Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie
10 juni 2018
Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.
De LIF-3i-methode zet conventionele humane pluripotente stamcellen terug in een meer primitieve pluripotente toestand met biochemische, transcriptionele en epigenetische kenmerken van de humane pre-implantatie epiblast. Deze methode verbetert de functionaliteit van conventionele humane pluripotente stamcellen door de door lijnen vooraf bepaalde genexpressie te verminderen en de interlijnvariabiliteit van gerichte differentiatie, die vaak wordt waargenomen bij onafhankelijke hPSC-lijnen, uit te wissen. Met behulp van deze methode behouden chemisch teruggezette humane pluripotente stamcellen karyotypische en epigenoomstabiliteit na langdurige passage, ook op geïmprente loci, en kunnen ze direct worden gedifferentieerd met verbeterde efficiëntie zonder dat een herprogrammeringsstap vereist is.
De LIF-3i-methode zal nieuwe wegen openen voor onderzoek naar de vroege menselijke ontwikkelingsbiologie en kan de regeneratieve geneeskunde bevorderen door de differentiatie, gentargeting en de generatie van interspecifieke chimera's van humane pluripotente stamcellen te verbeteren. Om het protocol te starten, moeten conventionele humane pluripotente stamcellen of hPSC's met gevalideerde normale karyotypen worden onderhouden en uitgebreid in co-culturen met een muis embryonale fibroblast of MEF-gebaseerd feedercultuursysteem of in een feeder-vrij cultuursysteem. Bereid MEF-feeders voor in een eerder voorbereide gelatiniseerde zes-wellplaat ten minste een dag voor het passeren van de LIF-5i-aangepaste conventionele hPSC-culturen.
Nadat de conventionele hPSC-culturen ongeveer 50%confluency hebben bereikt, vervangt u het standaard hESC-cultuurmedium door twee milliliter per well van Leukemia Inhibitory Factor 5i of LIF-5i-medium. Cultiveer en onderhoud de conventionele hPSC's en MEF's gedurende maximaal twee dagen in LIF-5i in een CO2-incubator. Ververs het LIF-5i-medium dagelijks om ze aan te passen voor hun volgende passage en stabiele revertering in LIF-3i.
Voor de feeder-vrije conventionele culturen, cultiveer hPSC in LIF-5i slechts een nacht voordat u de volgende ochtend passeert. Was voorafgaand aan het passeren de LIF-5i-aangepaste conventionele hPSC's eenmaal met PBS en voeg een milliliter celdissociatiereagens toe aan elke well. Incubeer vervolgens de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator.
Na incubatie, tritureer de cellen voorzichtig met een pipetteerpijpje in een enkele celsuspensie terug. Verzamel de celsuspensie in het hESC-medium in ten minste een tweevoudige verdunning in een steriele, 15-milliliter conische buis en tritureer de cellen voorzichtig door pipetteren om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 g.
Na het centrifugeren, aspireert en gooit u het supernatant weg en suspendeert u het cellenpellet in één tot twee milliliter LIF-5i-medium. Tel vervolgens de cellen. Was de voorgeplaatste zes-well MEF-plaat twee keer met twee milliliter PBS per well.
Distribueer een tot twee keer 10 tot de zesde cellen in twee milliliter LIF-5i-medium in één well van de PBS-gewassen MEF-plaat. Plaats de plaat in een CO2-incubator. De volgende dag, draai zachtjes met de plaat om alle niet-gehechte cellen op te tillen en aspireert u het medium en vervangt u het medium door twee milliliter LIF-5i-medium.
Herhaal deze stap dagelijks gedurende drie tot vijf dagen of tot de cellen 60 tot 70%confluency zijn. Dit protocol ondersteunt snelle en bulkmatige naive-achtige revertering van een groot aantal humane embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellijnen, zolang humane pluripotente stamcelpreparaten met opmerkelijke differentiatie of abnormale karyotypen zorgvuldig worden uitgesloten. Na de initiële LIF-5i-aanpassing, passeer de volgende stabiele LIF-3i-culturen elke drie tot vier dagen in een bioveiligheidskast of wanneer de culturen 60 tot 70%confluency bereiken.
