de prepore om het overgangsproces kinetisch met BLI porie zullen zeer nuttig in het identificeren van potentiële "anti-toxine" klein molecuul remmers van de eiwit-overgangen die specifiek onder laat endosomal, lage pH (5.0 werken) voorwaarden. Deze pH geïnduceerde prepore aan de porie van overgang in het bijzijn van de stabilisator (osmolytes) vouwen zoals glycerol of sacharose wordt geremd, en dus leent krachtige steun voor de ontwikkeling van de specifieke gerichte opvouwbare stabilisatoren die voorkomen PA datporie vorming. Deze specifieke aanpak voorkomt en vervangt ruwe aggregatie gebaseerde testen waar pH druppels leiden tot eiwit neerslag. Deze laatste methode, leidt hoewel goed voor primaire prescreening methoden, vaak tot vals-positieve resultaten waar specifieke verbindingen remmen de samenvoeging in plaats van de werkelijke moleculaire overgangen.
De downstream opmerkingen van de structuur en identificatie van de individuele geassembleerde componenten binnen kleine microvolume monsters kunnen ook nuttig zijn bij het valideren van potentiële loodverbindingen. Dit kan worden toegepast in gevallen waarin specifieke vergadering stabilisatie of destabilisatie het resultaat van de doelgroep is. Deze parallelle aanpak van kinetische/structuur/identificatie is handig voor het direct bevestigen van de geldigheid van de samengestelde effectoren vermoedelijke voorsprong van vergadering en dient als een redelijke secundaire screening stap of middellange doorvoer aanpak.
Cryo-EM is een nuttige techniek aan de studie van de atomaire details van macromolecule complexen in verschillende staten van vergadering. Voorafgaand aan de voorbereiding van cryo-EM monsters, is het belangrijk eerst controleren of dat een preparaat bevat redelijk zuivere homogene complexen met negatieve vlek EM. De hier vermelde werk toont vergadering van eiwitcomplexen op BLI biosensor oppervlakken, vrijlating van deze complexen voor EM visualisatie, en de identificatie van deze onderdelen met behulp van MS. Deze bijzondere methode van gecontroleerde vergadering en release kunnen nuttig zijn bij het genereren van zeer specifieke protocollen die homogene sequentiële monstervoorbereiding voor negatieve vlek EM, een noodzakelijke stap die moet worden aangetoond voordat bevorderen om te verbeteren Cryo-EM. Met het oog op een lage resolutie 3D-structuur, zou slechts 30-50 deeltjes van complex nodig zijn voor het uitvoeren van een reeks van conische tilt (70 verschillende 2D-afbeelding meningen per deeltje) mits er verscheidenheid van oriëntatie (meerdere verschillende meningen is).
Met betrekking tot het verbeteren van de MS-methoden, blijven voorschotten in gevoeligheid en vermindering van monstervolume verbeteren. Nano stromen en ultra hogedruk-vloeistofchromatografie samen met de ontwikkeling van massaspectrometers met een snel recht fiets, verhoogde gevoeligheid en oplossen van macht. Recente introductie van de orbitrap massa spectrometer, met name de nieuwste versie (orbitrap Fusion Lumos, en de verwachte opvolger van de Orbitrap Fusion Lumos 1M), evenals de zoektocht algoritmen sterk vergemakkelijken dit proces.
De huidige methode controleert de kinetische montage en demontage van miltvuur toxine componenten met behulp van label-vrije BLI methodologieën en resulteert in de structuur en de identiteit van deze componenten met behulp van EM en MS, respectievelijk. Het gebruik van een eenvoudige enkellijns BLI systeem in combinatie met routine negatieve kleuring EM analyse en elementaire MS technieken zijn meer dan voldoende te karakteriseren van een assemblage proces.

