Name: Productie en visualisatie van bacteriële Spheroplasts en protoplasten te karakteriseren antimicrobiële Peptide lokalisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer de productie van E. coli spheroplasten en B. megaterium protoplasten om antimicrobiële peptidelokalisatie te visualiseren. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van membraaninteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIH-NIAID) award R15AI079685.

1. oplossing voorbereiding
Opmerking: Bereiden oplossingen beschreven in stap 1.1 – 1,9 en 1,8 – 1.11 om te produceren van E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten, respectievelijk.
<ol><li>Bereiden van 1 M Tris-Cl, pH 7,8 door ontbinding 10.34 Tris HCl en 4.17 g van Tris OH in 50 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid een (20 mM MgCl2, 0,7 M sacharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8)-oplossing door het oplossen van 0,10 g MgCl2 (95.2 g/mol) en 11.98 g sacharose (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Voeg 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) en het volume op 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid de oplossing B (10 mM MgCl2, 0,8 M sacharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) door het oplossen van 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) en 13.69 g sacharose (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Voeg 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) en het volume op 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereiden van 0,8 M sacharose door ontbinding 13.69 g sacharose (342.3 g/mol) in 50 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereiden van 5 mg/mL deoxyribonuclease ik (DNase ik) door het oplossen van 0,015 g DNase ik in 3 mL dH2O in een maatkolf van 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan. Aliquot oplossing in microfuge buizen en winkel bij-20 ° C.</li>
	<li>Voorbereiden van 0,125 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), pH 8,0 door het oplossen van 0.698 g EDTA Dinatrium uitdrogen (372.2 g/mol) in 15 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereiden 600 µg/mL cephalexin door ontbinding van 0,03 g van cephalexin hydraat (365.404 g/mol) in 50 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij 4 ° C.</li>
	<li>5 mg/mL lysozym voor te bereiden door het oplossen van 0,015 g lysozym in 3 mL dH2O in een maatkolf van 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan. Aliquot oplossing in microfuge buizen en winkel bij-20 ° C.</li>
	<li>3% w/v Trypticase soja Bouillon (TSB) voor te bereiden door het oplossen van 30 g van de TSB in 1 L dH2O in een erlenmeyer van 2 L. Aliquot de oplossing in flacons met 25 mL of 100 mL TSB moet worden gebruikt bij de voorbereiding van E. coli spheroplasts of B. megaterium protoplasten, , respectievelijk. Autoclaaf kolven voor het steriliseren van de vloeistof. Steriele TSB kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur of 4 ° C.</li>
	<li>Bereid de oplossing C (1 M sacharose, 0,04 M maleaat 0,04 M MgCl2, pH 6,5) door ontbinding 34.23 g sacharose (342.3 g/mol), 0.46 g maleïnezuur (116.07 g/mol) en 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) in 100 mL dH2O in een maatkolf van 250 mL. Breng de pH op 6.5. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid 200 mL protoplast medium door het mengen van 100 mL 3% w/v TSB en 100 mL oplossing C in een 1 L-fles. Autoclaaf steriliseren van de oplossing te bewaren bij kamertemperatuur.</li>
</ol>2. voorbereiding van overnachting cultuur
Opmerking: Voer secties 2-4 met behulp van passend steriele technieken. Indien gewenst, kan een bacteriële stam een plasmide voor antibiotica-resistentie ter beperking van de potentiële verontreiniging bevatten. Als een stam met resistentie tegen antibiotica, voeg de nodige antibiotica in stappen 2.1, 3.1-3.2, en 4.1-4.4.