Gooi het cultuurmedium weg en was elke well van de LIF-5i-LIF-3i-culturen door voorzichtig twee milliliter PBS toe te voegen. Gooi het PBS weg en voeg een milliliter celafscheidingsoplossing toe. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator.
Na incubatie, verzamel de celsuspensie, voeg onbehandeld hESC-medium toe in een tweevoudige verdunning en tritureer de cellen voorzichtig door pipetteren om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Breng de suspensie over in een steriele 15-milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 g en aspireert en gooit u het supernatant weg.
Suspendeer het pellet in LIF-3i-medium en tel vervolgens de cellen. Plateer vervolgens twee keer 10 tot de vijfde cel per well op de bestraalde MEF in de gelatiniseerde zes-wellplaat voor routinematige passering van LIF-3i-culturen. Voor de initiële LIF-5i-aangepaste culturen, plaats een aanvankelijk hogere dichtheid voorafgaand aan de eerste passage in LIF-3i MEF.
Individuele humane pluripotente stamcellijnen moeten worden geoptimaliseerd en aangepast aan hoge initiële beplatingsdichtheden indien nodig om continue bulkpassagering tijdens de vroege passages van LIF-3i-reverteringscultuur te onderhouden. Plateer opnieuw en verdeel de LIF-5i-aangepaste hPSC's op verse, PBS-gewassen, bestraalde MEF-feederplaten in het LIF-3i-medium. Vervang het LIF-3i-medium dagelijks.
Passeer N-hPSC gedurende minimaal vier tot zeven continue bulkpassages in het LIF-3i-medium voordat N-hPSC wordt gebruikt in functionele studies of cryopreservering. Noteer het aantal passages van N-hPSC in conventionele of LIF-3i media. Immunofluorescente vlekken en western blot detecteerden de expressie van de geactiveerde gefosforileerde en totale isoformen van STAT3 en Erk1/2, belangrijke markers van moleculaire pluripotentie.
Hematoxyline en eosinekleuring van teratoma microsecties onthulden robuuste differentiatie in alle drie de kiembanden met goed gestructureerde ectoderm, mesoderm en endoderm lijnen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u conventionele humane pluripotente stamcellen effici
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De LIF-3i-methode zet conventionele humane pluripotente stamcellen (hPSCs) efficiënt terug naar een naïeve, preimplantatie epiblast-achtige toestand. Dit protocol verbetert de differentiatiecapaciteiten en vermindert de expressie van genen die voor specifieke kiemlagen geprimed zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Conventionele hPSCs vertonen variabiliteit in differentiatie.
- Naïeve pluripotente toestanden zijn cruciaal voor het begrijpen van de vroege ontwikkeling.
- Verbeterde differentiatiemethoden zijn nodig voor regeneratieve toepassingen.
- De LIF-3i-methode biedt een oplossing voor deze uitdagingen.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het terugbrengen van hPSCs naar een naïeve staat.
- Om de efficiëntie van gerichte differentiatie te verhogen.
- Om de variabiliteit tussen verschillende hPSC-lijnen te verminderen.
Gebruikte methoden
- Co-cultuur met embryonale fibroblasten van muis (MEFs).
- Feeder-vrije cultuursystemen.
- Preparatie van gelatiniseerde zes-well platen voor MEF-feeders.
- Uitgebreide passage van gereverteerde hPSCs om de stabiliteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle reversie van hPSCs naar een stabiele naïeve staat.
- Waargenomen afname van de expressie van lineage-geprimede genen.
- Verbeterde differentiatie-efficiëntie zonder her-priming.
- Behoud van karyotypische en epigenomische stabiliteit.
Conclusies
- De LIF-3i-methode opent nieuwe wegen in de humane ontwikkelingsbiologie.
- Het kan toepassingen binnen de regeneratieve geneeskunde bevorderen.