Identificeren en inzicht in de specificiteit bestuur eiwit complex vergadering in vivo is van extreem belang voor biochemische onderzoekers. Grote heterogene eiwit assemblages zijn de norm in plaats van de uitzondering. Dit begrip wordt ondersteund door spectroscopische monitoring van in vivo assemblage, complexen met behulp van zachter cel verstoring technieken, producten van zuivering affiniteit gebaseerde methoden evalueren en visualiseren ze isoleren met behulp van hoge resolutie Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM). Om de controle op de specificiteit van de vergadering binnen de cel te begrijpen, moeten onderzoekers routinematig isoleren, identificeren en uiteindelijk het karakteriseren van deze dynamische montage/demontage structuren. De meest intensief gebruikte moleculaire hulpmiddel om identificatie van de bestanddelen van deze vergaderingen vaak vereist antilichaam gebaseerde immunoprecipitation, die gebaseerd is op het behoud van de complexe stabiliteit tijdens de verstoring van de cel. Verschillende gekoppelde analytische technieken werden onlangs ontwikkeld om het vangen van complexen van celsteekproeven met behulp van de microfluidic gebaseerde benaderingen, zoals oppervlakte plasmon resonantie (SPR). Na verwijdering van de SPR oppervlakken, deze monsters werden geanalyseerd door laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie tijd voor vlucht (MALDI-TOF)1,2. Bevordering van deze methode met behulp van eenvoudiger protocollen kunnen onderzoekers te visualiseren en te valideren voorspelde complexen die zich in de cellulaire milieu voordoen. Aangezien SPR een microfluidics-gebaseerd systeem is, problemen vaak uit statistische formatie. Omzeilen van dit probleem vereist monsterverdunning, die op zijn beurt, de integriteit van concentratie aansprakelijk biologische complexen kan afnemen.
Een relatief recente vooruitgang in label-vrije technologieën is de ontwikkeling van de biolayer interferometrie (BLI) systeem3. Deze bijzondere licht-gebaseerde reflectiecoëfficiënt systemen repliceren, of beste emuleren, SPR bindende en kinetische uitslagen op een fractie van de kosten3,4 vooral als enkellijns eenheden worden gebruikt. BLI meet veranderingen in de gereflecteerde licht interferentie tussen een referentielaag (controle) en het biolayer oppervlak (experimenteel). De resulterende wijzigingen in fase wordt gemeten in real-time als een kinetische en kwantitatieve uitlezing5. De biosensor oppervlak, met specifieke immobilisatie chemicaliën, wordt fysiek tussen oplossingen, in tegenstelling tot de buffer wijzigingen door microfluidic benaderingen in SPR, voor meting via golflengte fase verlegging overgebracht. Massaoverdracht effecten worden voorkomen door schudden van de oplossing. In tegenstelling tot SPR zijn deze systemen zeer nuttig bij de beoordeling van de complexen van ruwe biologische monsters. De fysieke parameter gemeten tijdens BLI experimenten voornamelijk is afhankelijk van een verandering in de massa of de dikte aan de biosensor oppervlakte die uit eiwit complex montage of demontage voortvloeit.
Deze fiber optic biosensoren zijn makkelijk te gebruiken en relatief goedkoop. Een van de opkomende nuttige aspecten van BLI is de facile verwijdering van nieuw gemonteerde eiwitcomplexen van het oppervlak. Een recente toepassing van deze methode toegestaan ons laboratorium te observeren de real-time kinetiek van grootschalige pH geïnduceerde proteïne-omlegging van de structuur van de bloedzweer toxine beschermende antigeen (PA) component zoals de prepore (PAprepore) naar overgestapt haar porie (PAporie) vorm. Deze overgang op de biosensor tip was geverifieerd met behulp van elektronenmicroscopie (EM)6. Verwijdering van complexen van biosensor oppervlakken vermijdt groter volume verdunning effecten vaak opgetreden wanneer het vrijgeven van complexen van chip oppervlakken bij het gebruik van microfluidics systemen.
In het huidige werk, zijn miltvuur toxine complexen gemonteerd en gedemonteerd aan de biosensor oppervlakte en vervolgens vrijgelaten in microliter volumes. De resulterende complexe componenten zijn gevalideerd orthogonaal met behulp van EM en massaspectrometrie (MS).

