Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties
29 juni 2018
Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.
Deze methode kan wetenschappers helpen om productief gebruik van pancreatische eilandjes te maximaliseren om meerdere resultaten op elke monster in zijn oorspronkelijke weefselarchitectuur te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe inbeddingsmethode is dat de eilandjes gelijkmatig verdeeld zijn over een goed gedefinieerd gebied, waardoor veel eilandjes in het snijvlak komen te liggen, wat de experimentele opbrengst van dit materiaal met een lage abundantie optimaliseert. De procedure wordt gedemonstreerd door Doctor Yahui Kong, een onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium.
Om deze procedure te beginnen, gebruikt u een laag bindende p200 pipettip en een gekalibreerd raster onder een stereomicroscoop om handmatig 250 eilandje-equivalenten te plukken. Breng ze over in elk 1,5 milliliter laag bindend microfugebuisje. Laat de eilandjes naar de bodem van het microfugebuisje zakken.
Gebruik vervolgens een pipet met een nieuwe p200 tip om voorzichtig het grootste deel van de supernatant te verwijderen. Zorg ervoor dat u geen eilandjes verwijdert. Voeg een milliliter PBS toe en centrifugeer in een draaischijfcentrifuge tot de snelheid 200 keer de zwaartekracht bereikt en stop vervolgens met draaien.
Verwijder de supernatant. Herhaal dit hele PBS wasproces voor een totaal van twee wascycli. Voeg vervolgens 500 microliter van een 10% formalineoplossing of 4% vers gemaakt paraformaldehyde toe.
Laat het monster 30 minuten bij kamertemperatuur fixeren. Gebruik vervolgens een pipet met een p200 tip om het fixeermiddel te verwijderen. Voeg een milliliter PBS toe en centrifugeer tot de snelheid 200 keer de zwaartekracht bereikt en stop vervolgens met draaien.
Verwijder de supernatant en herhaal vervolgens het hele PBS wasproces nog eens voor een totaal van twee wascycli. Bereid het gewenste gel voor in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats vervolgens deze microcentrifugebuisjes in een heatblock op 70 graden Celsius om het gel te verwarmen.
Gebruik een gesneden micropipettip om 10 microliter agarose blauwe kralen per monster over te brengen in een schone 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg een milliliter PBS toe aan de kralen en centrifugeer vervolgens 800 keer de zwaartekracht gedurende één minuut. Verwijder de PBS en herhaal deze wassing nogmaals.
Na de tweede wassing, re-suspendeer de kralen in een geschikte hoeveelheid PBS. Centrifugeer de buisjes met de eilandjes tot de snelheid 200 keer de zwaartekracht bereikt en stop vervolgens met draaien. Verwijder het grootste deel van de supernatant.
Gebruik een schaar om het uiteinde van één 10 microliter micropipettip voor elk monster af te snijden. Voeg 10 microliter kralen toe aan elk eilandjebuisje met behulp van een schone afgesneden tip voor elk monster. Centrifugeer vervolgens tot de snelheid 200 keer de zwaartekracht bereikt.
Gebruik vervolgens een ongesneden 200 microliter gevolgd door een 10 microliter tip om zoveel mogelijk PBS te verwijderen. Label de microscoopglazen voor monsteridentificatie en plaats ze op de werkbank nabij de heatblock met het verwarmde gel. Gebruik een schaar om de uiteinden van een paar laag bindende micropipettips per monster af te snijden.
Gebruik een micropipet voorzien van een gesneden tip om warm gel toe te voegen aan een buis met eilandjes en kralen. Meng onmiddellijk terwijl u het creëren van luchtbellen vermijdt. Breng dit mengsel aan op een dia terwijl u een schijf dicht bij de rand van de dia vormt en ruimte laat voor de buitenste gelring.
Tik vervolgens zachtjes een paar keer op de dia om de eilandjes en kralen te laten zakken. Voeg 20 microliter warm gel toe aan de monsterbuis en meng het nieuwe gel met eventuele resterende eilandjes en kralen. Breng dit mengsel aan op dezelfde dia rond de oorspronkelijke schijf.
