Name: Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor de synthese van polyamine-gebaseerde peptide-amfifielen met onbeschermde bouwstenen. Dit protocol vereenvoudigt de productie van zelf-assemblerende biomaterialen voor biomedische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gefinancierd door de Universiteit van Nebraska Medical Center (Start-up fondsen, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) en de American Chemical Society, PRF-# 57434-DNI7(MC-S).

1. Algemeen Protocol voor synthese van de PPA
<ol><li>De schaal van synthese (meestal mmol) berekenen. Deze schaal is gebaseerd op de massa van het streefbedrag van de PPA. Houd er rekening mee dat de efficiency van de reactie van SPPS geleidelijk met een verhoging van aminozuur volgorde afneemt. De exacte reactie efficiëntie is daarom moeilijk om te berekenen.</li>
	<li>Bereken het gewicht van de hars worden gebruikt volgens het laden van de hars. Het laden is gevonden op de recipiënt of het protocol van de analyse van de hars en uitgedrukt in mmol/g. De volgende formule kan worden gebruikt voor de berekening van het gewicht van de hars:</li>
	<li>Weeg zorgvuldig 2-chlorotrityl chloride hars (in ons geval het laden is ~0.85 mmol)</li>
	<li>Plaats de hars in een ketel fritted synthese met de volgende specificaties: capaciteit: 50 mL, Fritted Disc-25 mm, porositeit-Medium.</li>
	<li>Voeg toe 15 mL dichloormethaan (DCM) aan de hars.</li>
	<li>Brengt het synthese schip naar een variabele snelheid mechanische schudinrichting (kolf shaker/roerder), en draai de schepen naar een hoek van 45° (of horizontaal) te maximaliseren van agitatie.</li>
	<li>Toestaan dat de harsparels te zwellen voor 15 min. zwelling verbetert het rendement van reactie omdat het vergemakkelijkt Moleculaire diffusie en toegankelijkheid van de actieve site, verbetering van de efficiëntie van de koppeling.</li>
	<li>8 equivalenten (2 mmol voor een 0,25 mmol schaal) van de gewenste polyamine (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropaan, enz.) toevoegen aan de hars en laat ze reageren voor 5 h. Opmerking: Een mindere periode reactie zou verminderen opbrengst.</li>
	<li>Een Kaiser test (Zie Tabel van materialen) om te bevestigen van succesvolle koppeling van de polyamine aan de hars. Succesvolle koppeling van de primaire amines levert een violet/blauw kleur, die correspondeert met de gratis amine.</li>
	<li>Beschermen van de primaire amine-groep 4 equivalenten van 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), opgelost in watervrij methanol (15 mL), via de reactie mengsel overnachting11schudden. Opmerking: Een lagere reactietijd vermindert opbrengst.</li>
	<li>Een Kaiser-test uitvoeren. Een afwezigheid van de blauwe kleur van de kraal hars bevestigt succesvolle bescherming. In het geval van mislukte bescherming van de primaire amine, herhaalt u de vorige stap.</li>
	<li>De DCM drain en wassen van de harsen tweemaal met een mengsel van DCM en DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Los van 20 equivalenten (5 mmol) di-tert-butyl di-carbonaat (Boc) in DCM (20 mL) en laat de reactie om door te gaan voor 3 h.</li>
	<li>Doen een chloranil test (Zie Tabel van materialen) om te bevestigen de volledige bescherming van de secundaire amine. Een positieve test (bescherming) levert een kleurloze of licht gele kleur. Gratis secundaire amines geeft een donkere kleur groen/blauw, terwijl primaire amines een rode kleur geven.</li>
	<li>Het oplosmiddel mengsel uitlekken en spoel tweemaal met een mengsel van DCM en DMF (2:1, 15 mL).</li>
	<li>Voeg een 2%-oplossing van hydrazine in DMF (10 mL) en schud gedurende 1 uur.</li>
	<li>Een Kaiser testen om te bevestigen van de succesvolle deprotection van de primaire amine.</li>
	<li>
Voeg de gewenste aminozuren in de omgekeerde volgorde waarin u wilt schrijven/tekenen ze. Peptiden zijn ontleend aan de N termini naar het termini C maar worden gesynthetiseerd in de tegenovergestelde richting, C tot N. Bijvoorbeeld, voor een PPA vereisen de volgende peptide core - GLFD-, voeg de asparaginezuur (D), gevolgd door fenylalanine (F), Leucine (L), en tenslotte Glycine (G). Opmerking: De meeste aminozuren, de volgende koppeling cocktail is passend voor bevestiging aan de harsen polyamine geladen.<ol>
<li>Meng 4 equivalenten (1 mmol) van het aminozuur Fmoc-beschermd, 3.95 equivalenten van 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexaﬂuorophosphate (HBTU), en 15 equivalenten van diisopropylethyl amine (DIPEA).</li>
		<li>Los ze op in een mengsel van DCM en DMF (1:1, 15 mL) en bewerk ultrasone trillingen ten de cocktail gedurende 2 minuten (tot volledige ontbinding).</li>
		<li>Wachten een extra 3-5 min om activering van het carbonzuur op het aminozuur.</li>