- Dit protocol zou gene targeting en chimeeronderzoek kunnen faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt de bulkreversie van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïeve staat mogelijk, waardoor de variabiliteit tussen lijnen in differentiatieresultaten wordt verminderd en de functionele pluripotentie wordt verbeterd. Door de differentiatie-efficiëntie te verhogen zonder her-priming, ondersteunt het voorspelbaardere preklinische modellering en vermindert het de risico's bij doelwitvalidatie in pijplijnen voor regeneratieve geneeskunde. De reproduceerbaarheid van de methode over diverse hESC- en transgene-vrije hiPSC-lijnen faciliteert schaalbare, gestandaardiseerde workflows voor vroege ontdekking en translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door lineage-geprimede hPSCs te resetten naar een ontwikkelingsbiologisch vroeger stadium met verminderde epigenetische ruis.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via isogene vergelijkingen tussen naïef-achtige en geprimede toestanden om het werkingsmechanisme te verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in differentiatie-assays door interlijn-variabiliteit te minimaliseren, wat de identificatie van lead-compounds bemoeilijkt.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert stabiele, karyotypisch normale naïeve-achtige hPSCs die geschikt zijn voor high-throughput screeningplatforms die consistente cellulaire responsen vereisen.
- Kwantitatieve output: Ondersteunt meetbare differentiatie-efficiënties over de kiembladeren heen, wat robuuste dosis-responsen en fenotypische screening mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Maakt bulkreversie mogelijk zonder clonale selectie, wat grootschalige assay-voorbereiding en reagentia-screeningcampagnes ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Biedt een ontwikkelingsbiologisch accuraat menselijk pre-implantatie epiblast-achtig systeem voor het modelleren van vroege ontwikkelingsstoornissen.
- Translationele continuïteit: Handhaaft epigenomische stabiliteit op geïmprinte loci, wat een betrouwbare extrapolatie naar in vivo differentiatie en teratoomvorming ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Elimineert intercellulaire variabiliteit bij gerichte differentiatie, waardoor het aantal fout-negatieven/positieven in preklinische effectiviteitsstudies wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De sequentiële methode van LIF-5i naar LIF-3i integreert in discovery-workflows door gestandaardiseerde generatie van de naïeve staat mogelijk te maken voorafgaand aan differentiatie-assays, lead-identificatie en preklinische validatiefasen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten via isogene vergelijkingen van naïeve-achtige versus geprimde hPSC-toestanden om doelmechanismen en padafhankelijkheden te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, differentiatie-competente celpopulaties voor assay-standaardisatie en compound-screening met verminderde variabiliteit tussen de wells.
- Analytics: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk van de efficiëntie van trilineaire differentiatie en normalisatie van genexpressie voor vergelijkingen tussen verschillende condities.
- Translational Research: Handhaaft epigenomische en karyotypische stabiliteit gedurende uitgebreide passage, wat longitudinale preklinische studies en biomarker-afstemming ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een reversibele, platformonafhankelijke methode voor het genereren van naïeve-achtige hPSCs over meerdere projecten en cellijnen, waardoor redundante optimalisatie wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in differentiatieresultaten door verminderde lineage-primed signalering en verbeterde stabiliteit van de pluripotentie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerd, feeder-compatibel of feeder-vrij protocol met minimale manipulatie en een hoge reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door biologische ruis in differentiatie-assays te minimaliseren, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van cellijnen mogelijk op basis van functionele resetcapaciteit in plaats van variabiliteit in de genetische achtergrond.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, inclusief passageren, dissociatie en validatie van pluripotentiemarkers.
- Afhankelijk van een CO2-incubator, biologische veiligheidskabinet en standaard celkweekapparatuur voor MEF-cocultuur of feeder-vrije adaptatie.
- Vereist een gestandaardiseerde mediumformulering inclusief LIF, GSK3β- en MEK/ERK-remmers, en tankyrase-remmer XAV939 voor LIF-3i, met optioneel forskoline en purmorfamine voor LIF-5i adaptatie.
- Vereist validatie van een normaal karyotype en een lage spontane differentiatie in de startende hPSC-lijnen om een succesvolle reversie te garanderen.
- Adaptatie over verschillende modelsystemen kan optimalisatie vereisen van de initiële plating-dichtheid en de duur van de LIF-5i blootstelling voor clonale expansie.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