<table><tbody><tr><td>(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)</td><td>GE Lifesciences</td><td>BR100058</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL zwarte microtubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688304-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 50 &mu;m x 150mm, C18, 2 &mu;m, 100 &Aring;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164561</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher</td><td>A38SL-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Amine-reactieve 2e generatie (AR2G) tips</td><td>Forte Bio</td><td>18-5092</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Fisher</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Anotop 10 spuitfilter, 0,02um</td><td>GE Lifesciences</td><td>6809-1002</td><td></td></tr><tr><td>BLItz Systeem</td><td>Pall Forte Bio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Morphogenic Gene-2</td><td></td><td></td><td>In huis geproduceerd en gezuiverd eiwit</td></tr><tr><td>Koper bekleed met koolstof 300 raster</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CF300-CU-50</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT25</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>JT Baker</td><td>0129-01</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinehydrochloride (GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505-100G</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>MP-BioMedicals,LLC</td><td>100-351</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-cystiene hydrochloride hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800-5G</td><td></td></tr><tr><td>Letale Factor N-terminale domein</td><td></td><td></td><td>In huis geproduceerd en gezuiverd eiwit</td></tr><tr><td>MS software versie 2.2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>090M14531V</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR-buizen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easiGlow glodischarge-reinigingssysteem</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Beschermende Antigen prepore</td><td></td><td></td><td>In huis geproduceerd en gezuiverd eiwit</td></tr><tr><td>Kwalitatieve filterpapierkringen</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-795C 5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine van sequencingkwaliteit, gemodificeerd</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sequest HT-zoekmachine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat trihydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcholaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Uranylformiaat (UF)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30487</td><td></td></tr></tbody></table>

analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit biolayer interferometrie biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo eiwitten zijn vaak onderdeel van grote macromoleculaire complexen waar bindende specificiteit en dynamiek uiteindelijk functionele uitgangen dicteren. In dit werk, is de pre-endosomal bloedzweer toxine geassembleerd en overgestapt naar de complexe endosomal. Ten eerste is het domein van de N-terminal van een mutant letale factor van cysteïne (LFN) gekoppeld aan een biosensor interferometrie (BLI) biolayer via bisulfide-koppeling in een optimale oriëntatie, zodat beschermende antigeen (PA) prepore te binden (Kd 1 nM). De optimaal georiënteerde LFN-PAprepore complex dan bindt aan oplosbare capillaire morfogenisch gen-2 (CMG2) cel oppervlakte receptor (Kd 170 pM), resulterend in een representatieve miltvuur pre-endosomal complex, stabiel bij pH 7.5. Geassembleerde appartementencomplex is vervolgens onderworpen aan de vertegenwoordiger van de verzuring (pH 5.0) van de late endosome milieu om de overgang van de PA-prepore in de staat van de porie membraan ingevoegd. Deze PAporie staat resulteert in een verzwakte binding tussen de CMG2 receptor en de LFN-PAporiën en een aanzienlijke dissociatie van CMG2 uit de porie van overgang. De thio-bijlage van LFN aan de biosensor oppervlakte is gemakkelijk ongedaan gemaakt door de dithiothreitol. Korting op het oppervlak van de biosensor BLI releases de LFN-PAprepore-CMG2 ternaire complex of het zuur overgestapt LFN-PAporie complexen in microliter volumes. Vrijgegeven complexen zijn dan gevisualiseerd en geïdentificeerd met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Deze experimenten laten zien hoe om te controleren de kinetische montage/demontage van specifieke eiwitcomplexen met behulp van label-vrije BLI methodologieën en evalueren van de structuur en de identiteit van deze BLI complexen geassembleerd door elektronenmicroscopie en massa Spectrometrie van, respectievelijk, met behulp van gemakkelijk-te-repliceren sequentiële procedures.