<ol><li>Bereid een overnachting cultuur door het plukken van een één kolonie van bacteriën met behulp van een steriele pipette uiteinde en plaatsen het in een tube van 14 mL cultuur met 2-3 mL 3% w/v TSB. Incubeer bij 37 ° C, terwijl het schudden voor 16-21 h.</li>
</ol>3. bereiding van gram-negatieve E. coli Spheroplasts
<ol><li>Verdun in een maatkolf van 250 mL, de nachtelijke 1:100 van de cultuur in 25 mL volume van 3% w/v TSB en Incubeer de bacteriële oplossing bij 37 ° C, terwijl het schudden voor ongeveer 2,5 h totdat de oplossing heeft gevonden een optische dichtheid van 0,5 – 0,8 op 600 nm. Meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>In een erlenmeyer van 250 mL, Verdun deze cultuur 1:10 in 30 mL 3% w/v TSB en Incubeer bij 37 ° C, terwijl het schudden gedurende 2,5 uur in aanwezigheid van 60 µg/mL cephalexin (347.4 g/mol) voor de productie van eencellige filamenten van ongeveer 50 – 150 µm lang , die zijn waarneembaar onder 1000 X vergroting met behulp van een lichte Microscoop (figuur 1B).</li>
	<li>Oogst de filamenten door centrifugeren van de bacteriële oplossing bij 1.500 x g, 4 ° C voor 4 min. Decant en verwijder het supernatant, reserveren van de pellet.</li>
	<li>Wassen de filamenten door zachtjes toevoeging van 1 mL van 0,8 M sacharose, dat evenwel niet tot de pellet te verstoren. Incubeer gedurende 1 minuut, en verwijder vervolgens het supernatant zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Voeg 150 µL van 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL van 5 mg/mL lysozym, 30 µL van 5 mg/mL DNase ik en 120 µL van 0,125 M EDTA in hun respectieve bestellen aan de pellet en de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Voeg 1 mL van oplossing A geleidelijk aan meer dan 1 min aan de oplossing bereid in 3.5 met behulp van een micropipet, terwijl de oplossing met de hand voorzichtig te zwenken. Laat de oplossing gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>7 mL oplossing van 4 ° C B gestoken door twee 15 mL conische buizen. Toevoegen van gelijke hoeveelheden van de oplossing bereid in 3.6 aan elk van deze twee buizen. Centrifugeer de oplossing bij 1.500 x g, 4 ° C voor 4 min.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, zorgvuldig alle verwijderen 1-2 mL bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet door zachtjes op en neer met behulp van een micropipet P1000 pipetteren. Visueel controleren vorming van de spheroplasts door het observeren van het monster bij 1000 X vergroting met behulp van een lichte Microscoop (Figuur 1 c).</li>
	<li>Bewaar de spheroplasts bij-20 ° C voor maximaal een week of totdat ze hebben 3 bevriezen-ontdooien cycli doorlopen.</li>
</ol>4. voorbereiding van gram-positieve B. megaterium protoplasten
<ol><li>In een erlenmeyer van 250 mL, Verdun de nachtelijke 1:1,000 van de cultuur in 100 mL 3% w/v TSB en Incubeer de bacteriële oplossing bij 37 ° C, terwijl het schudden voor circa 4, 5 h tot de oplossing heeft bereikt een optische dichtheid van 0,9-1.0 op 600 nm. Meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>Giet het vloeibare cultuur in twee 50 mL conische buizen en centrifuge 2.000 x g4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, verwijder het supernatant van beide conische buizen. Resuspendeer elke pellet in 2.5 mL protoplast medium en de geresuspendeerde oplossingen combineren tot een enkele conische buis. Pipetteer de gecombineerde geresuspendeerde oplossing in een maatkolf van 125 mL.</li>
	<li>Voeg 1 mL 5 mg/mL lysozym en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, terwijl het schudden.</li>
	<li>Toezicht op de groei van protoplasten onder 1000 x vergroting met behulp van een lichte Microscoop, vaststellend van onregelmatigheden, zoals bacteriën die worden weergegeven als gezwollen staven in plaats van bollen (Figuur 2). Met behulp van een serologische precisiepipet, breng de oplossing kwantitatief een conische tube van 15 mL en centrifuge 2.000 x g4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL protoplast media. Opslaan van protoplasten bij-20 ° C voor maximaal een week of totdat ze hebben 3 bevriezen-ontdooien cycli doorlopen.</li>
