Name: Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer gestandaardiseerde methoden voor het isoleren en analyseren van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels van overblijvende grassen. Deze protocollen ondersteunen veldexperimenten met hoge reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De ontwikkeling van dit manuscript wordt ondersteund door de National Science Foundation EPSCoR Center voor Root en Rhizobiome innovatie Award OIA-1557417. Het verzamelen van gegevens werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Nebraska-Lincoln, landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling en door een subsidie van de Hatch van USDA. Wij erkennen ook steun van de USDA-ARS en ondersteuning werd verstrekt door de landbouw en voedsel onderzoek initiatief concurrerende Grant nr. 2011-68005-30411 van de USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw te richten en te beheren van deze velden.

<ol><li>Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+back+to+the+roots%3A+the+microbial+ecology+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).</li>
<li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+the+unknown%3A+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere+and+roots+of+two+major+crop+systems+under+elevated+CO2+and+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15019(2017).</li>
<li>White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio+Temporal+influence+of+isoflavonoids+on+bacterial+diversity+in+the+soybean+Rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).</li>
<li>Edwards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+variation%2C+and+assembly+of+the+root-associated+microbiomes+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+%28Ericaceae%29+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li>
<li>Doty, S. L., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF03179967">Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow.</a> Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).</li>
<li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li>
<li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+endophytic%2C+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biolology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87(2014).</li>
<li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li>
<li>RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.rstudio.com/">http://www.rstudio.com/</a> (2015).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://affect-reason-utility.com/1301/4/shannon1948.pdf">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li>
<li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/163688a0">Measurement of diversity.</a> Nature. 163, 688(1949).</li>
<li>Chao, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4615964">Non-parametric estimation of the number of classes in a population.</a> Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).</li>
<li>Legendre, P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jpe/article/1/1/3/1130269">Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis.</a> Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).</li>
<li>Oksanen, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228975085_The_Vegan_Package">The vegan package.</a> Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).</li>
<li>Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22Ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).</li>
<li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ribosomal+Database+Project+%28RDP-II%29%3A+sequences+and+tools+for+high-throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).</li>
<li>Wagner, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genotype+and+age+shape+the+leaf+and+root+microbiomes+of+a+wild+perennial+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.</a> Nature Communications. 7, 12151(2016).</li>
<li>O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+community+analysis+by+large-scale+sequencing+of+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).</li>
<li>Taylor, D. L., et al. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1890/12-1693.1">A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning.</a> Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).</li>
<li>Lebeis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+modulates+colonization+of+the+root+microbiome+by+specific+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa.</a> Science. 349 (6250), 860-864 (2015).</li>
<li>Ofek-Lalzar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+and+host-associated+functional+signatures+of+the+root+surface+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome.</a> Nature Commununications. 5, 4950(2014).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Fitzpatrick, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+ecological+function+of+the+root+microbiome+across+angiosperm+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).</li>
<li>Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+effects+of+nitrogen+fertilization+on+soil+bacterial+communities+in+contrasting+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems.</a> Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).</li>
<li>Paungfoo-Lonhienne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+table%3A+Plants+consume+microbes+as+a+source+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients.</a> PLoS One. 5 (7), e11915(2010).</li>
<li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li>
<li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li>
<li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methoden die worden beschreven in dit manuscript moeten inschakelen wetenschappers om gemakkelijk het gebied van bodem en plant metagenomics. Door de jaren heen, hebben wij onze methodes verfijnd sinds het uitvoeren van het experiment beschreven in dit manuscript. Één verandering is dat we nu vooraf label buizen voor het uitgaan naar het veld te monster. Onze afwerkcentrale gebruikt een barcoding-systeem en een labelprinter. De labelprinter bespaart niet alleen tijd toen labeling buizen, maar ook maakt alles makkelijker bijhouden en monsters zonder de grillen van menselijke hand schrijven correct te herkennen. Een ander belangrijk punt is dat we proberen te verwerken van het materiaal na brengen het terug uit het veld zo spoedig mogelijk. Wij streven ernaar om te bevriezen van de bodem gebruikt voor DNA-analyse, steriliseren en bevriezen van de wortels, en filteren en blokkeren de rizosfeer binnen 12 tot 36 uur na zijn terugkeer uit het veld. De DNA-extractie-procedures zijn langdurig met veel stappen, met name voor de bodem en de rhizosfeer, dus we een robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) die minimaliseert de handen op tijd voor de protocollen van de extractie van DNA kochten, vermindert menselijke fout die kan worden ingevoerd, en verbetert de consistentie in de manier waarop verschillende batches van bodem, wortels of rhizosfeer worden verwerkt. Bij het werken met plantaardig materiaal is het belangrijk om te beslissen over het type root te worden bestudeerd of te nemen van een verscheidenheid van wortel types te krijgen van een "representatief". Behoud van wortels en bladeren in een bevroren toestand bij het uitvoeren van de DNA-extracties zoals is het belangrijk is ervoor te zorgen is er geen kruisbesmetting tussen de monsters bij het invullen van de 96-Wells DNA-extractie-platen. Een andere belangrijke factor die meespeelt is het aantal replicatieonderzoeken moet worden gebruikt wanneer het veld experimenten ontwerpen en gebruiken van een complete gerandomiseerde ontwerp waar mogelijk26. Als gevolg van de variabiliteit van de hoge veld het mogelijk moet zijn een groot aantal wordt gerepliceerd naar het detecteren van kleine verschillen. Tot slot, uit onze ervaring het is essentieel om ervoor te zorgen dat bodems zijn niet te nat. Wanneer het opgraven van de wortels. Als de bodems zijn verzadigd met water het is niet alleen rommelig om mee te werken, maar het is ook zeer moeilijk te bepalen van de rhizosfeer en te verwijderen van de bodem van de wortels.