Herhaal indien nodig met verse voorgesneden tips voor elke toepassing totdat de schijf de gewenste grootte en dikte heeft. Zorg ervoor dat u elke schijf afzonderlijk bereidt en houd rekening met de volgorde van de monsters als u meerdere schijven op elke kant plaatst. Plaats vervolgens de dia's op een platte oppervlakte van nat ijs en dek ze af.
Laat de dia's 10 minuten rusten of totdat het gel gestold is. Verwijder vervolgens de dia's en zorg ervoor dat u de achterkant van elk droogt. Label een biopsie verwerkings- en inbeddingsweefselcassette voor elk monster.
Gebruik de stompe kant van een scheermes om voorzichtig de schijf vanuit elke richting te duwen om deze los te maken van het glas. Wanneer het gemakkelijk glijdt, duwt u de schijf langzaam van de dia en plaatst u de schijf plat op het papier. Het kan moeilijk zijn om de afzonderlijke schijven intact te houden terwijl u ze van de glazen dia naar het papier verplaatst.
Als er een kreuk in de schijf optreedt, laat deze terugkeren naar de oorspronkelijke positie, voeg meer gel toe en gel de dia opnieuw. Vouw het papier rond de schijf om beweging te voorkomen. Breng dit over in de cassette en sluit vervolgens de cassette.
Dompel de cassette onder in een beker gevuld met PBS. In deze studie wordt een aangepaste gel schijf gebaseerde inbeddingsmethode gebruikt om efficiënt een hoog rendement van eilandjes per sectie te genereren. De morfologie van knaagdiereilandjes is merkbaar meer intact na post-isolatie herstel in eilandjemedium dat een gladde ronde oppervlak en een compacte sferische vorm vertoont.
Het feit dat de morfologie van menselijke eilandjes vergelijkbaar is, ongeacht of ze op de dag van aankomst of na post verzendherstel 's nachts zijn ingebed, kan te wijten zijn aan het feit dat de eilandjes zich herstellen van isolatiestress vóór verzending. In vergelijking zijn de paraffine secties verkregen via de oude microbuistechniek, kleiner in weefseldoorsnede en met minder eilandjes per sectie en met dicht opeengepakte eilandjes en kralen. Zoals hier getoond, kan deze techniek hoge kwaliteit eilandjes secties produceren voor histologische en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor het genereren van hoogwaardige paraffinesneden van volledige gekweekte pancreaseilanden, wat hun gebruik in diabetesonderzoek verbetert. De techniek maakt een efficiënte beoordeling van meerdere uitkomsten mogelijk, terwijl de natuurlijke driedimensionale architectuur van de eilandjes behouden blijft.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Diabetesonderzoek
Achtergrond
- Ex vivo studies van pancreaseilandjes zijn cruciaal voor het begrijpen van diabetes.
- Traditionele methoden voor het bestuderen van eilandjes zijn vaak inefficiënt en worden onvoldoende benut.
- Het behoud van de oorspronkelijke architectuur van het eilandje is essentieel voor een nauwkeurige beoordeling.
- Deze nieuwe methode is erop gericht de opbrengst en kwaliteit van de experimentele resultaten te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige en efficiënte methode voor het inbedden van eilandjes van Langerhans te introduceren.
- Om de experimentele opbrengst van pancreasmateriaal met een lage abundantie aan eilandjes te optimaliseren.
- Om de beoordeling van meerdere uitkomsten per monster te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een low-binding p200 pipetpunt voor de selectie van eilandjes.
- Handmatige selectie van 250 islet equivalents onder een stereomicroscoop.
- Overbrengen van de eilandjes naar low-binding microcentrifugebuisjes.
- De eilandjes laten bezinken voor een optimale sectie.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe inbeddingsmethode maakt een gelijkmatige verdeling van de eilandjes mogelijk.
- Veel eilandjes worden in het snijvlak geplaatst, wat de opbrengst verhoogt.
- De procedure wordt gedemonstreerd door dokter Yahui Kong.