		<li>Het reactiemengsel toevoegen aan het schip. Uit de reactie voor 2-4 uur bij kamertemperatuur te voeren. Opmerking: We hebben gevonden de volgende als efficiënte alternatieven voor HBTU (meestal die lagere bedragen van de aminozuren en de koppelmiddel): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.</li>
		<li>Een Kaiser testen om te bevestigen van succesvolle koppeling.</li>
		<li>-Bescherm de Fmoc-groep uit het aminozuur door het toevoegen van een 20%-oplossing van 4-methyl piperidine (10 mL) in DMF. Doe het twee keer, elke keer schudden het reactiemengsel gedurende 15 minuten. Opmerking: Een efficiënt alternatief voor het verwijderen van de Fmoc is piperazine/DBU12.<ol>
<li>Het uitvoeren van een DCM (15 mL) wassen tussen toevoegingen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Een Kaiser testen om te bevestigen succesvol de bescherming van het aminozuur.</li>
		<li>De hars grondig om te verwijderen van alle sporen van 4-methyl wassen. Wassen van de hars tweemaal met DMF (10 mL), elke wassen gedurende 5 min, en ten slotte met DCM (10 mL) gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Alle resterende aminozuren toevoegen door achtereenvolgens het herhalen van het koppelingspunt en de bescherming stappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ten slotte, na de koppeling alle vereiste aminozuren, conjugaat de hydrofobe staart aan het laatste aminozuur voor de polyamine-peptide construct:
	<ol>
<li>Voeg toe 10 equivalenten van de functionaliteit van de gewenste carbonzuur 9,5 equivalenten van HBTU en 12 equivalenten van DIPEA opgelost in DCM en DMF mengsel (1:1, 20 mL). Opmerking: In gedachten houden dan sommige staarten een verschillende hoeveelheid oplosmiddel (meestal een grotere % van DCM) of de toevoeging of een ander oplosmiddel zoals N-methylpyrrolidon (NMP wellicht).</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de cocktail voor 5 – 10 min tot ontbinding (we hebben gezien duurt het langer voor de staart te volledig ontbinden) en voeg toe aan het schip. Opmerking: Voor tails met meerdere reactieve sites, zal zij moeten worden beschermd voordat ze de koppeling.</li>
		<li>Voeren deze reactie (koppeling de hydrofobe staart) voor ten minste 5 h, hoewel het is raadzaam om het verrichten van overnachting voor de hoogst mogelijke opbrengst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PPA splijten van stevige steun
Het doel van deze stap is de splitsing van de PPA van de hars, en te verwijderen van de Boc bescherming groepen uit de aminozuren en polyamine residuen.
<ol><li>Wassen van de hars met DMF (8 mL gedurende 2 minuten) en tweemaal met DCM (8 mL, telkens gedurende 5 minuten). Vóór elke toevoeging afvoer het oplosmiddel van het vaartuig. Zodra de laatste wash wordt uitgevoerd, droog het hars onder drukvermindering gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Bereid de oplossing van de splitsing met behulp van de volgende verhouding van het mengsel: 28:1:1 trifluorazijnzuur (TFA): H2O: Triisopropyl silane (TIPS). Aanbrengen van 15 mL het splijten cocktail 14 mL TFA, toevoegen aan 0,5 mL H2O en 0,5 mL van TIPS.</li>
	<li>Deze splitsingsproducten-oplossing toevoegen aan de hars en schud gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verzamelen van de oplossing in een 25 of 50 mL ronde onderkant kolf.</li>
	<li>Concentreren de TFA onder vacuüm tot 1-2 mL met behulp van een rotatieverdamper bij verlaagde druk tijdens de verwarming van het mengsel bij 40 ° C (niet overtreffen 55 ° C om te voorkomen dat ontbinding van de PPA).</li>
	<li>Na verdamping, voeg de verkregen TFA oplossing (ontkleuring) over in een maatkolf van de ronde onderkant met watervrij koude ether (15 mL). Dit zal onmiddellijk het neerslaan van de PPA.</li>
	<li>Bovendien watervrij koude ether (5 mL) toe te voegen aan de oorspronkelijke maatkolf waar de TFA geconcentreerd was.</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten deze kolf herstellen extra vaste stoffen te combineren met de ether-oplossing van stap 2.6. Opmerking: De overdragende pipet kan gewassen worden met een klein volume van DCM. Vermijd invoering van DMF tijdens het proces, omdat het de neiging om te vormen van een gel-achtige substantie.</li>
	<li>Plaats de kolf (overdekt) in de koelkast en laat het staan 's nachts te maximaliseren van de neerslag.</li>
	<li>De neergeslagen materiaal verzameld door vacuüm filtratie met behulp van een trechter van gesinterd schijf filter. De ideale porie-maten zijn fijn of medium.</li>
	<li>Was het neerslag tweemaal met koude ether (5-10 mL) voor het verwijderen van alle resterende organics.</li>
</ol>3. identificatie van het ruwe Product met behulp van de MALDI gedroogd-drop, methode
<ol><li>
De voorbereiding van de matrix voor analyse in positieve modus:
	<ol>
<li>Toevoegen om te beginnen molecuulgewicht analyse met behulp van de Spectrometrie van de massa van de Matrix bijgestaan Laser desorptie/ionisatie (MALDI), 10 tot 20 mg van α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur aan een microcentrifuge buis.</li>
		<li>Voeg een oplossing van water/acetonitril (1:1, 1,0 mL) met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA). Meng door vortexing. Opmerking: Deze matrix moet worden gebruikt voor positief geladen peptides. Sommige negatieve modus is vergelijkbaar, maar vereist een matrix met 9-aminoacridine met 0,1% ammoniak als oplosmiddel additief.</li>
		<li>Voeg 1-2 µL van het monster aan de plaat RVS doel voor MALDI en droog het monster in de lucht. Voeg 1-2 µL van de matrix en het weer droog. Opmerking: De platen hebben ronde markeringen gerasterde langs de plaat van de doelstelling om te helpen bij het vinden van de bijzondere plek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer de monsters in de MALDI instrument om hun identiteit te verifiëren. Electrospray ionisatie (ESI) is een geldig alternatief voor het bevestigen van de identiteit van de PPA.</li>
</ol>4. zuivering van de PPA met behulp van voorbereidende Reverse-fase krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) zuivering
<ol><li>
Los het precipitaat op PPA in een minimale hoeveelheid acetonitril en water.
	<ol>
<li>Als een vuistregel, los 100 mg van droge, ruwe PPA in minder dan 5 mL acetonitril en water. Meer hydrofobe PPA misschien vereisen een groter percentage van acetonitril te ontbinden en misschien ook een grotere hoeveelheid oplosmiddel in het algemeen, afhankelijk van de netto lading van de PPA (tabel 1).</li>
		<li>Als volledige ontbinding niet plaats vindt, voeg 1% TFA (ACN of H2O). Het is ook mogelijk om toe te voegen van de bedragen op te sporen van andere compatibele oplosmiddelen, met inbegrip van methanol, dimethylsulfoxide of isopropanol (beperken hun inhoud tot 5%).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Oplosmiddel</td>
			<td colspan="2">Positief geladen PPA</td>
			<td colspan="2">Negatief geladen PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0,1% TFA in Water</td>
			<td colspan="2">0,1% NH3 in Water</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0,1% TFA in ACN</td>
			<td colspan="2">0,1% NH3 in ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: oplosmiddel systemen. Voorgestelde oplosmiddel systeem voor positief en negatief geladen ppa.
<ol start="2"><li>Bewerk ultrasone trillingen ten de PPA met behulp van een hoorn ultrasoonapparaat voor 20 min op 10 s pulsen met Amp1 van 48% of gedurende 2-3 uur in een ultrasoonbad.</li>
	<li>
Vervolgens, filteren met behulp van een 0,45 micrometer spuit filter gevolgd door filtratie met behulp van een filter van 0,20 μm polytetrafluorethyleen (PTFE) spuit. De PPA-oplossing moet duidelijk en vrij van alle deeltjes materialen.
	<ol>
<li>Als filtratie te moeilijk is, bewerk ultrasone trillingen ten voor een langere periode van tijd. Het is sterk aangeraden dat de PPA-oplossing gezuiverde onmiddellijk nadat spuit filtratie is, aangezien langdurige opslag het aggregaat of gelate, die opnieuw ultrasoonapparaat en, misschien, opnieuw filtratie vergen zal zou kunnen veroorzaken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tijdens en na de zuivering, degenen die worden gefilterd via een 0.25 μm spuit filter/membraan of HPLC rang oplosmiddelen gebruiken. Opmerking: De meest voorkomende oplosmiddel voorwaarden voor het zuiveren van de PPA bestaan in een verloop van H2O en ACN.</li>
	<li>Gebruik een standaard omgekeerde-fase HPLC instrument voor dit protocol. Het moet een elutie kleurovergang programmeur, een binaire oplosmiddel expresbezorgingssysteem, een UV-detector voor het opsporen op 220 en 254 nm en een programmeerbare breuk verzamelaar van bevatten. Het maximale debiet moet 50 mL/min.</li>
	<li>Gebruik een C-18 reversed-phase kolom voor scheiding. Kolommen met de volgende dimensies kunnen worden gebruikt afhankelijk van de massa van solid wordt gezuiverd en de netto kosten van de PPA (tabel 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PPA gratis</td>
			<td>Deeltjesgrootte</td>
			<td>Kolomgrootte</td>
			<td>Massa van ruwe PPA</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve geladen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve geladen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve geladen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve geladen</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: kolommen voorgesteld: Kolomdimensies, deeltjesgrootte en het maximale laadvermogen per injectie voor C18 omgekeerde fase HPLC kolommen
