Name: Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Leer hoe de LIF-3i-methode conventionele menselijke pluripotente stamcellen terugbrengt naar een naïve toestand met verbeterde differentiatiecapaciteit en verminderde lijnvariabiliteit voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland stamcel onderzoeksfonds (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award en de Moseley Foundation.

<ol><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Human+Naive+Pluripotency+in+the+Embryo+and+in+the+Dish%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish.</a> Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).</li>
<li>Zimmerlin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+promotes+a+stable+human+naive+pluripotent+state+with+improved+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality.</a> Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16388305">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).</li>
<li>Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24513647">Chromosome preparation from cultured cells.</a> J Vis Exp. (83), e50203(2014).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293(2011).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-activated+stem+cell+circuits+and+stromal+signals+cooperatively+accelerate+non-integrated+iPSC+reprogramming+of+human+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors.</a> PLoS One. 7 (8), 42838(2012).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Collier, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Cell+Surface+Protein+Profiling+Identifies+Specific+Markers+of+Human+Naive+and+Primed+Pluripotent+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+distinct+states+of+human+naive+pluripotency+generated+by+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming.</a> Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Pluripotent+Stem+Cells+with+In+Vivo+Embryonic+and+Extraembryonic+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.</a> Cell. 169 (2), 243-257 (2017).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+simultaneous+generation+of+hematopoietic+and+vascular+progenitors+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+progenitors+from+cord+blood-derived+induced+pluripotent+stem+cells+possess+augmented+capacity+for+regenerating+ischemic+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature.</a> Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).</li>
<li>Taapken, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karotypic+abnormalities+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).</li>
<li>Mitalipova, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+copy+number+of+pluripotency+and+cell+proliferation+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+during+reprogramming+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+and+selection+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.</a> Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).</li>
</ol>

Onder een licentie-overeenkomst tussen de technologieën van het leven en de Johns Hopkins University (JHU), heeft Dr. Zambidis recht op een deel van de royalty's, ontvangen door de Universiteit voor licentiëring van stamcellen. De bepalingen van deze overeenkomst worden beheerd door JHU overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling. Dit neemt niet weg dat de naleving van de auteurs dagboek beleid over het delen van gegevens en materialen.

De LIF-3i-systeem geldt een gewijzigde versie van de klassieke lymfkliertest 2i naïef terugkeer cocktail1 voor menselijke pluripotente stamcellen. De zelf-vernieuwing van hPSC (die kan niet uitbreiden in 2i alleen) is gestabiliseerd in LIF-2i beogen deze cocktail met XAV939 van de tankyrase-remmer. LIF-3i cultuur kunt bulk en efficiënte terugkeer van de conventionele hPSC naar een toestand van de pluripotente die lijkt op de menselijke voor inplanting epiblast<sup class="x...