- De verbeterde methodologie ondersteunt betere resultaten in diabetesonderzoek.
Conclusies
- Deze methode verbetert de studie naar pancreaseilandjes aanzienlijk.
- Het biedt een efficiëntere aanpak voor onderzoek naar eilandjes.
- Toekomstige studies kunnen profiteren van deze verbeterde techniek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze methode pakt de uitdaging van de beperkte beschikbaarheid van pancreaseilandjes in diabetesonderzoek aan door hoogrendement paraffine-coupes van gekweekte eilandjes mogelijk te maken, terwijl de oorspronkelijke architectuur behouden blijft. Het ondersteunt mechanistische risicoreductie door celtype-specifieke analyse en meerdere uitkomstmetingen vanuit hetzelfde monster mogelijk te maken, wat het voorspellend vertrouwen bij preklinische targetvalidatie verbetert. De aanpak verbetert de translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot de preklinische stadia door de integriteit van de eilandjes te handhaven tijdens experimentele blootstelling en analyse.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via celtype-specifieke metingen in een intacte eilandjesarchitectuur.
- Operationele waarde: Vermindert materiaalverlies en verhoogt het aantal bruikbare coupes per eilandjespreparaat, wat de efficiëntie bij workflows met monsters in lage concentraties verbetert.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare coupes die geschikt zijn voor histologische en immunofluorescentie-screening van de effecten van verbindingen op de eilandjesfunctie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de schaalbaarheid van assays door 10+ coupes per eilandjesblok te produceren, waardoor parallelle read-outs van identiek biologisch materiaal mogelijk zijn.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de natuurlijke interacties tussen eilandjes van Langerhans-cellen en tussen cellen en het substraat, wat functionele beoordelingen die relevant zijn voor ziekten in preklinische modellen ondersteunt.
- Operationele waarde: Faciliteert cross-sectionele consistentie voor longitudinale analyse van de respons van eilandjes van Langerhans op experimentele condities.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door gedetailleerde fenotypische analyse na blootstelling aan verbindingen mogelijk te maken, het identificeren van lead-verbindingen te ondersteunen via read-outs waarbij de architectuur behouden blijft, en beslissingen over preklinische verdere ontwikkeling te onderbouwen via kwantitatieve, multiparametrische eilandprofielanalyse.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door de architectuur van de eilandjes te behouden tijdens experimentele manipulatie en analyse.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door een gelijkmatige distributie van eilandjes en een hoge sectie-opbrengst per monster.
- Analytica: Maakt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk via seriële sectie voor gecorreleerde structurele en moleculaire readouts.
- Translationeel onderzoek: Bevordert preconische continuïteit door de beoordeling van intacte responsen van eilandjes mogelijk te maken die het gedrag van inheems weefsel weerspiegelen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare inbeddingsmethode die toepasbaar is op andere fragiele weefselmodellen of modellen met een lage opbrengst buiten pancreaseilandjes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit te verminderen via celtype-specifieke data waarbij de architectuur behouden blijft.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van het snijden van eilandjes over onderzoeksteams en laboratoria heen.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door multi-parametrische uitkomstbeoordeling mogelijk te maken vanuit beperkte, hoogwaardige biologische monsters.
- Portfolio-impact: Verbetert de risico-gecorrigeerde prioritering door betrouwbare, kwantificeerbare eilandjes-gebaseerde biomarkers voor functie en toxiciteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologische inbeddings- en snijtechnieken voor een optimale behandeling van de gel en de vorming van schijfjes.
- Is afhankelijk van toegang tot standaard histologische apparatuur, waaronder hitteblokken, centrifuges, microtomen en kleuringsplatforms.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de gelbereiding en de afmetingen van de schijfjes om consistentie bij het snijden te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op andere brosse weefsels met variërende grootte, dichtheid of fragiliteit.
- Omvat praktische beperkingen met betrekking tot het optimaliseren van de fixatie-intensiteit en de dikte van de schijfjes om artefacten te voorkomen en de kwaliteit van de coupes te waarborgen.