Een wijziging die werd gemaakt al vroeg tijdens de ontwikkeling van deze methoden is in plaats van het schudden van de buizen met de hand om de rizosfeer die we opgewaardeerd tot vortexers aangedreven door een gas generator om het werk gemakkelijker in het veld en meer gestandaardiseerd in termen van de tijd en de wijze dat elke buis werd geschud. Een beperking van de amplicon rangschikking aanpak is dat de resolutie van de taxonomische van de resultaten vaak beperkt is en vele OTUs onbekende of enige bekende op de familie of een genus niveau zijn. Dit veld van onderzoek evolueert snel dus is het belangrijk op de hoogte van nieuwe en ontwikkelende benaderingen, met name voor data-analyse die de resolutie van de resultaten kan verbeteren.
Deze protocollen zijn alleen voor het studeren niet schimmels, bacteriën en archaea. Het gebruik van verschillende inleidingen voor versterking zal toestaan voor de studie van fungale gemeenschappen met behulp van de dezelfde DNA monsters27,-28. Deze methoden vereisen niet de aankoop van grote hoeveelheden materiaal omdat de methoden kunnen worden vereenvoudigd. De methoden die we beschrijven hier zijn voornamelijk voor het bepalen van de "wie is er", maar het veld snel ontwikkelt zich tot een belangrijke vragen over de functie, die kan worden aangepakt met behulp van shotgun sequencing methoden, isolatie en testen van de functionaliteit van microben, of de hele microbiële genoom sequencing.
De representatieve resultaten benadrukken de verschillen in microbiële gemeenschappen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de beschreven methoden. Met behulp van een bèta-diversiteit benadering de data analyse22, werden samenstelling verschillen tussen monster types getoond. Deze verschil zijn in de meeste andere studies waar endosphere, rhizosfeer en bodem bevatten unieke microbiële gemeenschappen3duidelijk waargenomen. Het indexcijfer van de diversiteit van de Shannon was berekend de overvloed en de gelijkmatigheid van de microbiële soorten waarvan de aanwezigheid binnen iedere plantensoorten in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem te bepalen. Zoals u in deze studie en vele anderen, is Alfa diversiteit het hoogst in de bodem, licht dalend in de rizosfeer en dan daalt aanzienlijk in de endosphere3,5,29. Deze resultaten wijzen erop dat de hier beschreven methoden geschikt zijn voor het identificeren van compositorische wijzigingen in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem.
De dominantie van de Proteobacteria is een gemeenschappelijke vaststelling in studies over endosphere en bodem30,31,32. Endosphere heeft over het algemeen een lagere diversiteit van microbiële soorten met een hogere relatieve abundantie van de Proteobacteria. Hieruit blijkt opnieuw dat de resultaten hier representatief voor andere bevindingen in de literatuur zijn. De effecten van de behandeling in deze studie waren niet significant verschillend en twee grote redenen daarvoor kunnen worden dat de verschillen die zijn opgelegd door de behandelingen niet groot genoeg is waren voor het genereren van voldoende variatie om op te sporen en dat deze bemonstering werd gedaan aan het einde van de groeiseizoen, wanneer de velden kunnen hebben voldoende tijd gehad om te vestigen beneden de stikstof op vergelijkbare niveaus, die is wat werd gemeten aan het eind van het seizoen. In een andere studie met behulp van soortgelijke bevruchting tarieven over een langere periode van tijd, werden slechts relatief kleine veranderingen in de samenstelling van de microbiome gemeten33. Andere studies hebben aangetoond wijzigingen in zowel schimmel en bacteriële gemeenschappen als gevolg van stikstof kunstmest34,35.
Plantensoorten zijn gekend om te spelen een rol bij het bepalen van hun microbiomes3,32,36 en zelfs kleine verschillen in de variant van de microbiële Gemeenschap zijn aangetoond tussen verschillende plant genotypen binnen een enkele soorten37. In deze studie werd een significant verschil in samenstelling van de microbiële Gemeenschap gevonden tussen plantensoorten. In alle soorten van de steekproef bleek dat switchgrass had de meest verschillende microbiële samenstelling, maar waren de verschillen tussen soorten alleen statistisch significant in de endosphere. Rhizosfeer Gemeenschap samenstelling kan beduidend indien meer replicatieonderzoeken beschikbaar voor analyse waren zijn geworden.
