Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen

Deze methode kan sleutelvraagstukken beantwoorden over het versieren van peptide amfifielen naar polyaminen en over het gebruik van achthoekige beschermingsgroepen. Het grote voordeel van deze techniek is dat je hybride peptide amfifielen kunt genereren met onbeschermde chemische bouwstenen die meerdere reactieve zijden bevatten. Mehdi, Nathalia en Krishnaiah, laboratoriumstudenten van het Conda Sheridan Laboratory, zullen de procedure demonstreren. Eerst, weeg zorgvuldig 2-Chlorotrityl chloridehars af en plaats de hars in een fritted, middelporige, synthesevaat met een capaciteit van 50 milliliter.

Vervolgens bevestigt u het synthesevat aan een mechanisch shaker met variabele snelheid en draait u het vat naar een hoek van 45 graden om de agitatie te maximaliseren. Voeg vervolgens 15 milliliter DCM toe aan de hars. Laat de harskorrels 15 minuten zwellen en voeg vervolgens acht equivalenten van de gewenste polyamine toe aan de hars en laat deze vijf uur reageren.

Na vijf uur voert u een kaiser-test uit om een succesvolle reactie van de polyamine op de hars te bevestigen. Bescherm vervolgens de primaire aminegroep door vier equivalenten van DDE in anhydreus methanol toe te voegen en de reactiemengsel gedurende een nacht te schudden. De volgende dag voert u een kaiser-test uit om succesvolle bescherming te bevestigen door de afwezigheid van blauwe kleur van de harskorrel.

Drain vervolgens het DCM en was de hars twee keer met een twee-op-één mengsel van DCM en DMF. Voeg nu 20 equivalenten van Boc-anhydride in DCM toe aan de hars en laat de reactie drie uur doorgaan. Na het uitvoeren van een chloranil-test om bescherming van de secundaire amine te bevestigen, drain het oplosmiddelmengsel en was de hars twee keer met een twee-op-één mengsel van DCM en DMF.

Voeg vervolgens 10 milliliter van een 2%oplossing van hydrazine in DMF toe aan de hars. Na een uur schudden voert u een kaiser-test uit om succesvolle deprotectie van de primaire amine te bevestigen. Meng vervolgens vier equivalenten van het Fmoc-beschermde aminozuur, 3,95 equivalenten HBTU en 15 equivalenten DIPEA.

Voeg een een-op-één mengsel van DCM en DMF toe en soniceer het cocktail tot volledige oplossing. Zorg ervoor dat het aminozuur, koppelingsmiddel en DIPEA echt gemengd en geactiveerd zijn voordat u het mengsel aan de hars toevoegt. Wacht drie tot vijf minuten om zeker te zijn van activering van de carbonzuur, voeg vervolgens het reactiemengsel toe aan het vat met de hars en laat de reactie twee tot vier uur bij kamertemperatuur doorgaan.

Voer bij elke stap een kaiser- of chloranil-test uit om succesvolle koppeling te bevestigen. Na het uitvoeren van een kaiser-test om succesvolle koppeling te bevestigen, deprotecteert u de Fmoc-groep van het aminozuur door 10 milliliter van een 20%oplossing van 4-Methylpyridine in DMF toe te voegen. Zodra de reactie is voltooid, voert u een kaiser-test uit om succesvolle deprotectie van het aminozuur te bevestigen.

Was vervolgens de hars twee keer met 10 milliliter DMF, waarbij elke was 5 minuten duurt, en ten slotte met 10 milliliter DCM gedurende 10 minuten. Na het koppelen van alle vereiste aminozuren, koppelt u de hydrofobe staart aan het laatste aminozuur door 10 equivalenten van de gewenste carboxylzuurfunctionaliteit toe te voegen aan 9,5 equivalenten HBTU en 12 equivalenten DIPEA. Soniceer het cocktail tot volledige oplossing en voeg vervolgens het cocktail toe aan het vat.

Laat de reactie minstens vijf uur doorgaan, hoewel het raadzaam is om deze 's nachts uit te voeren voor de hoogste opbrengst. Was de hars twee minuten met acht milliliter DMF en twee keer vijf minuten met acht milliliter DCM. Drain voor elke toevoeging het oplosmiddel uit het vat.

Nadat de laatste was is uitgevoerd, droogt u de hars gedurende 15 minuten onder vacuüm. Om 15 milliliter splitsingscocktail te bereiden, voegt u 14 milliliter TFA toe aan 0,5 milliliter water en 0,5 milliliter Triisopropylsilaan. Voeg deze splitsingscocktail toe aan de hars en schud gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur.

Nadat de splitsingsreactie is voltooid, verzamelt u de oplossing in een ronde bodemkolf van 50 milliliter. Concentreer vervolgens de TFA in vacuo tot één tot twee milliliter met behulp van een rotatieve porievap op verlaagde druk, terwijl u het mengsel bij 40 graden Celsius verwarmt. Na verdamping voegt u de verkregen TFA-oplossing druppelsgewijs toe aan een ronde bodemkolf met 15 milliliter anhydreus koud ether om het PPA te precipiteren. Voeg vervolgens 5 milliliter anhydreus koud ether toe aan de originele kolf met de geconcentreerde TFA-oplossing.

Soniceer om extra vaste stoffen te herstellen. Combineer vervolgens met de etheroplossing van de vorige stap. Dek de kolf af en plaats deze 's nachts in de koelkast om precipitatie te maximaliseren.

De volgende dag verzamelt u het geprecipiteerde materiaal door middel van vacuümfiltratie met behulp van een filtertrechter met een fijne of middelgrote poriegrootte. Was tenslotte het precipitaat twee keer met vijf tot tien milliliter koud ether om eventuele resterende organisch materiaal te verwijderen. De HPLC-spoor en MALDI-spectrum bevestigen de aanwezigheid van het PPA-product dat een zuiverheid van meer dan 95% moet hebben voor materiaalkarakterisering of biologische evaluatie.

Er wordt een enkele scherpe piek waargenomen in het UV-gebaseerde HPLC-spoor en het MALDI-spectrum komt overeen met het berekende molecuulgewicht van het PPA binnen plus of min één dalton. De zelfsamenstelling van de PPA's kan worden gevisualiseerd en geanalyseerd door transmissie-elektronenmicroscopie, atoomkrachtmicroscopie, kleinhoekige röntgenstraling, rasterelektronenmicroscopie en dynamische lichtverstrooiing. Succesvolle zelfsamenstelling resulteert in goed gedefinieerde nanostructuren, zowel in transmissie-elektronenmicroscopie als at