De mogelijkheid om te controleren en valideren van de vergadering van grote macromoleculaire complexen is een cruciale stap gezet naar inzicht in de specificiteit en de functionaliteit van grote biomoleculaire assemblages. De resultaten van de hier vermelde methoden aantonen het gemak met welke grote eiwitcomplexen (> 150 kDa massa) kan worden gemonteerd met behulp van biolayer interferometrie, allen terwijl het toezicht op de kinetiek en de amplitude van de vergadering. De unieke compacte aard van het oppervlak van de biosensor maakt een analyse van de vergadering worden uitgebreid door het vrijgeven van geassembleerde complexen in kleine microvolumes. Deze microvolumes kan worden gebruikt om te visualiseren de eerste fysieke structuur van de complexen met behulp van EM en om te controleren of de identiteit van de complexe onderdelen met behulp van MS. Een schematisch overzicht van dit hele proces is afgebeeld in Figuur 1.
Een sleutelelement voor de geslaagde vergadering en verificatie van macromoleculaire complex aan de biosensor oppervlakte omvat de juiste stand van het eerste zaad-eiwit. Dit zorgt ervoor dat de eiwit-eiwit interactie sites toegankelijk, niet sterically geblokkeerd en optimaal gepositioneerd weg van het biosensor oppervlak zijn. Zoals blijkt uit Figuur 2, de juiste stand van de complexe anthrax-toxine wordt bereikt met behulp van een speciaal aangelegde N-terminale fragment van letale factor (LFN) zodat de LFN-PAprepore bindende site wordt altijd gepositioneerd tegenovergestelde van de biosensor covalente bijlage site6,7. De verdere opbouw van het complex met binding voor PA aan de LFN BLI biosensor gevolgd door oplosbare CMG2 bindend aan PA maakt uiteindelijk een translocatie bevoegde miltvuur toxine complex.
De BLI sensogram trace is een real-time lezen uit de amplitude-veranderingen als gevolg van specifieke toevoeging van de bloedzweer toxine componenten zoals ze zijn toegevoegd aan de biosensor. Figuur 3 toont die een representatieve trace gecombineerd met een model van het complex voorspeld vorm op die stap in het proces. De eerste opkomst is LFN laden op de tip. Na blussen en basislijn, PAprepore vervolgens bindt aan LFN , gevolgd door de toevoeging van oplosbare CMG2 receptor resulterend in het complex van de geassembleerde pre-endosomal van LFN-PAprepore-CMG2. Om naar het laat endosome milieu, is het gehele complex onderworpen aan een lage pH-puls (pH 5.0) die de receptor binden, waardoor de prepore om de overgang naar de uitgebreide membraan ingevoegd porie conformatie verzwakt. 6 Sensogram sporen van de verzuring stap worden weergegeven in Figuur 4. De eerste verhoging of 'spike' in amplitude is waarschijnlijk de porie uitbreiding6 die vóór de daling in de CMG2 receptor binding plaatsvinden moeten. De grotere daling van de amplitude is waarschijnlijk ingrijpende be- of volledige receptor dissociatie als gevolg van verminderde bindende affiniteit. Vorige werk in dit laboratorium aangegeven CMG2 binding aan het volledig uitgebreide PAporie is te verwaarlozen in vergelijking met de CMG2-PAprepore interactie6. Bovendien, de sensogram kinetische trace, waargenomen in alle sensograms van LFN-PAprepore-CMG2 overgang naar LFN-PAporie met een daling van de pH, over meerdere punten reproduceerbaar is.
Voorafgaand aan en na de verzuring, zijn de biosensor aangesloten complexen gemakkelijk uitgebracht voor visualisatie door negatieve vlek EM en identificatie door MS (Figuur 5). Representatieve complexen van de EM-resultaten worden weergegeven in Figuur 6. Pre-endosomal monster rasters, Toon dichtheden consistent met intact ternaire complexen bestaande uitN-PA LFprepore-CMG2. Na verzuring complexe rasters, Toon PA overgestapt om porie en ontbindend door micel opname met geen voor de hand liggende CMG2 dichtheid.