De gecombineerde veld, lab en analytische protocollen beschreven hier bieden een krachtige methode voor het bestuderen van de manier waarop de verschillende factoren invloed de samenstelling van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer, en de endosphere van wortels36. Er is een heleboel werk te doen op het gebied van het bestuderen van de microbiomes, met name in agrarische velden. Belangrijke vragen op over hoe de opbrengsten worden gewijzigd door de microbiome van de bodem moeten nog volledig worden opgehelderd. Zelfs de meest elementaire vragen over hoe vruchtwisseling invloed op de microbiome van de bodem, hoe timing verandert de microbiome, hoe abiotische stress verandert de microbiome, hoe bodemtype interageert met deze factoren te wijzigen van de microbiome, en of er universele microben in bepaalde gewassen of regio's van de VS zijn allemaal open vragen. Deze methoden zullen ook nuttig voor epidemiologisch onderzoek om de aanwezigheid en de persistentie van pathogene en gunstige bacteriën te identificeren. Een andere toekomstige horizon voor deze methoden zullen om te beginnen met de hier beschreven met plant- en microbe RNA- en metaboliet gegevens DNA-methoden te integreren. Extra verbetering en het testen van meer variabelen is belangrijk voor verdere optimalisatie van deze protocollen.

Microbiome onderzoek heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen en manipuleren van ecosysteem processen zoals nutriënten fietsen, organisch materiaal omzet, en de ontwikkeling of remming van de bodem ziekteverwekkers1,2. Dit onderzoeksgebied houdt ook groot potentieel voor het begrijpen van de effecten van bodem-microben op de productiviteit van natuurlijke plantaardige Gemeenschappen en agro-ecosystemen. Hoewel er veel studies die zijn gericht op de microbiome van de bodem in natuurlijke ecosystemen, hebben minder gericht op plant rhizosfeer en endosphere microben in agro-ecosystemen3. In Nebraska domineert landbouw het landschap in grote delen van de staat, de studies van deze bodems maken waar agrarisch belangrijke gewassen een cruciaal onderwerp voor onderzoek worden gekweekt. Het doel van deze paper methoden is om onderzoekers te voorzien van een standaardset van protocollen bij het beschrijven van de microben aanwezig zijn in de agro-ecosystemen, om te bepalen hoe de plantenwortels de microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer en endosphere, en uiteindelijk wijzigen begrijp de functies die deze microben in bodem sanitaire en fytosanitaire productiviteit spelen.
De methode die hier wordt gepresenteerd verschilt enigszins van de methoden die worden gebruikt door anderen4,,5 , in dat dit document is gericht op het leren welke microben zijn uitsluitend binnen de wortel en hoe ze verschillen van microben onmiddellijk buiten de root in de rhizosfeer. De volgorde van de amplicon gebruikt in deze studie identificeert de microbiële taxa gevonden in het DNA-monster en laat onderzoekers om te bepalen hoe de gemeenschappen afhankelijk van monster type of behandeling veranderen. Een van de belangrijkste verschillen tussen dit protocol en een zeer vergelijkbaar protocol dat wordt gebruikt door Lundberg et al. 6 is dat in plaats van ultrasoonapparaat, dit protocol oppervlakte sterilisatie met bleekmiddel en ethanol gebruikt om de rizosfeer van de wortels. Anderen hebben ook gebruik gemaakt van oppervlakte sterilisatie effectief7,8,9,10. Deze methoden zijn niet voordeliger dan andere methoden, maar iets anders. Deze methoden zijn bijzonder goed geschikt voor grote veld experimenten, want met genoeg mensen is het mogelijk voor het verwerken van meer dan 150 veld percelen per dag, waardoor maximaal ongeveer 450 monsters als gepartitioneerd in endosphere, rhizosfeer en bodem. Dit manuscript beschrijft in detail de gebruikte methoden voor proeven in het veld, het verwerken van het materiaal in het lab, uittreksel en de DNA-sequentie, en biedt een beknopt overzicht van de stappen om de resulterende rangschikken gegevens te analyseren.