</ol>5. bereiding van de oplossing van de Peptide en membraan kleurstof voor Imaging
<ol><li>
Peptide oplossing
	<ol>
<li>Los in een microfuge buis gewikkeld in aluminiumfolie, 2 mg FITC label BF2 P11A in dH, 800 µL2O. gebruik een peptide met ten minste één tryptofaan residu om eiwit concentratie metingen verrichten.</li>
		<li>Spectrophotometrically, meet de extinctie van de oplossing van de peptide bij 280 nm in drievoud. Bereken de concentratie van de peptide met behulp van de coëfficiënt molaire extinctie voor tryptofaan (5.700/Mcm).</li>
		<li>Verdun de concentratie van de peptide in dH2O om een eindconcentratie van 100 – 200 µM. opslag in een microfuge buis bij-20 ° C gewikkeld in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membraan kleurstof
	<ol>
<li>Bereiden in een microfuge buis, een 10 mM voorraad van di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) door het oplossen van 5 mg voor di-8-ANEPPS in 843.3 µL van DMSO. Bewaren bij 4 ° C gewikkeld in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.</li>
		<li>In een microfuge buis, bereiden 1 mL van 0.03 mM di-8-ANEPPS door 3 µL van 10 mM di-8-ANEPPS toe te voegen aan 997 µL DMSO. Opslaan in een microfuge buis bij 4 ° C gewikkeld in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. visualisatie van E. coli Spheroplasts en B. megaterium protoplasten met behulp van confocale microscopie
<ol><li>Pipetteer 5 µL van spheroplasts of protoplasten op een poly-L-lysine gecoate glasplaatje. Voeg 2 µL van FITC AMP (100-200 µM) naar de dia met het label en incubeer gedurende 3 minuten beschermd tegen licht.</li>
	<li>Voeg 1 µL van het membraan kleurstof di-8-ANEPPS (0.03 mM) aan de dia en incubeer gedurende 3 minuten beschermd tegen licht. Dek af met een dekglaasje glas aan en verzegel met de nagellak.</li>
	<li>Inschakelen van de confocal microscoop en argon laser. Pas de argon laser 20% vermogen en 20% transmissie.</li>
	<li>Emissie golflengte reeksen van 499 – 532 nm en 670-745 nm voor de FITC-geëtiketteerden peptide emissie kanaal en di-8-ANEPPS-geëtiketteerden membraan kleurstof emissie kanaal, respectievelijk ingesteld.</li>
	<li>Afbeelding protoplasten of spheroplasts (Figuur 1 en Figuur 2) met een 63 X doelstelling. Imaging software gebruiken voor het verkrijgen van 8-bit, 512 x 512 samengestelde z-stack beelden samengesteld van 0,5 µm plakjes van het geheel van de spheroplast of de protoplast. Opmerking: Neem zorgvuldig om de uitstoot te verminderen bloeden-door terwijl imaging spheroplasts en protoplasten. Zie de beschrijving voor meer informatie.</li>
</ol>7. karakterisering van AMP lokalisatie
<ol><li>Open de afbeelding van de samengestelde z-stack in beeldbewerkingssoftware. Zoek het segment van de center-de meeste van de spheroplast of de protoplast en plaats een circulaire regio van belang (ROI) (0,3 µm in diameter) van de membraan (ROI 1), één in het midden van de spheroplast of de protoplast (ROI 2), en één uit de buurt van spheroplast of protoplast op maat de achtergrond fluorescentie (ROI 3) (Figuur 5). Vermijd de opname van verzadigde pixels. De intensiteit van de fluorescentie in elke ROI kan worden berekend door de beeldbewerkingssoftware. Opmerking: In gevallen wanneer peptide niet naar het geheel van het membraan lokaliseren doet, trekken ROI 1 op een oppervlakte van het membraan waar de peptide is gelokaliseerd.</li>
	<li>De volgende vergelijking gebruiken om te bepalen van de verhouding van intracellulaire peptide fluorescentie intensiteit aan membraan peptide fluorescentie intensiteit: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> Opmerking: De intensiteit van de fluorescentie in ROI 3 wordt afgetrokken van de intensiteit van de fluorescentie in ROI 2 en ROI 1 om de rekening voor achtergrond fluorescentie.</li>
</ol>

