Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van het microbioom van de bodem, rhizosfeer en wortelendosfeer, zoals hoe de diversiteit van microbiële gemeenschappen verandert als reactie op monstersoort, behandeling en plantgenotype. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze goed geschikt is voor veldexperimenten die grote monsteraantallen en herhaling vereisen. Het demonstreren van de procedure zal door mijzelf en Stephanie Futrell worden gedaan, een afstudeerstudent en onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium.

Om het protocol te beginnen, label een wasbak en emmer met een plakje papier met details van de plantmonsters. Draag de gelabelde emmer naar het perceel en laat de wasbak op het vastgestelde werkstation in het veld. Kies willekeurig twee planten per perceel uit verschillende gebieden binnen het perceel.

Priem vervolgens de grond met een schop tot een diepte van 30 centimeter om eventuele laterale wortels door te snijden die de plant in de grond houden. Graaf de plantenwortels uit door de schop te gebruiken en plaats de kluit in de gelabelde emmer. Breng de emmer terug naar het werkstation in het veld.

Schud de wortels en gebruik een schop of handmatige trekker om aarde van de wortels te verwijderen. Draag handschoenen en plaats de wortels bij de verwerkingsstation. Na het schudden van de wortels, meng de grond in de wasbak en breek eventuele grondkluiten met een handmatige trekker.

Plaats een monster van grond dat vrij is van puin in een gelabelde ritssluitingsopslagzak van 17,7 bij 19,5 centimeter en plaats het op ijs. Steriliseer snoeischaar in 70%ethanol. Gebruik de steriele schaar om een verscheidenheid aan wortels te verwijderen, ongeveer vier tot zes wortels per plant en elke wortel ongeveer negen tot 12 centimeter lang.

Plaats de verwijderde wortels in een gelabelde 50-milliliterbuis met 35 milliliter geautoclaveerde fosfaatbuffer met een oppervlakteactieve stof zoals Silwet L-77. Schud de buizen gedurende twee minuten om de rhizosfeer van het oppervlak van de wortels te verwijderen. Verbeter het schudden met een generator en vortexer.

Verwijder met in 70%ethanol gesteriliseerde pincetten de wortels uit de buis, dep ze kort op papieren handdoeken en plaats ze in een nieuwe, gelabelde, 50-milliliterbuis. Plaats zowel de buis met de rhizosfeer als degene met de wortels op ijs. Voeg ongeveer 35 milliliter 50%bleach plus 0,01%Tween 20 toe aan de 50-milliliterbuizen met wortels die in het veld zijn verzameld.

Vortex of schud de buizen gedurende 30 tot 60 seconden. Giet de bleekvloeistof weg, voeg 35 milliliter 70%ethanol toe en vortex of schud de wortels nog eens 30 tot 60 seconden. Giet na het schudden de 70%ethanol weg en voeg 35 milliliter steriel, ultrapuur water toe en vortex of schud het monster gedurende één minuut.

Herhaal de water-spoel stap nog twee keer zodat de wortel in totaal drie spoelingen met steriel, ultrapuur water ontvangt. Dep de wortels op droge, schone papieren handdoeken en gebruik voor elk monster een schone papieren handdoek. Gebruik steriele pincetten en snoeischaar om de wortels in stukken van ongeveer vijf millimeter te snijden en plaats de gesneden wortels in een schone, gelabelde, 15-milliliter conische buis en bewaar de monsters bij minus 80 graden Celsius tot verdere verwerking.

Schud de 50-milliliterbuizen met rhizosfeermonsters uit het veld gedurende 20 tot 30 seconden om het hele monster opnieuw te suspenderen. Gebruik een steriele, 100-micron mesh celstrainer om het opnieuw gesuspendeerde monster in een nieuwe 50-milliliterbuis te filteren. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 3.000 keer g.

Giet onmiddellijk de supernatant af en gooi weg. Plaats de rhizosfeerpellets in de 50-milliliterbuizen op ijs. Voeg vervolgens 1,5 milliliter steriele fosfaatbuffer zonder oppervlakteactieve stof toe aan de rhizosfeerpellets en vortex ze om het monster opnieuw te suspenderen.

Pipetter de opgeschorte vloeistof in een schone, gelabelde, twee-milliliter microfugebuis. Draai de buizen bij 15.871 keer g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Giet onmiddellijk de supernatant af en laat de buizen uitlekken op schone papieren handdoeken.

Bewaar de pellets bij minus 20 graden Celsius tot verdere verwerking. Gebruik een steriele metalen spatel om een schone, gelabelde, twee-milliliterbuis te vullen met ongeveer drie gram grond voor DNA-extractie en vermijd kleine wortelstukken en puin. Spoel de metalen spatel tussen elk monster in 70%ethanol.

Bewaar dit grondmonster bij minus 20 graden Celsius. In een schone wasbak, leeg de zak grond in gestapelde zeefjes met de grotere zeef bovenop de kleinere zeef en zeef de grond handmatig door beide zeefjes. Gebruik een borstel om de zeefjes voorzichtig te reinigen tussen monsters.

Leg 100 tot 125 gram gezeefde grond opzij in een ritssluitingszak van 17,7 bij 19,5 centimeter voor toekomstige fysisch-chemische en textuuranalyse van de grond. Plaats de zakjes grond bij vier graden Celsius voor kortetermijnopslag. Gief vervolgens vloeibare stikstof in een plastic beker met schone spatels en in een schone vijzel.

Plaats het bevroren weefsel in de vijzel en maal het met de stamper tot een fijn poeder. Voeg gedurende het malen voortdurend vloeibare stikstof toe om monsters bevroren te houden. Gebruik een spatel om het gemalen weefsel in een schone, gelabelde, twee-milliliterbuis over te brengen en bewaar het weefsel bij minus 80 graden Celsius.

Veeg het werkgebied af met 70%ethanol en 1%huishoudelijke bleekvloeistof. Haal de grondmonsters uit de opslag bij minus 20 graden Celsius en laat ze ontdooien in een ijsemmer. Verwijder de afdicht