<ol start="7"><li>PPA injecteren met een volume bepaald door zowel de capaciteit van de kolom en het volume van de lus van de injectie van de HPLC. Voer de HPLC-gradiëntenmethode volgens de instellingen gezien in tabel 3 (elutie tijd van 40 minuten).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tijd</td>
			<td>Oplosmiddel een (acetonitril)</td>
			<td>Oplosmiddel B (Water)</td>
			<td>Debiet (mL/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">Debiet is afhankelijk van de verpakking van de kolom en de grootte.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
<tr>
<td>35</td>
			<td>95%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>38</td>
			<td>100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: voorgestelde verloop: Voorgestelde omgekeerde fase verloop tonen de relatieve samenstelling van water vs acetonitril over een periode van tijd. Het debiet is afhankelijk van de specificaties van de kolom.
<ol start="8"><li>
Analyseren van de verzameld op de verschillende reageerbuisjes met behulp van sommige fracties en bepalen welke buis (of buizen) de PPA bevat. Dit wordt beoordeeld door het bestuderen van het molecuulgewicht gevonden in elke buis.
	<ol>
<li>Controleer de zuiverheid van de breuken op een analytische HPLC. Gebruik een HPLC-verloop-systeem voorzien van een UV-detector vastgesteldop 220 nm.</li>
		<li>Als er onzuiverheden, doen een extra cyclus van zuivering door HPLC. Het bovenstaande verloop gebruikt voor voorbereidende HPLC kunt gebruiken met de analytische HPLC met behulp van de online software van de gegevensbestandconvertor kolom worden teruggeschroefd. Elke breuk worden veel ≥95% zuiver voor fysische karakterisering of biologische evaluatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamelen van de fracties in een grote kolf met ronde bodem of verdamping kolf en verwijder alle de acetonitril en het merendeel van het water. De definitieve oplossing van de PPA moet niet meer dan 10 mL.</li>
	<li>Dit concentraat overbrengen in een centrifugebuis 50 mL. Er rekening mee dat PPA wasmiddel-achtige stoffen; dus worden belletjes gegenereerd tijdens de verdamping van het oplosmiddel. We hebben gevonden dat toevoeging van ethyl alcohol de vorming van de zeepbel vermindert.</li>
	<li>Vacuüm concentreren het concentraat. Tijdens de vacuüm verdamping, misschien een groot bedrag van de PPA vasthouden aan de wanden van de container. Herstellen van dit door de wand van de kolf met HPLC water herhaaldelijk te spoelen. Het gezamenlijke volume van de geconcentreerde PPA en de rinsate moet niet meer dan 30 mL.</li>
	<li>Plaats de waterige oplossing binnenkant van een tube van 50 mL.</li>
	<li>
Flash bevriezen deze PPA-oplossing in vloeibare stikstof: Opmerking: Flash bevriezing resultaten in kleinere-ijskristallen die sneller zal sublieme in de lyophilizer. Bovendien, langzamer bevriezing kan toestaan dat de vorming van zelf geassembleerde supramoleculaire structuren. Een ander alternatief (maar minder wenselijk) is om geleidelijk in een vriezer-80 ° C bevriezen of te bevriezen met behulp van een droog ijs + aceton mengsel<ol>
<li>Vóór het plaatsen van de centrifugebuis in de lyophilizer, perforate of draai de dop van de tube zodat vocht om te ontsnappen van het monster en verzamelde in de koelinstallatie. Stel de lyofilisatie eenheid ingesteld op-54 ° C en 0,016 mbar. Opmerking: Een andere optie is Verwijder de dop en plaats een veeg (met een rubberen band) op de top van de opening. Ook hebben we gevonden dat bevriezing van de monsters in een hoek of breken van het ijs in kleine porties voorziet in een snellere en betere lyofilisatie als gevolg van een toename van de oppervlakte.</li>
		<li>Als het vaste lichaam begint te smelten, kan dit duiden op sporen van een organisch oplosmiddel (meestal acetonitril) aanwezig zijn. Herhaal de bevriezing stap en evalueren van de toestand van lyofilisatie.</li>
		<li>Als het smelten aanhoudt, zijn er twee mogelijke oplossingen:<ol>
<li>Split het monster in twee gedeelten (te worden geplaatst in buizen), Verdun met water en opnieuw bevriezen. Niet deze oplossing vaak gebruikt omdat grote hoeveelheden organische oplosmiddelen aan de apparatuur schade kunnen.</li>
			<li>Uitwijkmogelijkheid, leg het monster in een kolf en verder het verdampen van het organische oplosmiddel onder vacuüm. Lyofilisering van een monster dat is in de vloeibare vorm meestal leidt tot stoten en verlies van de PPA-compound.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. opslag van de PPA
<ol><li>Winkel de PPA in een-20 ° C met de caps aangescherpt en verzegeld met Parafilm op een buis met een juiste etiket.</li>
	<li>Vóór gebruik, door de PPA terug naar kamertemperatuur in een vacuuemcel om condensatie van waterdamp op de PPA te brengen.</li>
</ol>