<ol><li>Baltzer, S. A., Brown, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+promising+alternatives+to+conventional+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).</li>
<li>Hancock, R. E., Sahl, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+and+host-defense+peptides+as+new+anti-infective+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies.</a> Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).</li>
<li>Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16847082">Peptide antimicrobial agents.</a> Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).</li>
<li>Toke, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides%3A+new+candidates+in+the+fight+against+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections.</a> Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in 2014.</a> Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).</li>
<li>Epand, R. M., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+antimicrobial+peptides+and+their+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action.</a> Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).</li>
<li>Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Delivery+to+the+Brain+via+Adsorptive-Mediated+Endocytosis%3A+Advances+With+SynB+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors.</a> AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).</li>
<li>Splith, K., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+with+cell-penetrating+peptide+properties+and+vice+versa%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa.</a> European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).</li>
<li>Bustillo, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+analysis+of+hipposin%2C+a+histone-derived+antimicrobial+peptide+consisting+of+membrane+translocating+and+membrane+permeabilizing+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).</li>
<li>Koo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relations+of+parasin+I%2C+a+histone+H2A-derived+antimicrobial+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide.</a> Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).</li>
<li>Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+bioactivity+of+antimicrobial+peptides+by+addition+of+amino-terminal+copper+and+nickel+%28ATCUN%29+binding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs.</a> ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).</li>
<li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Action+of+the+Antimicrobial+Peptide+Buforin+II%3A+Buforin+II+Kills+Microorganisms+by+Penetrating+the+Cell+Membrane+and+Inhibiting+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).</li>
<li>Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+analysis+of+buforin+II%2C+a+histone+H2A-derived+antimicrobial+peptide%3A+The+proline+hinge+is+responsible+for+the+cell-penetrating+ability+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).</li>
<li>Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+histone-derived+antimicrobial+peptides+use+different+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).</li>
<li>Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Spheroplasts+as+a+Model+for+Visualizing+Membrane+Translocation+of+Antimicrobial+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).</li>
<li>Chassy, B. M., Giuffrida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Lysis+of+Gram-Positive%2C+Asporogenous+Bacteria+with+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme.</a> Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).</li>
<li>Fitz-James, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+and+Chemical+Studies+of+the+Browth+of+Protoplasts+of+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophysic.+and+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium.</a> J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).</li>
<li>Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-sensitive+ion+channel+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).</li>
<li>Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).</li>
<li>Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNadeau%2C+JL+%22Introduction+to+Experimental+Biophysics%3A+Biological+Methods+for+Physical+Scientists%22">Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists</a>. , CRC Press. (2016).</li>
<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+Escherichia+coli+spheroplast+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).</li>
<li>Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+%28AMPs%29+produced+by+Saccharomyces+cerevisiae+induce+alterations+in+the+intracellular+pH%2C+membrane+permeability+and+culturability+of+Hanseniaspora+guilliermondii+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells.</a> Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Translocation+Mechanism+of+the+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).</li>
<li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (59), e3571(2012).</li>
<li>van der Kraan, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrampin%3A+a+novel+antimicrobial+peptide+in+the+N1-domain+of+bovine+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin.</a> Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).</li>
<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li>
<li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li>
<li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers%3A+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li>
<li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li>
<li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li>
<li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melittin-Induced+Permeabilization%2C+Re-sealing%2C+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li>
<li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.