```html
<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>Extractiekit voor bodem en wortelsfeer</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4</td><td>Extractiekit voor wortels</td></tr><tr><td>D-Handle graafschep, 101 cm L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Tiller, 40 cm L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>Ziploc Zakjes, 17,7 cm x 19,5 cm</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Koelbox</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wasbak</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof emmer</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen (werk en lab)</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>20 cm diameter Bodemzeef #8, 2360 μm maaswijdte</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>20 cm diameter Bodemzeef #4, 4750 μm maaswijdte</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td>Draagbare generator</td><td>Honda merk werkt goed</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Steriele celzeef 100 μm maaswijdte</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td><td>Oplosmiddel</td></tr><tr><td>Autoclaven</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Droogoven</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td></td></tr><tr><td>Bleekvloeistof</td><td>CLOROX - huishoudsterkte</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare Stikstof</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Droge Ijspellets</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>11 cm precisie fijne punt pincet</td><td>Fisher</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18 cm Rechte punt specimentang</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>13,5 cm Snoeischaar</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>2 mL buis</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>15 mL PP conische buis</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP conische buis</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuur water</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, Q-POD</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Voor DNA-kwantificering van verwijderde monsters</td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Voor DNA-kwantificering</td></tr><tr><td>96-Well Zwarte met Heldere Platte Bodem Platen</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>Genomische DNA uit Microbiële Mock Community B (Even Lage Concentratie) v5.1L, voor 16s rRNA Gen sequencing</td><td>BEI Resources</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevende 8-wels strips voor platen</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kralen, 3,2 mm dia</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Assay blok (DNA extractie plaat voor de Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit)</td><td>CoStar</td><td>3959</td><td></td></tr><tr><td>Antistatische PP weegtrechter, maat klein voor bodem/wortelsfeer</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>Antistatische PP weegtrechter, maat x-klein voor wortel/blad</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Vortex adapter voor 50 mL buizen</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>Morser (100 mL) en stamper</td><td>Elk</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metalen microlepel</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp antistatische microlepel</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>Bruin Papier zakje 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)</td><td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 Centrifuge voor 2 mL buis</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor 96-well plaat</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor voor 50 mL buizen</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA polymerase</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant en bodem microbiome studies zijn steeds belangrijker voor de micro-organismen van de rollen in landbouwproductiviteit spelen begrip. Het doel van dit manuscript moet detail geven over hoe snel genieten van de bodem, de rhizosfeer, en endosphere van gerepliceerde veldproeven en analyseren van wijzigingen voordoen bij de microbiële gemeenschappen als gevolg van monster type, behandeling en plant genotype. Het experiment gebruikt om aan te tonen deze methoden bestaat uit gerepliceerde veld percelen met twee, zuiver, warm-seizoen grassen (Panicum miliaceum en Andropogon Rus) en een lage-diversiteit gras mengsel (A. Rus, Sorghastrum Vogelmelk, en Bouteloua curtipendula). Kort, planten zijn opgegraven, een verscheidenheid van wortels zijn gesneden en geplaatst in fosfaatbuffer en geschud voor het verzamelen van de rizosfeer. Wortels worden gebracht naar het laboratorium op ijs en oppervlak gesteriliseerd met bleekmiddel en ethanol (EtOH). De rizosfeer is gefilterd en geconcentreerd door middel van centrifugeren. Afgegraven grond van rond de wortel bal is geplaatst in plastic zakken en gebracht naar het lab waar een kleine hoeveelheid bodem is genomen voor DNA extracties. DNA is gewonnen uit de wortels en bodem rhizosfeer en vervolgens versterkt met inleidingen voor de V4-regio van het 16S rRNA gen. Waarbij sequenced, dan geanalyseerd met open toegang bioinformatica tools. Deze methoden toestaan van onderzoekers om te testen hoe de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling varieert vanwege monster type, behandeling, en plant genotype. Met behulp van deze methoden samen met statistische modellen blijkt de representatieve resultaten er aanzienlijke verschillen in microbiële gemeenschappen van wortels, rhizosfeer en bodem. Methoden die hier gepresenteerd bieden een complete set van stappen voor het verzamelen van veldmonsters, isoleren, uitpakken, kwantificeren, versterken, en DNA-sequentie en analyseren van de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling in gerepliceerde veldproeven.

De representatieve resultaten gepresenteerd in dit manuscript komen uit een veld-site opgericht in 2012 op de Universiteit van Nebraska-Lincoln landbouw Research Division boerderij in de buurt van Mead, NE. voorafgaand aan het experiment, de site had beheerd als een rotatie van maïs-soja . De studieplaats bevond zich op drie verschillende soorten bodems, maar de gegevens werd geanalyseerd alsof alle wijzigingen in de bodemeigenschappen van de gemeten als gevolg van de behandelingen opgelegd.
De veld-site bevatte twee, puur, staat van switchgrass (P. miliaceum cv Liberty), evenals grote bluestem (A. Rus) en een mengsel van de lage-diversiteit gras met grote bluestem, indiangrass (S. Vogelmelk) en 'Butte' sideoats grama) B. curtipendula). De drie percelen van de warm-seizoen gras werden in een gerandomiseerde volledige blokontwerp dat driemaal is gerepliceerd. Genest in de drie verschillende gras percelen werden twee bevruchting behandelingen voor stikstof (N), die 56 (N1) en 112 (N2) kg N ha waren-1 van toegepaste ureum. Ten tijde van de bemonstering van de microbiome aan het einde van het groeiseizoen, de bodem opgenomen 8.0 ± 1.1 (gemiddelde ± SD) ppm nitraat in de percelen bevrucht met 112 kg N ha-1 en 6.8 ± 0,7 (mean + SD) ppm nitraat in de percelen bevrucht met 56 kg N ha-1. De percelen had al bevrucht wordt eenmaal per jaar. Het gras van de warm-seizoen percelen werden aangemerkt als de belangrijkste percelen (8000 m2) en N behandelingen waren de split percelen (4000 m2). Grote bluestem als een 50:50 mix van 'Bonanza' en 'Goudmijn' was uitgezaaid en Indiangrass als een 50:50 mix van 'Scout' en 'Warrior' was agarvoedingsbodem. De percelen werden geplant in 2012, en de eerste toepassing van de N opgetreden in het voorjaar van 2013.