<ol><li>Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+x-ray-triggered+crystallization+at+long+range+in+self-assembling+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks.</a> Science. 327, 555-559 (2010).</li>
<li>Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+supramolecular+rigidity+of+peptide+fibers+through+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).</li>
<li>Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biomolecular+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biomolecular soft matter.</a> Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).</li>
<li>Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterase-activated+release+of+naproxen+from+supramolecular+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres.</a> Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).</li>
<li>Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMata%2C+A+%22Nanotechnology+in+Regenerative+Medicine%22">Nanotechnology in Regenerative Medicine</a>. , Springer. 39-49 (2012).</li>
<li>Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Polyamine-Based+Peptide+Amphiphiles+with+Tunable+Morphology+and+Physicochemical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+bioscience%22%5BJournal%5D)">Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties.</a> Macromolecular bioscience. 17, (2017).</li>
<li>Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+biophysicochemical+interactions+at+the+nano-bio+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface.</a> Nature Materials. 8, 543(2009).</li>
<li>Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+cationic+lipid-based+nanoparticles+facilitate+endosomal+escape+and+reduction-triggered+cytosolic+siRNA+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release.</a> Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).</li>
<li>Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-immolative+polycations+as+gene+delivery+vectors+and+prodrugs+targeting+polyamine+metabolism+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer.</a> Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).</li>
<li>Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-containing+amine+oxidases+contribute+to+terminal+polyamine+oxidation+in+peroxisomes+and+apoplast+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biology. 13, 109(2013).</li>
<li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0040403996003449">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).</li>
<li>Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ra/c5ra23441g">Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis.</a> RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).</li>
<li>Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+polyamine+metabolism+and+function+in+cancer+and+other+hyperproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373(2007).</li>
<li>Wuts, P. G. M., Greene, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWuts%2C+PGM+%22Protection+for+the+Amino+Group.+In+Greene%27s+Protective+Groups+in+Organic+Synthesis%22">Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis</a>. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).</li>
<li>Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+racemization+and+aspartimide+formation+in+microwave-enhanced+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflict van belang te verklaren