De identiteit van de pre- en post verzuring complexen zijn geverifieerd door MS. Een database waar de sequenties van PA, P13423; LFN, P15917; en CMG2, P58335 werden opgenomen in een achtergrond van een muis eiwitten database afgeleid van het NCBInr archief. Alleen de eiwitten van belang werden verkregen uit deze eerste database opzoeking, met de volgende aminozuur dekking voor de ternaire en binaire complexen: 54% en 22% voor PA, 36% en 6% voor LF en 43% voor CMG2, respectievelijk (CMG2 is niet aangetroffen op de binaire complex). Om te maximaliseren de eiwit aminozuur dekking, werd een tweede peptide/eiwit identificatie uitgevoerd met behulp van een eiwit-database met alleen de drie proteïnen van belang. Pre-endosomal MS monsters bevat peptiden van alle drie toxine componenten met 60.46% en 67.97% 54.15% dekking voor LFN, PA en CMG2, respectievelijk (Figuur 7). Post-endosomal resultaten, getoond in Figuur 8, bevatte slechts peptiden van LFN en PA (57.41% en 67.79% dekking, respectievelijk). Het ontbreken van CMG2 in de post-endosomal monsters stroken met de waargenomen BLI nm daling tijdens de formatie van de porie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> Figuur 1. Schematisch overzicht voor analyse van eiwitcomplexen op gemonteerd en geïsoleerd van BLI biosensor gebruik EM en MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> Figuur 2. Biosensor activering: eerste stap in richting specifieke vergadering op BLI biosensor. Het domein E126C letale Factor N-terminal (LFN) is gekoppeld door middel van een thio-koppeling maken het goed georiënteerde PAprepore bindende interface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> Figuur 3. Controle van miltvuur toxine montage en demontage met BLI: de sensogram amplitude wijzigingen als een functie van de tijd als gevolg van specifieke toevoeging van de bloedzweer toxine worden onderdelen weergegeven wanneer ze worden toegevoegd aan de biosensor beginnen met het laden van de LFN (stap 4 in Tabel 1). PAprepore wordt vervolgens geladen op het oppervlak, gevolgd door de toevoeging van oplosbare CMG2 receptor. De geassembleerde pre-endosomal-complex bestaat uit een LF-PAprepore- CMG2. Om naar het laat endosome milieu, monteren de volledige functionele miltvuur toxine wordt onderworpen aan een lage pH-pulse (pH 5.0) dat de receptor binden verzwakt, waardoor de prepore om de overgang naar de uitgebreide membraan ingevoegd porie bevleesdheid. Blootstelling van het membraan spanning porie is bevestigd en ontbindend door toevoeging van micellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> Figuur 4. BLI sensogram van CMG2 release: sporen van de verzuring stap Toon een eerste verhoging of 'spike' in amplitude gevolgd door een grotere daling van de amplitude die waarschijnlijk porie vorming en receptor dissociatie, respectievelijk. Verticale gestippelde rode lijnen duiden begin van een nieuwe stap. Sensograms zijn uitgelijnd op de vette gestippelde rode lijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> Figuur 5. Analyseren van eiwitcomplexen op gemonteerd en geïsoleerd van BLI biosensor gebruik EM en MS: Biosensor aangesloten complexen gemakkelijk 5 µL van buffer met DTT vrijkomen voor visualisatie door negatieve vlek EM en identificatie door MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om in te Bekijk een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> Figuur 6. Visualisatie van eiwitcomplexen met EM: Pre-endosomal monster rasters, Toon dichtheden consistent met intact ternaire complexen bestaande uitN-PA LFprepore-CMG2. Post-endosomal complex rasters, Toon PA overgestapt om porie en ontbindend door micel met geen voor de hand liggende CMG2 dichtheid. Modellen van de voorspelde complexen (linkerzijde) zijn op dezelfde schaal als individuele deeltjes komt te staan. Deeltjes ingekleurd met voorspelde eiwit (gebaseerd op de grootte van EM dichtheid) staan hieronder elk deeltje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> Figuur 7. Verificatie van eiwitcomplexen met MS: Pre-endosomal MS monsters bevat peptiden van alle drie toxine componenten met 60.46% en 67.97% 54.15% dekking voor LFN, PA en CMG2, respectievelijk. Peptiden gedetecteerd tempo een valse ontdekking (FDR) gelijk of hoger dan 5% komt te staan in het geel, FDR gelijk of hoger dan 1% in het groen weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> Figuur 8. Verificatie van eiwitcomplexen met MS: Post-endosomal monsters bevat peptiden van LFN en PA (57.41% en 67.79% dekking, respectievelijk), maar niet CMG2. FDR gelijk of hoger dan 5% komt te staan in het geel, FDR gelijk of hoger dan 1% in het groen weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Tijd (s)</td>
			<td>Beschrijving</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>Eerste basislijn</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>Activering</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>Activering</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN laden</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>Cysteïne demping</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>Basislijn</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>PAprepore vereniging</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>Basislijn</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 vereniging</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>Basislijn</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>Zure overgang</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>Basislijn</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>Micel vereniging</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Stap tijden voor single BLI rijden naar vergadering miltvuur toxine complex. Merk op dat basislijnen worden gebruikt voor niet-afhankelijke eiwitten uit de vorige stap weg te wassen en/of leg een basislijn voor nieuwe buffer vast.