De bodem en de wortel bemonstering vond plaats op 15 September 2014. De hieronder beschreven werk vond plaats op een veld dat is opgezet als een split-plot gerandomiseerde ontwerp met drie replicaat-organismen (Figuur 1). De diepte van de gemiddelde sequentiebepaling van alle de monsters voor de endosphere als volgt waren: 4871 ± 5711 (gemiddelde ± SD), rhizosfeer: 40726 ± 14684, bodem: 38184 ± 9043. Een van de grootste bronnen van variatie in deze experimenten, met behulp van de methoden die worden beschreven, is het verschil in microbiële gemeenschappen gevonden tussen monster typen (Figuur 2). In dit representatieve gegevensverzameling, de rhizosfeer en bodem lijken meer qua samenstelling bij elkaar liggen dan de endosphere (figuur 2A). Er waren echter ook veelbetekenend (p = 0,001) verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap rhizosfeer en bodem (figuur 2B). De totale variatie in deze experimenten geanalyseerd door monster type verantwoord was 26%.
Alfa diversiteit analyse toonde aan dat de microbiële gemeenschappen in de endosphere lager in monster diversiteit ten opzichte van de bodem en de rizosfeer (Figuur 3 waren). De enige belangrijke verschillen in verscheidenheid tussen de soorten gras in elk compartiment waren tussen de endosphere monsters van grote bluestem en switchgrass, met switchgrass hebben aanzienlijk hoger microbiële diversiteit (Figuur 3). De relatieve overvloed analyse (Figuur 4) benadrukt de dominantie van de Proteobacteria gevolgd door Straalzwammen in allerlei monster. Bodem en rhizosfeer ook beheerst door Acidobacteria en Chloroflexi de endosphere had een grotere relatieve overvloed van Bacteriodetes.
In dit experiment, planten zijn geteeld met twee verschillende hoeveelheden N-meststof en dus we de gegevens om te bepalen of er effecten van de behandeling waren geanalyseerd. Effecten van de behandeling goed voor 12% van de totale variatie maar waren niet significant verschillend hoewel in de wijding van de twee behandelingen verschillende (Figuur 5 kijken). Dit benadrukt het belang van statistische analyses voor deze datasets in plaats van visuele inspectie of kwalitatieve beslissingen.
Plant-beïnvloed verschillen in de microbiome van plantaardige weefsels en bodem werden gevisualiseerd met behulp van een gebonden methode van coördinatie. Statistische verschillen werden bepaald met behulp van een analyse van de PERMANOVA om te testen of specifieke variabelen, zoals soorten, in sterk afwijkt van de microbiële Gemeenschap samenstelling tussen de monsters resulteren. Wanneer alle monster typen waren samen geanalyseerd, werd een zeer significant verschil gevonden in microbiële Gemeenschap samenstelling als gevolg van plantensoorten (Figuur 6). In dit experiment was het bedrag van de variatie in rekening gebracht door plantensoorten 6,7%. Ten slotte was elk monster type afzonderlijk geanalyseerd om te bepalen welke van de soorten monster kan het effect van belangrijke plant soorten rijden. Alleen in de endosphere was er een zeer groot verschil (p = 0,001) tussen de microbiële Gemeenschap composities van de verschillende plantensoorten (Figuur 7). In de steekproef andersoortige was het soort effect niet significant wanneer afzonderlijk geanalyseerd. In de endosphere was het percentage variatie toe te schrijven aan soorten 27%, terwijl het lager in de rizosfeer (18%) en bodem (15%). Dit benadrukt verder het belang van elk weefseltype afzonderlijk analyseren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Afbeelding 1: voorbeeld van het experimentele veld ontwerp. Experimentele veld ontwerp ter illustratie van een gerandomiseerde volledige blokontwerp in drievoud van het veld site ligt bij de Universiteit van Nebraska-Lincoln oostelijk Nebraska Research and Extension Center in de buurt van Mead, NE. Zie het gedeelte ' resultaten ' voor de volledige site beschrijving. N1 is de lage (56 kg N ha-1 ureum) en N2 (112 kg N ha-1 ureum) is het hogere tarief van de stikstof die was toegepast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Figuur 2: Beta diversiteit analyse de microbiële samenstelling in de verschillende monster vormen, met inbegrip van endosphere, rhizosfeer en bodem van de overblijvende gras bemonstering in 2014 vergelijken. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in QIIME1.9.1 voor de productie van de Bray-Curtis volgens matrix. Analyse van de belangrijkste coördinaten (PCoA) op basis van de Bray-Curtis principegeloven matrix was gevisualiseerd in RStudio. PCoA1 en PCoA2 geven de afwijking van de eerste en tweede grootste verklaard door de analyse van de PCoA. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen monster typen, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de cijfers vertegenwoordigen de hele microbiële Gemeenschap voor elk monster. (A) Endosphere, rhizosfeer en bodem monster-typen zijn samen geanalyseerd. Alle 87 monsters werden verheven aan 486 sequenties per monster. (B) rhizosfeer en grond monsters werden geanalyseerd samen. Alle 59 monsters werden verheven met 8231 sequenties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Figuur 3: Alpha diversiteit analyse met behulp van Shannon index voor elke soort in de endosphere, de rhizosfeer en de bodem. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in de QIIME1.9.1. Rarefaction werd gedaan voor de endosphere, de rhizosfeer, en de bodemtypes monster respectievelijk met 486, 17154 en 8231 sequenties per monster. Vakken geven aan de 25e en 75ste percentiel (eerste en derde kwartielen). De horizontale lijn in het vak geeft de mediaan en de rode plus toont het gemiddelde. Snorharen weergeven het bereik van de gegevens, met uitzondering van uitschieters (die worden weergegeven als zwarte stippen) en dat viel meer dan 1,5-maal de interkwartielafstand (n = 6 voor elk monster behalve voor sideoats grama mix waar n = 5). De Shannon-index van alle vijf soorten in de endosphere waren lager dan zowel de bodem als de rhizosfeer. Niet-parametrische Wilcoxon rangschikking som test werd gebruikt om de betekenis tussen de soorten en alleen significante verschillen tussen soorten werden getoond op de top van de vakken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Figuur 4: relatieve overvloed op het niveau van de stam in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem. Monsters werden geanalyseerd om te vergelijken de overvloed van microbiële stammen onder verschillende steekproeven (n = 29 voor elk monster-type). De analyse werd uitgevoerd met behulp van een Python-script in QIIME1.9.1 uit de tabel OTU. De verschillende kleuren binnen het cirkeldiagram duiden de stammen. Het percentage geeft de relatieve overvloed van elke stam in elk monster-type. De informatie van de stam was van aantekeningen voorzien met behulp van de Ribosomal databaseproject classificatie (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Figuur 5: analyse met behulp van behandeling als beperkende factor tussen allerlei monster. Canonieke analyse van de belangrijkste coördinaten (CAP)-analyse werd uitgevoerd om te bepalen of er verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen behandelingen waren. Voor de behandeling van elke N, n = 42 voor N1 (56 kg N ha-1) en n = 45 voor N2 (112 kg N ha-1). De Bray-Curtis volgens matrix werd gegenereerd met behulp van een python-script in de QIIME1.9.1. CAP analyse op basis van de Bray-Curtis volgens matrix werd gedaan door het beperken van de behandeling als de factor RStudio. PERMANOVA analyse werd uitgevoerd om te bepalen of de behandeling verschillen significant waren, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Figuur 6: analyse met behulp van plantensoorten als beperkende factor tussen allerlei monster. Analyse werd uitgevoerd om te bepalen of er verschillen in de samenstelling van de microbiële Gemeenschap tussen plantensoorten in allerlei monster waren. Belangrijkste coördinaten wijding en CAP analyse allerhande monster (endosphere, rhizosfeer en bodem) werden gedaan met behulp van een Bray-Curtis volgens matrix. De Bray-Curtis volgens matrix werd gegenereerd met behulp van de Python-script in QIIME1.9.1. CAP analyse op basis van de Bray-Curtis volgens matrix werd gedaan door het beperken van de plantensoorten als de factor RStudio. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen plantensoorten, en de P-waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de cijfers vertegenwoordigt de gehele microbiële Gemeenschap voor dat monster. n = 18 voor elke soort in alle soorten, monster behalve n = 15 voor de sideoats grama mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Figuur 7: voorbeeld van de CAP analyse met behulp van soorten als beperkende factor voor elk monster type individueel. Belangrijkste coördinaat wijding en CAP analyse van elk monster type (endosphere, rhizosfeer en bodem) met behulp van Bray-Curtis volgens matrix. Elk type monster was verheven 486, 17154 en 8231 leest per monster respectievelijk in endosphere, de rhizosfeer en de bodem. Soorten werd gebruikt als de factor om te beperken de wijding. PERMANOVA statistische analyse werd uitgevoerd om te bepalen van de betekenis tussen plantensoorten in elk monster type, en de p -waarde wordt weergegeven in de rechterbovenhoek. Elk symbool in de figuur vertegenwoordigt de gehele microbiële Gemeenschap voor elk monster. Steekproefgrootte is n = 29 voor elk monster type, n = 6 voor elke plantensoorten in elk monster type met uitzondering van de sideoats grama mix (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van het microbioom van de bodem, rhizosfeer en wortelendosfeer, zoals hoe de diversiteit van microbiële gemeenschappen verandert als reactie op monstersoort, behandeling en plantgenotype. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze goed geschikt is voor veldexperimenten die grote monsteraantallen en herhaling vereisen. Het demonstreren van de procedure zal door mijzelf en Stephanie Futrell worden gedaan, een afstudeerstudent en onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium.Om het protocol te beginnen, label een wasbak en emmer met een plakje papier met details van de plantmonsters. Draag de gelabelde emmer naar het perceel en laat de wasbak op het vastgestelde werkstation in het veld. Kies willekeurig twee planten per perceel uit verschillende gebieden binnen het perceel.Priem vervolgens de grond met een schop tot een diepte van 30 centimeter om eventuele laterale wortels door te snijden die de plant in de grond houden. Graaf de plantenwortels uit door de schop te gebruiken en plaats de kluit in de gelabelde emmer. Breng de emmer terug naar het werkstation in het veld.Schud de wortels en gebruik een schop of handmatige trekker om aarde van de wortels te verwijderen. Draag handschoenen en plaats de wortels bij de verwerkingsstation. Na het schudden van de wortels, meng de grond in de wasbak en breek eventuele grondkluiten met een handmatige trekker.Plaats een monster van grond dat vrij is van puin in een gelabelde ritssluitingsopslagzak van 17,7 bij 19,5 centimeter en plaats het op ijs. Steriliseer snoeischaar in 70%ethanol. Gebruik de steriele schaar om een verscheidenheid aan wortels te verwijderen, ongeveer vier tot zes wortels per plant en elke wortel ongeveer negen tot 12 centimeter lang.Plaats de verwijderde wortels in een gelabelde 50-milliliterbuis met 35 milliliter geautoclaveerde fosfaatbuffer met een oppervlakteactieve stof zoals Silwet L-77. Schud de buizen gedurende twee minuten om de rhizosfeer van het oppervlak van de wortels te verwijderen. Verbeter het schudden met een generator en vortexer.Verwijder met in 70%ethanol gesteriliseerde pincetten de wortels uit de buis, dep ze kort op papieren handdoeken en plaats ze in een nieuwe, gelabelde, 50-milliliterbuis. Plaats zowel de buis met de rhizosfeer als degene met de wortels op ijs. Voeg ongeveer 35 milliliter 50%bleach plus 0,01%Tween 20 toe aan de 50-milliliterbuizen met wortels die in het veld zijn verzameld.Vortex of schud de buizen gedurende 30 tot 60 seconden. Giet de bleekvloeistof weg, voeg 35 milliliter 70%ethanol toe en vortex of schud de wortels nog eens 30 tot 60 seconden. Giet na het schudden de 70%ethanol weg en voeg 35 milliliter steriel, ultrapuur water toe en vortex of schud het monster gedurende één minuut.Herhaal de water-spoel stap nog twee keer zodat de wortel in totaal drie spoelingen met steriel, ultrapuur water ontvangt. Dep de wortels op droge, schone papieren handdoeken en gebruik voor elk monster een schone papieren handdoek. Gebruik steriele pincetten en snoeischaar om de wortels in stukken van ongeveer vijf millimeter te snijden en plaats de gesneden wortels in een schone, gelabelde, 15-milliliter conische buis en bewaar de monsters bij minus 80 graden Celsius tot verdere verwerking.Schud de 50-milliliterbuizen met rhizosfeermonsters uit het veld gedurende 20 tot 30 seconden om het hele monster opnieuw te suspenderen. Gebruik een steriele, 100-micron mesh celstrainer om het opnieuw gesuspendeerde monster in een nieuwe 50-milliliterbuis te filteren. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 3.000 keer g.Giet onmiddellijk de supernatant af en gooi weg. Plaats de rhizosfeerpellets in de 50-milliliterbuizen op ijs. Voeg vervolgens 1,5 milliliter steriele fosfaatbuffer zonder oppervlakteactieve stof toe aan de rhizosfeerpellets en vortex ze om het monster opnieuw te suspenderen.Pipetter de opgeschorte vloeistof in een schone, gelabelde, twee-milliliter microfugebuis. Draai de buizen bij 15.871 keer g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Giet onmiddellijk de supernatant af en laat de buizen uitlekken op schone papieren handdoeken.Bewaar de pellets bij minus 20 graden Celsius tot verdere verwerking. Gebruik een steriele metalen spatel om een schone, gelabelde, twee-milliliterbuis te vullen met ongeveer drie gram grond voor DNA-extractie en vermijd kleine wortelstukken en puin. Spoel de metalen spatel tussen elk monster in 70%ethanol.Bewaar dit grondmonster bij minus 20 graden Celsius. In een schone wasbak, leeg de zak grond in gestapelde zeefjes met de grotere zeef bovenop de kleinere zeef en zeef de grond handmatig door beide zeefjes. Gebruik een borstel om de zeefjes voorzichtig te reinigen tussen monsters.Leg 100 tot 125 gram gezeefde grond opzij in een ritssluitingszak van 17,7 