Het 2i (MEK/ERK en GSK3β-remmer) cultuur systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld om heterogene serum gebaseerde muis embryonale stamcellen (mESC) culturen tot een uniforme grondtoestand van pluripotent verwant aan de muis voor inplanting epiblast1te verfijnen. 2i biedt echter geen ondersteuning voor de stabiele onderhoud van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) lijnen2. De verschillende complexe klein molecuul, groeifactor-aangevuld, en transgene benaderingen hebben onlangs gemeld om vast te leggen van vermeende soortgelijke menselijke naïef-achtige pluripotente moleculaire stelt2. Echter veel van de "naïeve-achtige" toestanden aangemaakt met deze methoden ook tentoongesteld karyotypic instabiliteit, epigenomic gebreken (bijvoorbeeld globale verlies van ouderlijke genomic imprinting), of verminderde potentiële differentiatie.
In contrast, de cocktail van triple chemische remming van GSK3β, ERK en tankyrase signalering en leukemie remmende factor (LIF-3i) was voldoende om de stabiele naïef-achtige terugkeer van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen3. LIF-3i-teruggekeerd naïef hPSC (N-hPSC) onderhouden van normale karyotypes en verhoogde hun uitdrukkingen van naïef-specifieke menselijke voor inplanting epiblast genen (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i terugkeer ook verleende hPSC met een array van moleculaire en biochemische kenmerken die uniek zijn voor mESC-achtige naïef pluripotent die verhoogde gefosforyleerd STAT3 signalering opgenomen, daalde ERK fosforylatie, global 5-methylcytosine-apr hypomethylation, genoom-brede apr demethylatie op embryonale stamcellen (ESC)-specifiek gen initiatiefnemers en dominante distale OCT4 versterker gebruik. Bovendien, in vergelijking met andere naïef terugkeer methoden die in aberrantly hypomethylated resulteerde bedrukt genomic loci, N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd waren verstoken van systematische verlies van ingeprinte CpG patronen of DNA methyltransferase expressie (b.v., DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Een directe LIF-3i cultuur van een breed scala aan conventionele menselijke embryonale cellen (hESC) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) gegroeid op feeders of E8 feeder-vrij voorwaarden bereikt snelle en bulk terugkeer naar een naïef epiblast-achtige toestand. Directe LIF-3i naïef terugkeer kan evenwel in sommige unstable conventionele hPSC lijnen als gevolg van de inherente genomic en lineage-primer variabiliteiten die voortvloeien uit de genetisch divers donor achtergronden inefficiënt.
Dus, het verbreden van het nut van de LIF-3i-methode, een stapsgewijze optimalisatie werd ontwikkeld en hierin wordt gepresenteerd waarmee universele naïef terugkeer met bijna elke conventionele hESC of transgenic-vrije hiPSC lijn gekweekte op feeders. Deze universalized naïef terugkeer methode maakt gebruik van een voorbijgaande eerste cultuur stap in conventionele hPSC dient als aanvulling op de LIF-3i cocktail met twee extra kleine moleculen (LIF-5i) die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. Één van de eerste passage van conventionele hPSC in LIF-5i past hen tot latere stabiele LIF-3i terugkeer in grote hoeveelheden. Eerste LIF-5i aanpassing verhoogt aanzienlijk de eerste eencellige klonale verspreiding van conventionele hPSC geteeld op E8 of feeders (vóór hun latere stabiele, continue passage in LIF-3i alleen). Conventionele hPSC lijnen aangepast eerst tolereren op één passage in LIF-5i latere bulk klonale passaging van cellen naïef-teruggekeerd in LIF-3i voorwaarden, die ondervangt de behoefte aan plukken en subcloning van de zeldzame stabiele kolonies, of het routinematig gebruik van anti-apoptotic moleculen of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmers.
De methode LIF-3i heeft gewerkt voor stabiel uitbreiden en onderhouden van een breed repertoire van > 30 onafhankelijke, genetisch divers conventionele hPSC lijnen voor > 10 – 30 passages met behulp van beide methoden niet-enzymatische of enzymatische dissociatie, en zonder bewijs van inductie van chromosomale of epigenomic voorkomende afwijkingen, waaronder afwijkingen op ingeprinte gene loci. Bovendien, sequentiële LIF-5i/LIF-3i cultuur is de enige naïef terugkeer methode die tot nu toe heeft gemeld dat de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen verbetert door het verlagen van hun afkomst-primer genexpressie en drastisch verbeteren van hun potentie multipotente differentiatie. De LIF-3i naïef terugkeer methode wist de inherente zal variabiliteit van differentiatie van lineage-primer, conventionele hPSC lijnen interline, en een groot nut van toepassing in de regeneratieve geneeskunde en cellulaire therapieën.

<table><tbody><tr><td>anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>561716</td><td>gebruik 5&micro;L per test (FACS)</td></tr><tr><td>anti- TFCP2L1 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA029708</td><td>gebruik bij een 1:100 verdunning (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-beta-Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6276</td><td>gebruik bij 1:5000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-CD146 antibody,&nbsp; PE conjugated&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td>gebruik 5&micro;L per test (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody, APC conjugated</td><td>eBioscience</td><td>17-0319-42</td><td>gebruik 2&micro;L per test (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 microbead kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>anti-NANOG antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109250</td><td>gebruik bij een 1:100 verdunning (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-NR5A2 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA005455</td><td>gebruik bij een 1:100 verdunning (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4695</td><td>gebruik bij 1:1000 (Western blot), voor detectie van totaal eiwit</td></tr><tr><td>anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>gebruik bij 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9145</td><td>gebruik bij 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td><td>Agilent</td><td>E0432</td><td>gebruik bij een 1:500-1:1000 verdunning (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435A</td><td>gebruik 5&micro;L per test (FACS)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC1435G</td><td>gebruik bij 1:50 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9139</td><td>gebruik bij 1:1000 (Western blot), voor detectie van totaal eiwit</td></tr><tr><td>anti-STELLA/DPPA3 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4388</td><td>gebruik bij een 1:50 verdunning (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC4770R</td><td>gebruik bij&nbsp; een 1:50 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0068</td><td>gebruik bij een 1:100 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td>gebruik bij een 1:100 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560193</td><td>gebruik 10&micro;L per test (FACS)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560161</td><td>gebruik 10&micro;L per test (FACS)</td></tr><tr><td>APEL2-Li</td><td>StemCell Technologies</td><td>5271</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere dilution buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td>verdunningsmiddel voor Vitronectin XF&trade; matrix</td></tr><tr><td>CF1 mouse</td><td>Charles river</td><td>023</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&amp;D System</td><td>L5283</td><td>reconstituteer bij 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>confocal microscope system</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>cord blood CD34+ derived iPSC line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>ook wel aangeduid als 6.2 line</td></tr><tr><td>Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Countess&nbsp; cell counting chamber slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 (E8) medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Stemgent</td><td>04-0025</td><td>reconstituteer bij 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Gelatin (porcine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>resuspendeer in water en steriliseer met een autoclaaf</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene cryogenic vials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>reconstituteer bij 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Stemgent</td><td>04-0009</td><td>reconstituteer bij 10mM in DMSO</td></tr><tr><td>recombinant human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>

chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde multilineage differentiatie potentie

