Productie en visualisatie van bacteriële Spheroplasts en protoplasten te karakteriseren antimicrobiële Peptide lokalisatie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van antimicrobiële peptiden over de vraag of peptiden zich lokaliseren of transloceren door het celmembraan. Het gebruik van sféroplasten en protoplasten maakt de visualisatie en analyse van peptidelokalisatie mogelijk in een fysiologisch relevant modelsysteem zonder de resolutieproblemen die worden ondervonden bij bacterieëel celbeeldvorming. Hoewel deze methode inzicht kan geven in antimicrobiële peptiden, kan deze ook worden toegepast op andere membraanactieve agentia zoals celpenetrerende peptiden.

Gram-negatieve E.coli sféroplasten en gram-positieve B.megaterium protoplasten moeten worden bereid in een biologisch veiligheidskabinet of laminare stromingshaak met behulp van geschikte steriele techniek. Indien gewenst, kunnen bacteriestammen een antibioticaresistent plasmide bevatten, en sféroplasten en protoplasten kunnen worden bereid op een open labbank. In deze video worden sféroplasten en protoplasten bereid op een open labbank met behulp van antibioticaresistent bacteriestammen.

Om een overnachtscultuur op te zetten, gebruikt u een steriele micropipettip om een enkele bacteriekolonie van een vaste agarcultuurplaat over te brengen naar een 14 milliliter cultuurbuis, die twee tot drie milliliter drie procent trypticase sojabrood, TSB, bevat voor een incubatie van 16 tot 21 uur bij 37 graden Celsius met schudden. Om Gram-negatieve E.coli sféroplasten te bereiden, verdunt u de overnachtscultuur in een verhouding van een op honderd, en 25 milliliter TSB in een 250 milliliter kolf, en plaatst u de bacteriën terug in de schudende incubator voor nog eens 2,5 uur. Wanneer de oplossing een optische dichtheid van 0,5 tot 0,8 heeft bereikt bij 600 nanometer, verdunt u de cultuur in een verhouding van een op tien in verse TSB in een nieuwe 250 milliliter kolf voor een tweede incubatie van 2,5 uur met een uiteindelijke effectieve concentratie van 60 microgram per milliliter cefalexine.

Om enkelcellige filamenten van ongeveer 50 tot 150 micrometer lang te produceren, zoals gevisualiseerd onder een lichtmicroscoop bij een 1000x vergroting. Centrifugeer de bacterieoplossing om de filamenten te oogsten en gooi het supernatant weg. Was de filamenten met de voorzichtige toevoeging van één milliliter 0,8 molair sucrose, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.

Na een minuut gooit u het supernatant weg zonder de pellet te verstoorden en voegt u de aangegeven reagentia in hun respectieve volgorde toe aan de filamenten. Na tien minuten bij kamertemperatuur, voegt u geleidelijk één milliliter oplossing A toe gedurende een minuut, terwijl u de oplossing voorzichtig met de hand laat ronddraaien. Incubeer de oplossing gedurende vier minuten bij kamertemperatuur en verdeel vervolgens de filamentensuspensie in twee gelijke delen tussen twee 15 milliliter conische buizen met zeven milliliter oplossing B van vier graden Celsius. Vervolgens worden de filamenten gepelleteerd door centrifugatie en wordt een assyriologische pipet gebruikt om voorzichtig alle oplossing te verwijderen, behalve een tot twee milliliter van het supernatant zonder de pellets te verstoorden.

Gebruik een p1000 micropipet om de pellets voorzichtig op te schorsen. Controleer een kleine aliquot van het monster op sféroplastvorming door lichtmicroscopie. De sféroplast kan vervolgens worden bewaard bij min 20 graden Celsius gedurende maximaal een week of totdat ze drie invriescycli hebben doorlopen.

Om gram-positieve B.megaterium protoplasten te bereiden, verdunt u de overnachtsbacteriecultuur in een verhouding van een op duizend in 100 milliliter drie procent TSB in een 250 milliliter kolf voor een incubatie van 4,5 uur bij 37 graden Celsius met schudden. Wanneer de vloeibare cultuur een optische dichtheid van 0,9 tot 1,0 bereikt bij 600 nanometer, verdeelt u de bacteriën tussen twee 50 milliliter conische buizen voor hun centrifugatie en gebruikt u een assyriologische pipet om de supernatanten af te zuigen. Breng de pellets opnieuw op in 2,5 milliliter protoplastmedium per buis en trek de suspensie in een enkele conische buis voor cultuur in een 125 milliliter kolf.

Voeg één milliliter van vijf milligram per milliliter lysozyme toe aan de cultuur voor een incubatie van één uur bij 37 graden Celsius met schudden. Controleer de groei van de protoplast onder de lichtmicroscoop en noteer eventuele onregelmatigheden, zoals bacteriën die eruitzien als gezwollen staven in plaats van sferen. Aan het einde van de incubatie, brengt u de suspensie over naar een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie en brengt u de pellet opnieuw op in vijf milliliter protoplastmedium.

De protoplast kan vervolgens worden bewaard bij min 20 graden Celsius gedurende maximaal een week of totdat ze drie invriescycli hebben doorlopen. Voor visualisatie van de sféroplast of protoplast brengt u vijf microliter van de suspensie van belang over op een met Poly L Lysine beklede glazen plaat, gevolgd door twee microliter fitc-gelabeld 100 tot 200 micromolar antimicrobieel peptide of AMP. Na een drie minuten incubatie beschermd tegen licht, voegt u één microliter van een geschikte membraandode toe aan het monster voor een verdere drie minuten incubatie in het donker.

Aan het einde van de incubatie bedekt u de gelabelde sféroplast of protoplast met een glazen deksel en verzegelt u het deksel met nagellak. Om de cellen af te beelden, zet u de confocale microscoop aan en geschikte laser aan en selecteert u het 63x objectief, en gebruikt u vervolgens de geschikte beeldvormingssoftware om acht bit 512 bij 512 samengestelde Z stack-beelden te verkrijgen, bestaande uit 0,5 micrometer plakken van de volledigheid van elke bacteriecel van belang. Om de lokalisatie van het fluorescerend gelabelde AMP te visualiseren, opent u de samengestelde Z stack-beelden in een geschikt beeldvormingsanalyseprogramma en lokaliseert u de middelste plak van de eerste sféroplast of protoplast van belang.

Plaats één cirkelvormige regio van belang van 0,3 micrometer diameter op het membraan, één in het midden van de cel en één weg van de cel om de achtergrondfluorescentie te meten, waarbij u ervoor zorgt geen verzadigde pixels te vermijden. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit in elke re