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische assemblage van eiwitcomplexen in verschillende pH-omgevingen te observeren met behulp van biolayer interferometrie en de componenten te bevestigen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Het identificeren en begrijpen van de specificiteit die de vorming en assemblage van eiwitcomplexen bepaalt, is van groot belang voor biochemisch onderzoekers. De methodologie waar we het vandaag over hebben, stelt onderzoekers in staat om voorspelde macromoleculaire complexen te assembleren, visualiseren en valideren.De complexe aard van het biosensoroppervlak stelt onderzoekers vervolgens in staat om gemakkelijk geassembleerde complexen vrij te geven in kleine microvolumes voor elektronenmicroscopie en massaspectrometrie analyse. In deze demonstratie volgden we de kinetiek van pH-geïnduceerde structurele herschikkingen van het anthrax toxine complex en bevestigden deze herschikkingen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie methoden, terwijl we aggregatie vermijden. Het demonstreren van de anthrax toxine assemblage op het BLI biosensoroppervlak, macro monster vrijgave en EM-negatief kleuringsprocedures zullen Alexandra Machen en Pierce O'Neil zijn, afstudeerstudenten van mijn laboratorium.Dr. Antonio Artigues is essentieel bij het analyseren en identificeren van de door BLI vrijgegeven micromonsters, met behulp van de Orbitrap Fusion Lumos massaspectrometer. Om te beginnen, hydrateert u een amine reactieve tweede generatie BLI biosensor tip door deze te onderdompelen in 250 microliter water en incubeert deze gedurende 10 minuten. Programmeer in de Blitz software de stap tijden zoals vermeld in deze tabel.Start de BLI run door de biosensor tip 30 seconden in 250 microliter water te onderdompelen om een initiële baseline van biosensor dikte en dichtheid te meten. Activeer vervolgens de biosensor door de tip gedurende zeven minuten in 250 milliliter 50 millimolair NHS en 200 millimolair EDC te onderdompelen. Onderdompel vervolgens de geactiveerde biosensor in 50 millimolair PDEA opgelost in 0,1 molair boraat buffer, pH 8,5, gedurende vijf minuten om een geactiveerd bioreactief oppervlak te genereren.Dompel nu de geactiveerde bioreactieve biosensor vijf minuten lang in 250 microliter van een oplossing die 100 nanomolair E126C LFn bevat in 10 millimolair natriumacetaat pH vijf, 100 millimolair natriumchloride buffer. Dompel de LFn tip vier minuten lang in 50 millimolair L-cysteïne, 1 molair natriumchloride, 0,1 molair natriumacetaat pH vijf om eventuele resterende vrije thiolerende groepen te dempen. Nadat u de gekwelde LFn tip in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride hebt ondergedompeld om een buffer baseline vast te stellen, dompelt u de tip gedurende vijf minuten in 0,5 micromolair beschermend antigeen prepore, 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride om het LFn PA-prepore complex te creëren.Zodra PA-prepore geassocieerd is, verwijdert u de tip uit de PA-prepore oplossing en dompelt u de tip gedurende 30 seconden in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride om eventuele niet-specifiek gebonden PA-prepore weg te spoelen. Dompel het LFn PA-prepore complex gedurende vijf minuten in 0,5 micromolair CMG2 in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride. Dompel het LFn PA-prepore CMG2 complex gedurende 30 seconden in 50 millimolair Tris, 50 millimolair natriumchloride om eventuele ongebonden CMG2 weg te spoelen om een pre-endosomal complex te vormen.Voor EM-analyse, zet het LFn PA-prepore CMG2 complex