De protocollen die hier gepresenteerd maken het mogelijk voor onderzoekers sneller het verkrijgen van grotere omvang van de steekproeven van bacteriële beelden omdat de uitgebreide, bolvormige bacteriën veel gemakkelijker zijn te vinden, oriënteren en beeld. Deze verbeterde mogelijkheid om gegevens te verzamelen is waardevol in verschillende opzichten. Eerst, is hierdoor een meer systematische kwantitatieve analyse van peptide lokalisatie patronen. Terwijl kwalitatieve ontwikkelingen kunnen worden aangetoond van kleinere...

Antimicrobiële peptiden (AMPs) hebben opgedaan aandacht vanwege hun potentiële gebruik als alternatieven voor conventionele antibiotica1,2,3,4,5. Versterkers doden bacteriën door ofwel translocating tussen de celmembranen en de interactie met intracellulaire componenten zoals nucleïnezuren of door het membraan veroorzaakt door lekkage van cel inhoud6permeabilizing. Naast hun gebruik als antibiotica, kan translocating versterkers worden aangepast voor drug delivery toepassingen omdat ze kunnen niet-onverwacht is het oversteken van de ondoordringbare celmembraan7,8. Daarom willen wij, begrijpen fundamentele AMP mechanismen van actie te leggen de basis voor hun gebruik in drug design.
Confocale microscopie biedt een manier om te beoordelen van lokalisatie patronen van fluorescently geëtiketteerde versterkers in bacteriecellen biedt inzichten in hun mechanisme van actie9,10,11,12, 13 , 14. door het labelen van de membraan van de bacteriën, kan men bepalen als een fluorescently geëtiketteerde peptide het membraan of de intracellulaire ruimte van een bacteriële cel lokaliseert. Deze techniek wordt echter beperkt door het kleine formaat en rod vorm van bacteriën, waardoor imaging uitdagend als gevolg van de grenzen van de resolutie van conventionele lichte microscopen en de variabele oriëntatie van de bacteriën op de dia15.
Het doel van de onderhavige methode is om verbeterde visualisatie van de fluorescently geëtiketteerde peptide lokalisatie patronen met behulp van de confocal microscopie. Visualisatie wordt versterkt door het draaien van de kleine, dunne, staafvormige gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) bacteriën in uitgebreide, bolvormige vormen genoemd spheroplasts (voor gramnegatieve stammen) en protoplasten (voor gram-positieve stammen)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts en protoplasten zijn gemakkelijker te afbeelding vanwege hun toegenomen omvang zowel hun symmetrische vorm, waardoor de richting van een bacterie op een dia niet relevant voor de beeldvorming. Daarnaast presenteren wij een systematische aanpak kwantitatief confocale microscopie om gegevens te analyseren om de versterkers te karakteriseren als beide membraan lokaliseren of translocating. Toepassing van deze methoden maakt het gemakkelijker om te onderscheiden fluorescently label peptide lokalisatie patronen. De protocollen die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de lokalisatie van een verscheidenheid van membraan-actieve actoren dan versterkers, met inbegrip van cel-penetrating peptiden.
Een duidelijk voordeel van deze techniek is dat het biedt inzicht in het werkingsmechanisme van versterkers op eencellige niveau, die kan onthullen cel-naar-cel heterogeniteit15, in tegenstelling tot andere fluorescentie testen vaak gebruikt om te identificeren de mechanismen van werking van versterkers, waarmee alleen bulk schattingen9,22,23,24,25. Het gebruik van spheroplasts en protoplasten teneinde AMP cel invoeren is bijzonder nuttig26 , omdat ze meer fysiologisch relevante15 dan andere modellen die gebruikt worden voor de beoordeling van de cel invoeren, zoals lipide blaasjes24.

<table><tbody><tr><td>Trizma hydrocloride (Tris HCl)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base (Tris OH)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement</td></tr><tr><td>Cephalexin hydrate</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase soy broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>Custom ordered</td><td></td></tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 &mu;m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>For image acquisition</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>For image processing</td></tr></tbody></table>

productie en visualisatie van bacteriële spheroplasts en protoplasten te karakteriseren antimicrobiële peptide lokalisatie

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Het gebruik van de confocal microscopie als een methode om te beoordelen van peptide lokalisatie patronen binnen bacteriën wordt gewoonlijk geremd door de grenzen van de resolutie van conventionele lichte microscopen. Zoals de resolutie voor een bepaalde Microscoop kan niet gemakkelijk worden verbeterd, presenteren we protocollen te transformeren de kleine staafvormige gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) in grotere, gemakkelijk verbeelde bolvormige vormen spheroplasts of protoplasten genoemd. Deze transformatie kan waarnemers te snel en duidelijk bepalen of peptiden zelf in het bacteriële membraan (dat wil zeggen, membraan lokaliseren indienen) of kruis het membraan voor het invoeren van de cel (bijvoorbeeld translocating). Met deze aanpak presenteren we ook een systematische methode om te karakteriseren van peptiden als membraan lokaliseren of translocating. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van membraan-actieve peptiden en bacteriestammen, we tonen het nut van dit protocol door het observeren van de interactie van Buforin II P11A (BF2 P11A), een antimicrobiële peptide (AMP), met E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten.

Door te vergroten van bacteriën en waardoor ze sferische, kunnen we gemakkelijk onderscheiden of peptiden lokaliseren naar het bacteriële membraan gemakkelijk translocate over het bacteriële membraan. De grenzen van de resolutie van conventionele lichte microscopen maken het uitdagend om te onderscheiden of peptide signalen uit de membraan of de intracellulaire ruimte in normale bacteriën voortvloeien omdat signalen gelokaliseerd op het membraan elkaar overlappen lijken met de intracellul...

Hier presenteren we een protocol voor de productie van gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) spheroplasts en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasten duidelijk visualiseren en snel karakteriseren Peptide-bacteriën interacties. Dit biedt een systematische methode om te definiëren membraan lokaliseren en translocating peptiden.

Productie en visualisatie van bacteriële Spheroplasts en protoplasten te karakteriseren antimicrobiële Peptide lokalisatie

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van antimicrobiële peptiden over de vraag of peptiden zich lokaliseren of transloceren door het celmembraan. Het gebruik van sféroplasten en protoplasten maakt de visualisatie en analyse van peptidelokalisatie mogelijk in een fysiologisch relevant modelsysteem zonder de resolutieproblemen die worden ondervonden bij bacterieëel celbeeldvorming. Hoewel deze methode inzicht kan geven in antimicrobiële peptiden, kan deze ook worden toegepast op andere membraanactieve agentia zoals celpenetrerende peptiden.Gram-negatieve E.coli sféroplasten en gram-positieve B.megaterium protoplasten moeten worden bereid in een biologisch veiligheidskabinet of laminare stromingshaak met behulp van geschikte steriele techniek. Indien gewenst, kunnen bacteriestammen een antibioticaresistent plasmide bevatten, en sféroplasten en protoplasten kunnen worden bereid op een open labbank. In deze video worden sféroplasten en protoplasten bereid op een open labbank met behulp van antibioticaresistent bacteriestammen.Om een overnachtscultuur op te zetten, gebruikt u een steriele micropipettip om een enkele bacteriekolonie van een vaste

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijzen voor het zuiveren van cholesterol binding toxine streptolysine O van...

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Source: Figueroa, D. M., et.al. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the production of Escherichia coli spheroplasts by first inhibiting cell division to induce filamentation, followed by enzymatic digestion of the cell wall. The process includes controlled addition of a chelating agent, DNase, and an osmotic stabilizer to ensure proper spheroplast formation and...

Preparation of E. coli Spheroplasts

Source: Figueroa, D. M., et al. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a step-by-step procedure for generating protoplasts from the Gram-positive bacterium Bacillus megaterium.

Generating Protoplasts from the Gram-Positive Bacterium Bacillus megaterium

Source: Bratton, B. P., et al., Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the method for acquiring and analyzing three-dimensional fluorescence images of bacterial cells to study protein organization at the single-cell level.

Visualizing Bacterial Protein Distribution in Three Dimensions by Fluorescence Imaging

Source: Figueroa, D. et. al. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the preparation of spheroplasts from rod-shaped, gram-negative bacteria. Bacteria are grown in the presence of an antibiotic to form elongated filaments. These are washed with a hypertonic solution and treated with a lysis buffer to remove the outer cell wall. Hypotonic treatment forms spheroplasts,...

Generation of Spheroplasts from Gram-Negative Bacteria

Het protocol stelt de Escherichia coli-selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in het lactococcal antimicrobiële peptide nisine gebaseerd. De eigenschappen kunnen worden gewijzigd tijdens de recombinante expressie via substitutie met de gewenste ncAAs in de gedefinieerde groei media. Resulterende mutaties in de topicale worden toegewezen door groei remming testen en fluorescentie microscopie.

Antimicrobiële peptiden geproduceerd door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bacteriële productie van recombinante eiwitten, waaronder typisch onoplosbare of disulfide-bindingsbevattende eiwitten, verpakt in extracellulaire membraangebonden blaasjes. Dit heeft het potentieel om te worden toegepast op veelzijdige gebieden van wetenschappelijk onderzoek, waaronder toegepaste biotechnologie en geneeskunde.

Geoptimaliseerde productie en analyse van recombinante met eiwitten gevulde blaasjes van E. coli

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren en evalueren van de antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit van het kationische peptide Mel4 en het peptide-nabootser RK758. Door chemische synthese, recombinante expressie en gestandaardiseerde functionele assays te integreren, biedt het een gestroomlijnde workflow voor de productie en het testen van peptiden en kleinmolecuul-imitaties.

Productie en testen van antimicrobiële peptiden en hun nabootsers

Leer de productie van E. coli spheroplasten en B. megaterium protoplasten om antimicrobiële peptidelokalisatie te visualiseren. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van membraaninteracties.

Productie en visualisatie van bacteriële Spheroplasts en protoplasten te karakteriseren antimicrobiële Peptide lokalisatie

Meer video's verkennen