Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het microRNA-veld, door het verstrekken van tools om de relatieve lcalisatie van zowel eiwit- als microRNA-moleculen te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u zowel eiwit- als microRNA-moleculen detecteren uit dezelfde weefselsectie. Dit protocol begint met een rehydratie van de op de glijbaan gemonteerde weefsels.

Verwarm de glijbanen op 60 graden Celsius gedurende 10 minuten in de hybridisatieoven. De paraffine moet zichtbaar smelten. Vervolgens, inculbateren van de dia's in een glazen Coplin pot met commercieel beschikbare clearing agent voor 10 minuten.

Doe dit twee keer. Breng vervolgens de glijbanen van wassen om te wassen om de weefsels te hydrateren. Eenmaal gehydrateerd, incubeer de weefsels in proteinase K werkoplossing op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Om de proteinase K te verwijderen, was je de glijbanen twee keer in 1x PBS. Repareer de weefsels. Maak eerst reservoirs op de glijbanen met behulp van een hydrofobe pen om een waterafstotende cirkel rond de preparaten te trekken.

Breng vervolgens 500 microliters van 4%PFA-oplossing aan in de barrière en broed de glijbanen in een rookkap. Om de fixatieve te verwijderen, was de glijbanen in een Coplin pot met PBS gedurende vijf minuten twee keer bij kamertemperatuur. Was vervolgens de glijbanen in 0,13 molaire 1-Methylimidazol gedurende 10 minuten.

Doe dit in de rookkap op kamertemperatuur, en voer deze was twee keer uit. Voeg de EDC fixatief toe en broed een uur lang op kamertemperatuur in een rookkap. Spoel de glijbanen af met 50-millimolar Tris.

Om voor te bereiden op de hybridisatie, eerst bouwen van een bevochtigde kamer. Laad twee stukken filter of tissuepapier in de bodem van een doos en maak het papier nat met een een-op-een mengsel van formamide en 1x SSC. Breng vervolgens 200 microliter voorverwarmde hybridisatieoplossing aan op elke dia en broed de bevochtigde diakamer één tot drie uur bij 50 graden Celsius uit.

Vervang na de incubatie de hybridisatieoplossing door 250 microliters sondeoplossing en bedek de dia's met een RNase-vrije afdekslip. Probeer te voorkomen dat het vangen van luchtbellen onder de cover slip. Nu, zorgvuldig verzegelen de kamer met parafilm, en incubeer de dia's 's nachts op ongeveer 30 graden Celsius onder de RNA smelttemperatuur van de sonde.

Optimalisatie kan nodig zijn. Naast het instellen van de juiste incubatietemperatuur, worden verschillende microRNAs op verschillende niveaus uitgedrukt, dus optimalisatie met betrekking tot de sondeconcentratie kan ook nodig zijn om het optimale signaal te krijgen. Voer na de hybridisatie de snaarstrengenwas uit.

Ten eerste, was in 2x SSC op 50 graden Celsius gedurende vijf minuten, of totdat de cover glijdt los. Voer vervolgens twee wasbeurten uit in 2x SSC bij kamertemperatuur, elk gedurende vijf minuten. Vervolgens, verder bij kamertemperatuur, was de dia's gedurende vijf minuten in 0,2x SSC, gevolgd door vijf minuten in PBST, en ten slotte, vijf minuten in 1x PBS.

Op dit moment zijn de RNA-RNA hybriden stabiel en zijn RNA-strenge voorwaarden niet langer nodig. Voor DIG-antilichaamdetectie moet u eerst de hydrofobe barrières aanraken en gedurende dertig minuten 500 microliters blokkeringsoplossing aanbrengen. Broed de glijbanen bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.

Verwijder vervolgens de blokkeringsoplossing en vervang deze door 500 microliters van DIG-antilichaamoplossing. Broed de glijbanen een uur lang op kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Vervolgens, met behulp van Coplin potten, was de dia's drie keer in PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Was vervolgens twee keer vijf minuten in de pre-kleuroplossing. Breng de dia's vervolgens over naar een polypropyleen-diamailerpot en voeg 20 milliliter AP-substraatoplossing toe. Nu, broed de dia's op 37 graden Celsius gedurende zes tot 24 uur, beschermd tegen het licht.

Bij het eerste gebruik van AP substraat, is het belangrijk om de reactie te volgen. Controleer op intervallen van twee uur de kleurontwikkeling op de dia's met behulp van een microscoop, totdat een optimale incubatietijd is bepaald. Om het overtollige AP-substraat te verwijderen, was je de glijbanen twee keer in KTBT-oplossing gedurende vijf minuten per wasbeurt, gevolgd door één wasbeurt in PBS gedurende vijf minuten.

Om het cTNT-antilichaam te detecteren, moet u eerst de weefsels een uur lang blokkeren. Breng vervolgens 200 microliter cTNT-antilichaamoplossing aan en broed de dia's 's nachts uit bij 4 graden Celsius in een bevochtigde kamer. De volgende dag, was de glijbanen in een Coplin pot met PBS gedurende vijf minuten.

Doe dit drie keer. Breng vervolgens 250 microliter anti-konijn 568 antilichaamoplossing aan en broed de glijbanen een uur lang uit bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Om het overtollige secundaire antilichaam uit te wassen, gebruik je drie wasbeurten van vijf minuten in PBS.

Breng vervolgens, indien gewenst, 250 microliter DAPI-werkoplossing aan en broed de dia's gedurende één minuut uit, beschermd tegen licht. Om de overtollige DAPI-vlek te verwijderen, gebruikt u twee PBS-wasbeurten van vijf minuten en monteert u na de wasbeurten de dia's. MicroRNA in-situ hybridisatie werd geoptimaliseerd op muishartsecties met behulp van een vervormd microRNA voor negatieve controle, en een U6 snRNA als een positieve controle.

Cardiomyocyte-specifieke expressie van microRNA-182 werd beoordeeld in hartsecties van controle en PlGF-overexpresserende muizen. De muizen droegen een PlGF-transgeen onder een alpha-MHC promotor, en ontwikkelden cardiale hypertrofie, secundair aan verhoogde angiogenese, binnen zes weken na transgene activering. Het kleuringsprotocol toonde een verhoogde expressie van microRNA-182 in de harten van PlGF muizen.

Vervolgens, om te bepalen welke celtypen microRNA-182 uitdrukten, werden dezelfde secties immunostained voor cTNT. DAPI vlekken werd ook gebruikt. In zowel controle- als PlGF-muishartsecties werd microRNA-182 gevonden in het nucleaire compartiment van cTNT-positieve cardiomyocytecellen.

Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe microRNAse hybridisatie uit te voeren, gevolgd door eiwit immunostaining. Tijdens een poging tot deze procedure, is het zeer belangrijk om te onthouden om RNAse-vrije omstandigheden te houden gedurende de dag een, tijdens alle stappen in de aanloop naar prop hybridisatie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals westerse vlek in een real-time PCR worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals, wat zijn de relatieve expressieniveaus van dit specifieke microRNA in verschillende weefsels, of dit specifieke eiwit in dezelfde weefselsectie.

Vergeet niet dat het werken met fixatieven zoals PFA en ADC zeer gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen, waaronder het dragen van handschoenen en labjassen, evenals het gebruik van rookkappen, moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.