De hier beschreven protocollen kunnen worden gebruikt voor het synthetiseren van de PPA zoals wells als PAs en gerelateerde peptide gebaseerde molecules (zoals hybride PA-peptoids). Hoewel de synthese van peptiden met behulp van de SPPS een eenvoudige procedure is, is de synthese van peptiden met biologische homing moleculen kunnen bijzonder uitdagend. Polyaminen zoals spermine, spermidine, diethyelenetriamine, enz., kunnen functioneren als homing moleculen voor het targeten van kanker cellen13...

Zelfassemblerende peptide amfifielen (BK) vormen een klasse van biomaterialen meestal bestaat uit de volgende segmenten: (a) de hydrofiele kop, (b) de linker regio en (c) hydrofobe staart. Meeste PAs in de literatuur beschreven bezitten een hydrofiele kop bestaat uit geladen of polar aminozuur residuen1,2,3,4. PAs heb een brede waaier van toepassingen in biologie met inbegrip van de levering van de drug, diagnose van de ziekte, regeneratieve geneeskunde, etc.5. Op basis van de volgorde van hun aminozuur, kan PAs een grote verscheidenheid van nanostructuren waaronder sferische micellen en nano-filamenten vormen. We hebben onlangs gemeld dat een klasse van hybride peptide polyamine gebaseerde amfifielen, PPA6genoemd. De morphologies, zelfassemblerende kinetiek en metabole afbraak, van deze biomaterialen, bleken te worden gerelateerd aan hun solubilizing hoofd groep. Bovendien, de PPA nanostructuren toonde geen toxiciteit naar zoogdiercellen (MiaPaCa2 en HeLa cellen lijnen) bij de geteste concentraties. PPA gebaseerde nanocarriers zijn aantrekkelijke drug-leverende voertuigen omdat: (1) polyamine opname en metabolisme is aangetoond dat de kankercellen worden verhoogd, (2) kationische nanostructuren kunt bereiken endosomal escape7,8, wat leidt tot hogere verkeer en het verblijf binnen een cel, en (3) zij moeten een verschillende metabole profiel in vergelijking met PA; bijvoorbeeld, zullen zij meer stabiele naar proteasen gevonden in het menselijk lichaam (hoewel ze misschien gevoelig voor andere enzymen, zoals amine oxidasen)9,10. Ook PPA gevonden te hebben uiteenlopende morphologies, fysisch-chemische eigenschappen, nanoparticle stijfheid en kinetiek van de assemblage afhankelijk van de lengte en kosten van individuele PPA molecuul6. Hierin beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de synthese, identificatie en zuivering van de ppa die kunnen ook worden toegepast aan de voorbereiding van de PAs of soortgelijke hybride peptide moleculen.
Omdat polyaminen zijn niet algemeen verkrijgbare in hun beschermde vormen, en omdat het beschermen van de primaire en secundaire amines van polyaminen is van het grootste belang voor het conjugating hen met aminozuren en andere moleculen, we hebben geschetst de synthetische stappen om te komen tot hun bescherming. Het algemene doel van dit protocol is bedoeld als een eenvoudige methode voor het conjugating van polyaminen aminozuren. Polyaminen ontbreken een carboxylic groep; Dus, ze kunnen niet worden gekoppeld aan Rink Amide of Wang harsen. In plaats daarvan, harsen zoals 2-chlorotrityl chloride worden aanbevolen voor het synthetische protocol. De belangrijkste uitdaging voor de synthese van de PPA is de aanwezigheid van primaire en secundaire amine functionele groepen. Voor onze doeleinden beschermd we alle de secundaire amines in de polyamine terwijl de primaire aminogroep op de polyamine gratis toe de reactie van de koppeling. De reactie werd gedaan op een stevige steun na de principes van vaste fase peptide synthese (SPPS) om de werk-up na elke stap koppeling en deprotection. Het volgende protocol is voor zowel de handmatige en geautomatiseerde synthese van ppa (hoewel de verificatie van het aantal stappen zal worden uitdagend in een geautomatiseerd systeem). De synthese van deze moleculen kan ook worden verricht op een geautomatiseerde synthesizer of met behulp van een magnetron-reactor (automatische of semi-automatisch). De reactie-regeling heeft is samengevat in Figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg"> Figuur 1: (A) A algemene reactie regeling voor de synthese van de PPA. (B) vertegenwoordiger Polyaminen, die kunnen worden gebruikt om gesynthetiseerd PPA hier beschreven. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>2-Chlorotrityl chloride resin&nbsp;</td><td>AappTec</td><td>RTZ001</td><td></td></tr><tr><td>SynthwareTM synthesevat&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>SYNP120050M</td><td></td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Acros</td><td>AC406920250</td><td>Fisher Sci. Catalogue #</td></tr><tr><td>Polsshaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>401000-2</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser testkit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS004772</td><td></td></tr><tr><td>Watervrij methanol</td><td>Acros</td><td>AC610981000</td><td>Fisher Sci. Catalogue #</td></tr><tr><td>Chloranil testkit</td><td>TCI</td><td>TCC1771-KIT</td><td>VWR Catalogue #</td></tr><tr><td>Di-tert butyl di-carbonaat&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC194670250</td><td>Fisher Sci. Catalogue #</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazine</td><td>Acros</td><td>AC296815000</td><td>Fisher Sci. Catalogue #</td></tr><tr><td>(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfaat)</td><td>p3biosystems</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>4-methyl piperidine&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC127515000</td><td>Fisher Sci. Catalogue #</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>AappTec</td><td>CXZ035</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyaan-4-hydroxycininezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>9-Aminoacridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92817</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Spuitfilters: PTFE-membraan</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-730-21</td><td></td></tr></tbody></table>

facile protocol voor de synthese van het zelf monteren van peptide polyamine gebaseerde amfifielen (ppa) en verwante biomaterialen

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Polyamine gebaseerde Peptide amfifielen (PPA) zijn een nieuwe klasse van zelfassemblerende amfifiele verband houden met biomaterialen naar de peptide amfifielen (BK). Traditionele PAs bezitten geladen aminozuren als solubilizing groepen (lysine, arginine), die rechtstreeks zijn verbonden met een lipide-segment of een regio van de linker gemaakt van neutrale aminozuren kunnen bevatten. Afstemmen van de peptide opeenvolging van PAs kan diverse morphologies opleveren. Evenzo PPA een hydrofobe segment en neutrale aminozuren bezitten, maar bevatten ook polyamine moleculen als water (hydrofiel) groepen solubilizing. Zoals het geval met PAs, kunnen PPA ook zelf samenstellen in diverse morphologies, waaronder kleine staven, gedraaide nano-linten en gesmolten nano-bladen, wanneer opgelost in water. Echter uitdaging de aanwezigheid van zowel de primaire als de secundaire amines op een enkele polyamine molecuul een aanzienlijke als synthese van de PPA. In deze paper tonen we een eenvoudig protocol, op basis van literatuur precedenten, om een facile synthese van PPA met behulp van solid-phase peptide synthese (SPPS). Dit protocol kan worden uitgebreid tot de synthese van PAs en andere soortgelijke systemen. We illustreren ook de stappen die nodig zijn voor splijten van de hars, identificatie en zuivering.

Na de synthese en de reiniging en vóór de fysisch-chemische of biologische evaluatie, wordt het aanbevolen de massa's van de PPA zijn opnieuw gecontroleerd en de zuiverheid vastgesteld met behulp van analytische HPLC. Voor de karakterisering van de materiële of biologische evaluatie, PPA moeten een zuiverheid van > 95%. Figuur 2 toont de HPLC trace (boven) en de MALDI spectra (onder) bevestiging van de aanwezigheid van het product. HPLC analytische systemen z...

De synthese van peptide polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) is een grote uitdaging wegens de aanwezigheid van meerdere amine stikstofatomen, waarvoor oordeelkundig gebruik om groepen te maskeren deze reactieve functionaliteiten te beschermen. In deze paper beschrijven we een facile methode voor de bereiding van deze nieuwe klasse van zelfassemblerende moleculen.

Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden over het versieren van peptide amfifielen naar polyaminen en over het gebruik van achthoekige beschermingsgroepen. Het grote voordeel van deze techniek is dat je hybride peptide amfifielen kunt genereren met onbeschermde chemische bouwstenen die meerdere reactieve zijden bevatten. Mehdi, Nathalia en Krishnaiah, laboratoriumstudenten van het Conda Sheridan Laboratory, zullen de procedure demonstreren. Eerst, weeg zorgvuldig 2-Chlorotrityl chloridehars af en plaats de hars in een fritted, middelporige, synthesevaat met een capaciteit van 50 milliliter.Vervolgens bevestigt u het synthesevat aan een mechanisch shaker met variabele snelheid en draait u het vat naar een hoek van 45 graden om de agitatie te maximaliseren. Voeg vervolgens 15 milliliter DCM toe aan de hars. Laat de harskorrels 15 minuten zwellen en voeg vervolgens acht equivalenten van de gewenste polyamine toe aan de hars en laat deze vijf uur reageren.Na vijf uur voert u een kaiser-test uit om een succesvolle reactie van de polyamine op de hars te bevestigen. Bescherm vervolgens de primaire aminegroep door vier equivalenten van DDE in anhydreus methanol toe te voegen en de

facile-protocol-for-synthesis-self-assembling-polyamine-based-peptide

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een eenvoudige en algemene handleiding peptoïde synthese methode waarbij basisuitrusting en de handel verkrijgbare reagentia wordt geschetst, zodat peptoids gemakkelijk worden gesynthetiseerd in de meeste laboratoria. De synthese, zuivering en karakterisatie van een amfifiele peptoïde 36mer wordt beschreven, evenals de zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets.

Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

Dit document beschrijft de vorming van sterk geordende peptide-gebaseerde structuren door het spontane proces van zelfassemblage. De werkwijze maakt gebruik van commercieel verkrijgbare peptiden en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Deze techniek kan worden toegepast op een grote verscheidenheid aan peptiden en kan leiden tot de ontdekking van nieuwe peptiden gebaseerde samenstellingen.

Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Peptide tertiaire amides (PTA) zijn een superfamilie van peptidomimetica die omvatten maar zijn niet beperkt tot, peptiden, peptoïden en N-gemethyleerd peptiden. Hier beschrijven we een synthetische methode die zowel split-en-zwembad en sub-monomeer strategieën combineert tot een kraal een-verbinding bibliotheek van PTA synthetiseren.

Split-en-zwembad Synthese en karakterisatie van peptide Tertiaire amide Bibliotheek

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Een protocol voor de synthese van een 1,2-dithiolane gemodificeerde peptide en de karakterisatie van de supramoleculaire structuren die voortvloeien uit de peptide zelf-assemblage.

Synthese en karakterisering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende Peptides

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om een nanoemulsion voor een oliezuurgehalte acids-platinum(II) conjugate gestabiliseerd met een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF)-tripeptide synthetiseren. De nanoemulsion vormen onder zachte synthetische voorwaarden via zelf-assemblage van de KYF en de geconjugeerde.

Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur

Een protocol wordt gepresenteerd voor de synthese van informatie-gecodeerde peptoid oligomeren en voor de sequentie-gerichte zelfassemblage van deze peptoids in moleculaire ladders met behulp van amines en aldehyden als dynamische covalente reactant paren en Lewis zure zeldzame aarde metalen triflates als multi-role reagentia.

Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

Dit artikel bevat protocollen voor het ontwerp en de zelfassemblage van nanostructuren van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuur oligomeren in organische oplosmiddelmengsels.

Zelfassemblage van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuren in complexe nanostructuren in organische oplosmiddelmengsels

Dit protocol presenteert drie snelle en eenvoudige bereidingsmethoden die omgevingsomstandigheden gebruiken om de zelfassemblage van peptiden tot hydrogels op gang te brengen. Daarnaast wordt de karakterisering van peptidehydrogels beschreven, wat aantoont dat mechanisch stabiele peptidehydrogels onder deze eenvoudige omstandigheden kunnen worden gevormd.

Bereiding van mechanisch stabiele, zelf geassembleerde peptiden, hydrogels

Leer een eenvoudige methode voor de synthese van polyamine-gebaseerde peptide-amfifielen met onbeschermde bouwstenen. Dit protocol vereenvoudigt de productie van zelf-assemblerende biomaterialen voor biomedische toepassingen.

Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen (Video) | JoVE Journal

Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen

Meer video's verkennen