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Naïef menselijke pluripotente stamcellen (N-hPSC) met verbeterde functionaliteit wellicht een brede uitstraling in de regeneratieve geneeskunde. Het doel van dit protocol is efficiënt lineage-primer, conventionele menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) bijgehouden op feeder-vrije of feeder-afhankelijke voorwaarden aan een naïef-achtige pluripotent met verbeterde functionaliteit te herstellen. Deze chemische naïef terugkeer methode maakt gebruik van de klassieke leukemie remmende factor (LIF), GSK3β, en MEK/ERK inhibitie cocktail (LIF-2i), aangevuld met alleen een tankyrase-remmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i hersteld conventionele hPSC een stabiele pluripotente staat aanneming van biochemische, transcriptionele en epigenetische kenmerken van de menselijke pre-implantatie-epiblast. Deze methode LIF-3i vereist minimale cel cultuur manipulatie en is zeer reproduceerbaar in een breed repertoire van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en menselijke transgenic-vrije geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen. De LIF-3i-methode vereist geen een opnieuw aanzuigende stap vóór de differentiatie; N-hPSC rechtstreeks met extreem hoge efficiëntie kan worden gedifferentieerd en onderhouden van karyotypic en epigenomic stabilities (ook op ingeprinte loci). Het vergroten van de universaliteit van de methode, worden de conventionele hPSC eerst gekweekt in de cocktail van de LIF-3i aangevuld met twee extra kleine moleculen die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) signalering. Deze korte LIF-5i aanpassing stap aanzienlijk verbetert de eerste klonale uitbreiding van conventionele hPSC en vergunningen kunnen worden vervolgens naïef-teruggekeerd met LIF-3i alleen in grote hoeveelheden, dus het wegnemen van de noodzaak van picking/subcloning zeldzame N-hPSC kolonies later. LIF-5i-gestabiliseerde hPSCs worden vervolgens bijgehouden in LIF-3i alleen zonder de noodzaak van anti-apoptotic moleculen. Bovenal verbetert LIF-3i terugkeer aanzienlijk de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC door dalende hun lineage-primer genexpressie en wissen van de interline variabiliteit van gestuurde differentiatie algemeen waargenomen onder onafhankelijke hPSC lijnen. Representatieve karakterisaties voor N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd zijn verstrekt, en experimentele strategieën voor functionele vergelijkingen van isogene hPSC in bloedlijn-primer vs. naïef-achtige Staten worden beschreven.

Dit protocol optimaliseert efficiënte naïef-achtige terugkeer met LIF-3i in beide culturen feeder-afhankelijke en feeder-onafhankelijke lineage-primer conventionele hPSC (Figuur 1). Het gedetailleerd protocol, beschreven hierin, omtrekken sequentiële aanpassing aan LIF-3i vanaf beide feeder-afhankelijke- of feeder-vrije conventionele hPSC voorwaarden (bijvoorbeeld E8 medium).
Vertegenwoordi...

Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

De LIF-3i-methode zet conventionele humane pluripotente stamcellen terug in een meer primitieve pluripotente toestand met biochemische, transcriptionele en epigenetische kenmerken van de humane pre-implantatie epiblast. Deze methode verbetert de functionaliteit van conventionele humane pluripotente stamcellen door de door lijnen vooraf bepaalde genexpressie te verminderen en de interlijnvariabiliteit van gerichte differentiatie, die vaak wordt waargenomen bij onafhankelijke hPSC-lijnen, uit te wissen. Met behulp van deze methode behouden chemisch teruggezette humane pluripotente stamcellen karyotypische en epigenoomstabiliteit na langdurige passage, ook op geïmprente loci, en kunnen ze direct worden gedifferentieerd met verbeterde efficiëntie zonder dat een herprogrammeringsstap vereist is.De LIF-3i-methode zal nieuwe wegen openen voor onderzoek naar de vroege menselijke ontwikkelingsbiologie en kan de regeneratieve geneeskunde bevorderen door de differentiatie, gentargeting en de generatie van interspecifieke chimera's van humane pluripotente stamcellen te verbeteren. Om het protocol te starten, moeten conventionele humane pluripotente stamcellen of hPSC's met gevalideerde normale

chemical-reversion-conventional-human-pluripotent-stem-cells-to-nave

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Het genereren van gedifferentieerde celtypen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) houdt een grote therapeutische belofte in, maar blijft uitdagend. PSCs vertonen vaak een inherent onvermogen om te differentiëren, zelfs wanneer ze worden gestimuleerd met een juiste reeks signalen. Hier beschreven is een eenvoudig hulpmiddel om de multi Lineage-differentiatie over verschillende PSC-lijnen te verbeteren.

Voorbijgaande behandeling van menselijke pluripotente stamcellen met DMSO om differentiatie te bevorderen

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Leer hoe de LIF-3i-methode conventionele menselijke pluripotente stamcellen terugbrengt naar een naïve toestand met verbeterde differentiatiecapaciteit en verminderde lijnvariabiliteit voor regeneratieve geneeskunde.

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie (Video) | JoVE Journal

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie

Meer video's verkennen