bij 19,5 centimeter voor toekomstige fysisch-chemische en textuuranalyse van de grond. Plaats de zakjes grond bij vier graden Celsius voor kortetermijnopslag. Gief vervolgens vloeibare stikstof in een plastic beker met schone spatels en in een schone vijzel.Plaats het bevroren weefsel in de vijzel en maal het met de stamper tot een fijn poeder. Voeg gedurende het malen voortdurend vloeibare stikstof toe om monsters bevroren te houden. Gebruik een spatel om het gemalen weefsel in een schone, gelabelde, twee-milliliterbuis over te brengen en bewaar het weefsel bij minus 80 graden Celsius.Veeg het werkgebied af met 70%ethanol en 1%huishoudelijke bleekvloeistof. Haal de grondmonsters uit de opslag bij minus 20 graden Celsius en laat ze ontdooien in een ijsemmer. Verwijder de afdicht

isolation-analysis-microbial-communities-soil-rhizosphere-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We methode om te evalueren hoe predatie risico kan de chemische kwaliteit van herbivoor prooi te veranderen door het induceren van veranderingen in het dieet op de eisen van verhoogde stress te voldoen, en hoe de ontbinding van karkassen van deze stress herbivoren vertraagt ​​latere fabriek strooiselafbraak door de bodem microben.

Linking predatierisico, Herbivore fysiologische stress-en Microbiële afbraak van Plant Litter

Inzicht in de rol van milieu heterogeniteit in soorten coëxistentie is meestal gericht op het vormen van heterogeniteit die extrinsieke aan de samenstelling van de gemeenschap soorten zijn. Wij bieden nieuwe gedetailleerde methoden voor het creëren bodemheterogeniteit behandelingen met behulp van bodems onder plant-bodem feedback conditioning, of heterogeniteit inherent aan de gemeenschap samenstelling.

Experimenteel protocol voor het manipuleren van Plant-geïnduceerde bodemheterogeniteit

Het artikel beschrijft een methode die de doorvoer vergroot, terwijl de inspanningen en nauwkeurigheid voor de extractie van lipiden uit de celmembranen van micro-organismen worden gecompenseerd voor gebruik bij het karakteriseren van beide totale lipiden en de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de microbiële structuur van de bodem te bepalen in studies met veel monsters.

Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Hier beschrijven we een hydroponische plantengroei test om de aanwezigheid van soorten te kwantificeren en de ruimtelijke verdeling van bacteriën te visualiseren tijdens de initiële kolonisatie van planten wortels en na hun overdracht in verschillende groei omgevingen.

Monitoring van bacteriële kolonisatie en onderhoud op Arabidopsis thaliana wortels in een drijvend Hydroponisch systeem

We beschrijven een protocol om intacte wortels en de omliggende rhizosfeergrond uit wetlandomgevingen te bemonsteren, te behouden en te doorsnijden met rijst(Oryza sativa L.) als modelsoort. Eenmaal bewaard, kan het monster worden geanalyseerd met behulp van elementaire beeldvormingstechnieken, zoals synchrotron x-ray fluorescentie (XRF) chemische speciatie beeldvorming.

Een methode om wetlandwortels en rhizosfeer te behouden voor elementaire beeldvorming

Producten op basis van glyfosaat (GBP) zijn wereldwijd de meest voorkomende breedspectrumherbiciden. In dit artikel introduceren we algemene richtlijnen om het effect van GBP op microbiomen te kwantificeren, van veldexperimenten tot bioinformatica-analyses.

Kwantificering van de potentiële impact van producten op basis van glyfosaat op microbiomen

Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).

Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

Een snelle en gestandaardiseerde procedure voor het opzetten van synergetische multispecies biofilmgemeenschappen uit verschillende rhizosfeerbodems wordt hier gepresenteerd. Het is een uniek protocol dat is ontworpen om de complexe bodemmicrobiota van de rhizosfeer te onderzoeken en te simuleren.

Een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer

Hier presenteren we een studie die is opgezet in de iDiv Ecotron, terrestrische mesokosmoskamers met gecontroleerde omgevingscondities boven en onder de grond, om de onafhankelijke en interactieve effecten van plantgeschiedenis en bodemgeschiedenis op het functioneren van ecosystemen van graslandgemeenschappen langs een plantendiversiteitsgradiënt te bestuderen.

JenaTron - Een experimentele benadering om de effecten van plantgeschiedenis en bodemgeschiedenis op het functioneren van graslandecosystemen te bestuderen

Leer gestandaardiseerde methoden voor het isoleren en analyseren van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels van overblijvende grassen. Deze protocollen ondersteunen veldexperimenten met hoge reproduceerbaarheid.

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Meer video's verkennen