vrij van de biosensor tip door de tip in een PCR buis te dompelen die vijf microliter 50 millimolair DTT, 50 millimolair Tris en 50 millimolair natriumchloride bevat. Voor tandem MS-analyse van de peptiden uit het complex, zet het LFn PA-prepore CMG2 complex vrij van de biosensor tip door de biosensor in een PCR buis te dompelen die vijf microliter 50 millimolair DTT, zes molair keratinevrije guanidinehydrochloride en 25 millimolair ammoniumbicarbonaat, pH acht bevat. Om het complex na pH-transitie te bekijken, monteer het LFn PA-prepore CMG2 complex op de biosensor, zoals zojuist is gedemonstreerd.Dompel de biosensor tip vijf minuten lang in 10 millimolair acetaat pH vijf om de overgang van PA-prepore naar PA-pore te initiëren. Deze overgang wordt aangegeven door een toenemende amplitude, gevolgd door een grotere amplitudedaling die wordt verondersteld substantieel te zijn voor volledige receptordissociatie als gevolg van verminderde bindingsaffiniteit. Voor EM-analyse, dompelt u de biosensor tip vijf minuten lang in een oplossing die 1,25 millimolair micellen bevat, om aggregatie in oplossing na disulfiedvrijlating te voorkomen.Om negatieve kleuring elektronenmicroscopie uit te voeren, begint u door een koolstof gecoat koper 300 raster bij 0,38 mbar stabiele atmosfeer druk en min 15 milliamps gedurende 20 seconden te ontladen, en vervolgens het apparaat met lucht te ontluchten. Bevestig het raster tussen een paar schone pincetten. Pipet vervolgens vier microliter van het vrijgegeven complex monster op het raster en laat adsorptie gedurende 60 seconden toe.Wikt met een filterpapier wig het resterende vocht weg. Kleur vervolgens het raster door vijf microliter 0,75% punt nul twee micron gefilterd uranylformiaat erop te pipetten en wikt na vijf seconden de overtollige kleur weg. Laat het raster op kamertemperatuur drogen terwijl het bedekt is.Gebruik vervolgens de transmissie-elektronenmicroscoop om het monster te bekijken. Ten slotte, na het voorbereiden van monsters voor massaspectrometrie volgens het tekstprotocol, bedient u de massaspectrometer met behulp van CID en een genormaliseerde botsingsenergie van 35 onder automatische controle om continu één MS-scan uit te voeren, gevolgd door zoveel mogelijk tandem MS-MS scans in een periode van drie seconden. De BLI sensogram trace is een real-time uitlezing van de amplitude veranderingen als gevolg van de specifieke toevoeging van de anthrax toxine componenten.De eerste stijging is LFn lading op de tip. Na het dempen en baseline, bindt PA-prepore aan LFn, gevolgd door de toevoeging van oplosbaar CMG2, wat resulteert in het geassembleerde pre-endosomale complex. Het complex wordt vervolgens

analyzing-dynamic-protein-complexes-assembled-on-released-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Dit protocol combineert massafotometrie met een nieuw microfluïdica-systeem om eiwit-eiwitinteracties met een lage affiniteit te onderzoeken. Deze aanpak is gebaseerd op de snelle verdunning van sterk geconcentreerde complexen in oplossing, wat metingen met een lage affiniteit mogelijk maakt en de toepasbaarheid van massafotometrie verbreedt.

Analyse van de vorming van eiwitcomplexen bij micromolaire concentraties door microfluïdica te koppelen aan massafotometrie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Leer hoe je eiwitcomplexen analyseert met biolayer interferometrie, elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Deze methode volgt de dynamische assemblage van toxines in verschillende pH-omgevingen.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen