Name: Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer het meten van nasaal potentiaalverschil bij muizen om iontransport te kwantificeren. Deze methode evalueert CFTR-functie en nieuwe cystic fibrosis-therapieën betrouwbaar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Prof. J. Lebacq voor kritisch bewerken het manuscript. CFTR-tm1Eur (homozygoot F508del-CFTR (FVB/129) muizen werden ontwikkeld door het Erasmus MC, Rotterdam, Nederland, met de steun van de Europese Economische Gemeenschap Europese Coordination Action voor onderzoek naar Cystic Fibrosis EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

De studies en de procedures werden goedgekeurd door het ethisch comité voor dierlijke onderzoek van de UCL (2017/UCL/MD/015) en in overeenstemming met de verordeningen van de Europese Gemeenschap voor dierlijk gebruik in onderzoek (CEE n ° 86/609/EEG). De onderzoekers zijn gekwalificeerd voor de dierproeven na de richtlijn 2010/63/EU van het EuropeesParlement en de Raad van 22 September 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.
1. vooraf testen overstromingsbeoordeling en -beheer
<ol><li>De dubbele lumen nasale katheter voor te bereiden. Opmerking: Een nasale katheter is gemaakt als een capillair dubbele lumen, één lumen wordt gebruikt voor de continue perfusie van oplossingen, en de andere als een meetpunt kanaal.<ol>
<li>Opwarmen van het centrale deel van een stuk, ongeveer 20 cm lang, van polyethyleen buis (2.0 mm binnendiameter; 3,0 mm buitendiameter; Figuur 1 een) in de vlam van een gasbrander totdat het zacht genoeg voor het trekken van (10-15 s).</li>
		<li>Trek de twee uiteinden apart te verkrijgen van een zeer dun capillair van passende lengte (~ 15 cm) en buitendiameter (~0.1 mm) voor de neus sonde (Figuur 1b).</li>
		<li>Reinigen en ontvetten van twee dergelijke haarvaten met pure ethanol, treden ze met tape (Figuur 1c) en lijm ze samen met behulp van Cyanoacrylaat lijm.</li>
		<li>Knippen weg de overtollige lengte van de sondes met een scheermesje of een scalpel te verkrijgen van een optimale lengte van de katheter dubbele lumen van ongeveer 8 cm (Figuur 1d).</li>
		<li>Injecteren van water door beide lumen om te verifiëren dat ze doorlaatbaar zijn.</li>
		<li>Toepassing een merk op een afstand van 5 mm van het uiteinde. Opmerking: De sonde wordt ingebracht tot het mark in het neusgat, zodat alle metingen worden verricht op hetzelfde terrein binnen de neusholte.</li>
		<li>De dubbele lumen katheter worden opgeslagen in een droge doos. Opmerking: Het kan worden gebruikt 6 - 10 keer als op de juiste wijze onmiddellijk na de test worden gereinigd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De crème mix voor te bereiden.<ol>
<li>Meng voorzichtig elektrolyt crème en verzadigde 3 M KCl oplossing in een 1:1 verhouding (volume/volume), het vermijden van de vorming van kleine luchtbelletjes. Opmerking: De crème mix gebruikt de elektrode om bruggen te bouwen voor het meten en de verwijzing Ag/AgCl elektrodes, zoals geïllustreerd in Figuur 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> Figuur 1 : Sondes met elektroden en bruggen. De figuur illustreert de polyethyleen buis voor (a) en na verwarming en trekken (b), de tape verbinden de twee capillaire delen (c) van de dubbele lumen-katheter (d), de silicone buis connectoren (e) en de elektroden (f). Voor kristalhelder beeld, hebben de connectoren niet zijn gevuld met crème mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Label oplossing</td>
			<td>Beschrijving van de oplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Basale gebufferde zoutoplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>Chloride-vrije gebufferde zoutoplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M amiloride stockoplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>10-3 M forskolin stockoplossing</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Stockoplossing voor de nasale PD test in muizen.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Zout</td>
			<td>mM</td>
			<td>Moleculair gewicht</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumchloride (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calciumchloride-dihydraat (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2,25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride-hexahydraat (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203,3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dikaliumhexafluorozirkonaat fosfaat (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174,2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monokalium fosfaat (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Samenstelling van basale gebufferde zoutoplossing (stock oplossing A).
<ol start="3"><li>Het bereiden van de oplossingen.<ol>
<li>Voorbereiden van de vier stamoplossingen vereist voor de experimentele protocol (tabel 1).<ol>
<li>Bereid de basale gebufferde oplossing (stockoplossing A; Tabel 2) en de chloride-vrije gebufferde oplossing (stockoplossing B; Tabel 3) door het mengen van de zouten in zuiver water op kamertemperatuur. Breng pH aan 7.4 (bereik 7.0-7,6) met behulp van 1 N NaOH pH, 1 N HCl op de lagere pH verhogen. Selectievakje osmolariteit van de oplossing (275 mOsm/L).</li>
			<li>Opslag in gelabelde glazen flessen bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden of ingevroren in plastic flessen voor maximaal 6 maanden.</li>
			<li>Bereid de 10-2 M amiloride oplossing (stockoplossing C) door toevoeging van 26,6 mg amiloride hydrochloride aan 10 mL zuiver water. Verwarm het mengsel gedurende 5 tot 10 minuten bij 70 ° C. Amiloride is gevoelig voor licht, houd oplossing C in een donkere container. Etikettering van de container en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden.</li>
			<li>Bereid de 10-3 M forskolin oplossing (stockoplossing D) door toevoeging van 10 mg van forskolin 24.36 ml zuiver water. Label aliquots van 0,1 mL van de stockoplossing van forskolin en bewaren bij-20 ° C voor maximaal 6 maanden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van verse oplossingen A1, B1 en B2 (tabel 4).<ol>
<li>Bereiden van verse oplossing A1 (basale gebufferde zoutoplossing plus 10-4 M amiloride) door het verkrijgen van 10 mL van de basale zoutoplossing (stock oplossing A) en de toevoeging van 0,1 mL 10-2 M amiloride oplossing (stockoplossing C). Label van de container en gebruik binnen 24 uren van voorbereiding.</li>
		<li>Bereiden van verse oplossing B1 (chloride gebufferd oplossing plus 10-4 M amiloride) door het verkrijgen van 10 mL van de chloride-vrije gebufferde zoutoplossing (stockoplossing B) en de toevoeging van 0,1 mL 10-2 M amiloride oplossing (stockoplossing C). Label van de container en gebruik binnen 24 uur na de bereiding.</li>
		<li>Bereiden van verse oplossing B2 (chloride-vrije gebufferde zoutoplossing plus 10-4 M amiloride en 10-5 M forskolin) door het verkrijgen van 10 mL van de chloride-vrije gebufferde zoutoplossing (stockoplossing B) en de toevoeging van 0,1 mL 10-2 M amiloride (stockoplossing C) en 0,1 mL van 10-3 M forskolin oplossing (stockoplossing D). Label van de container en gebruik binnen twee uur na de bereiding.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Zout</td>
			<td>mM</td>
			<td>Moleculair gewicht</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium-gluconaat (mononatriumzout)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calcium-gluconaat (watervrij poeder)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumsulfaat-heptahydraat (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dikaliumhexafluorozirkonaat fosfaat (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174,2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monokalium fosfaat (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Samenstelling van de chloride-vrije gebufferde oplossing (stockoplossing B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> Figuur 2 : Positie van de muis tijdens perfusie van de nasale mucosa. De figuur illustreert de verwarming pad (a) de voltmeter (b), de referentie-elektrode ingevoegd in de subcutane ruimte in een hind-limb (c), de proximale (d) en de distale (e) verkooppunten van de peristaltische pomp, het kussen (f), en het bed sheet (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
2. de beoordeling en het beheer tijdens de proef
<ol><li>Voorbereiden van de experimentele opstelling.<ol>
<li>Om te voorkomen hypothermie tijdens en na de test, gebruik twee verwarmingskussens gehandhaafd op fysiologische temperaturen, één voor de meet setup (18,8 x 37,5 cm; Figuur 2 een), en de ander (15,5 x 15,5 cm) voor het vak waarin het dier voor herstel aan het eind van de test zal worden geplaatst.</li>
		<li>Schakel de computer geladen met de software voor het vastleggen van gegevens verbonden met de data geheugen hoge ingangsimpedantie (> 1012Ω) en een hoge resolutie (0,1 mV) voltmeter (Figuur 2b).</li>
		<li>De elektroden aansluit op de voltmeter. Verbinden met de positieve elektrode van de meet de nasale katheter en de negatieve referentie-elektrode aan de katheter die is ingevoegd in de subcutane ruimte in een hind-limb, zoals weergegeven in Figuur 2c.</li>
		<li>Dompel de toppen van de elektroden samen in de room mix. Controleer de eerste elektrode offsetwaarde. De elektroden afwijzen als de waarde groter dan (±) 2 mV is (idealiter 0 mV).</li>
		<li>Zet de peristaltische pomp en de pomp buis invoegen naar de gewenste positie, zoals geïllustreerd in Figuur 2.</li>
		<li>Sluit de proximale uitlaat van de pomp buis aan de flacon met de geselecteerde oplossing voor nasale perfusie (Figuur 2d). De distale uitlaat van de pomp buis verbinden met de perfusie lumen van de nasale katheter (Figuur 2e).</li>
		<li>Vul één lumen van de nasale katheter met elektrolyt crème mix door middel van een 10 µL pipette uiteinde. Passen de katheter aan de silicone buis connector (Figuur 1e), vul de connector met crème mix en de positieve elektrode invoegen in de connector (Figuur 1f). Controleer de elektrode brug offset meetwaarde. De bruggen te weigeren als de waarde groter dan (±) 2 mV is (idealiter 0 mV).</li>
		<li>Vul de tweede lumen van de nasale katheter met de verse oplossing A1. Dompel het puntje van de neus katheter in de flacon met oplossing A. Reverse, de richting van de peristaltische pomp te vullen een lengte van de nasale katheter overeenkomt met 10 s van perfusie. Opmerking: Dit maakt het mogelijk opnemen van basale PD waarden voor 10 s voordat u het toepast amiloride. Dompel het puntje van de neus katheter in de room mix binnen de connector van de referentie-elektrode (Figuur 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Beginnen met behandeling van de muis.<ol>
<li>Record van het gewicht van de muis voor het berekenen van de exacte dosis van verdoving ingespoten brandstof door het intraperitoneaal (ip) route17.</li>
		<li>Met behulp van een naald van 26G (0,45 x 10 mm), premedication intraperitoneally ter bevordering van de inductie van de anesthesie injecteren: een vaste dosis van 50 µL van 5 mg/mL midazolam. 5 min wachten.</li>
		<li>Voorbereiden van de verdoving mix (fentanyl, medetomidine, droperidol op eindconcentraties van 0.05, 0,40 en 20 mg/kg lichaamsgewicht respectievelijk en clonidine bij de vaste dosis van 0.375 µg) waardoor optimale en stabiele diepte van anesthesie (fase III, vliegtuig 2)17 . Injecteer het volume van verdoving mix intraperitoneally, en vervolgens het injecteren van het volume van clonidine. Opmerking: Na 15 min, de muis moet in slaap en de narcose voor ten minste 30 minuten kan duren.</li>
		<li>Vouw een vel van weefsel te maken van een 3 cm breed 'kussen' (Figuur 2f) dat betrekking op het bovenste gedeelte van de verwarming pad (Figuur 2een) als een ondersteuning voor de muis hoofd hebben zal absorberen.</li>
		<li>Dekking van de verwarming pad met een blad van het absorberen van weefsel ('bed vel'; Figuur 2 g). de muis lag op haar rug op de verwarming pad. Tape uit de ledematen en de staart (Figuur 2).</li>
		<li>Invoegen van de verwijzing intraveneuze katheter (Figuur 1g) in de subcutane ruimte van een hind-limb. Verwijder de naald en passen de silicone buis connector (Figuur 1e, 2 c).</li>
		<li>Vul de katheter en de connector met room mix en invoegen van de negatieve elektrode in de connector (Figuur 1f).</li>
		<li>De katheter en de elektrode vast met tape als nodig is om te voorkomen dat eventuele verplaatsing. Na de plaatsing van de referentie-elektrode en bruggen, controleert u of de elektrode brug offset meetwaarde weer door dompelen het puntje van de neus katheter in de mix van de elektrode crème binnen de connector van de IV-katheter. Record de stabiele offset eindwaarde (ideaal voor minder dan (±) 2 mV).</li>
		<li>Herstellen van de muis oren met de "zachte" tape op de verwarming pad in een vrije ruimte tussen de twee stukken van het absorberen van weefsel ('kussen' (Figuur 2f) en 'bed vel'; (Figuur 2g)). De snorharen (de stijve haren groeien in de buurt van de neusgaten) vast te stellen zonder het aanraken van de ogen.</li>
		<li>Te absorberen vloeistof uit de mondholte, de tong opzij (Figuur 3een) verplaatsen en invoegen van een puntige wick filtreerpapier (de ' pijp'; Figuur 3 b) ongeveer 1 cm in de mond. Te absorberen uit de perfused neusgat vloeistof lopend, plaatst u een tweede bagagestuk filtreerpapier (de ' zakdoek'; Figuur 3 c) gehouden op het puntje van de neus.</li>
		<li>Controleer de waarde van een positieve controle van de epitheliale potentieel door het plaatsen van het puntje van de neus katheter in contact met de binnenkant van de mond. Opmerking: De lezing moet stabiel en bereik tussen -10 mV en -20 mV.</li>
		<li>Houd het met een fijne Tang en onder goede directe verlichting en tactvol introduceren de nasale katheter in één neusgat tot 4 - 6 mm van de neus tip. Opmerking: De nasale PD-katheter bevindt zich in de middelste neusschelp vanaf de positie die de maximale stabiele basislijn PD waarde17,20 geeft.</li>
		<li>5 min na het inspuiten van de verdoving drugs, kantelen zachtjes de verwarming pad door ongeveer 30° met de dierlijke hoofd naar beneden. De maximale waarde voor basale PD controleren.</li>
		<li>Wanneer het is stabiel gedurende een periode van ongeveer 30 s, start zoogdierlevercellen nasale mucosa, met een constante snelheid van 10 µL / min, met de 4 gebufferde oplossingen (A, A1, B1, B2) achter elkaar. De eerste oplossing (stap 1.3.1.1) voor 10 perfuse s en elke volgende oplossing (stap 1.4) gedurende 5 minuten of totdat een stabiele waarde is bereikt. Stop zoogdierlevercellen forskolin (B2) zodra de voorbijgaande forskolin reactie naar beneden.</li>
		<li>Selecteer een 1 s-interval voor gegevensregistratie. Start de opname van de gegevens op het moment van het starten van de perfusie. Gegevens weergeven als een functie van de tijd op het computerscherm.</li>
		<li>Stop registratiepercentage aan het einde van de perfusie met oplossing B2. Gegevens opslaan als een spreadsheet-bestand.</li>
		<li>Correcte gegevens door de definitieve offset waarde af te trekken.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> Figuur 3 : Positie van de muis op de verwarming pad met de nasale katheter en het filtreerpapier in plek. De figuur illustreert de tong plaats zijwaarts (a), de pijp (b) en de zakdoek (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
3. Posttest overstromingsbeoordeling en -beheer
<ol><li>Laat de muisknop los van de verwarming pad.</li>
	<li>Veeg de neus van de muis met de 'bed vel' (Figuur 2g).</li>
	<li>Injecteren intraperitoneally de verdoving antagonist mix samengesteld uit een vaste dosis (4 µg) van naloxon, een concurrerende morfine-antagonist en atipamezole, een medetomidine specifieke tegengif (2 mg/kg lichaamsgewicht).</li>
	<li>Leg de muis op de kleinere verwarming pad in het vak herstel tot volledig herstel, dat meestal na 1 tot 2 uur waargenomen wordt. Opmerking: In de UCL-Laboratorium, ongeveer 10% sterfte, voornamelijk ten gevolge bronchoaspiration van oplossingen geperfundeerd in de neusholte tijdens de proef wordt waargenomen ongeacht het geslacht of de genotype.</li>
</ol>

<ol><li>Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bioelectric+potential+difference+across+respiratory+epithelia+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).</li>
<li>Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+in+vivo+measurement+of+the+ion+transport+defects+in+cystic+fibrosis+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium.</a> European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).</li>
<li>Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nasal+potential+difference%3A+techniques+and+protocols+for+assessing+efficacy+of+gene+transfer+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis.</a> Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).</li>
<li>Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18493878">Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders.</a> Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).</li>
<li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10712334">A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).</li>
<li>Clancy, J. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11401894">Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).</li>
<li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa022170">Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations.</a> New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).</li>
<li>Sermet-Gaudelus, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17394637">In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study.</a> BMC Medicine. 5, 5(2007).</li>
<li>Clancy, J. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17347447">No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations.</a> American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).</li>
<li>Kerem, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18722008">Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial.</a> Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).</li>
<li>Sermet-Gaudelus, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20622033">Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).</li>
<li>Wilschanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ataluren+%28PTC124%29+treatment+of+nonsense+mutation+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).</li>
<li>Accurso, F. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21083385">Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>Clancy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+phase+IIa+study+of+VX-809%2C+an+investigational+CFTR+corrector+compound%2C+in+subjects+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+the+F508del-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation.</a> Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).</li>
<li>Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+placebo-controlled+trial+of+miglustat+in+cystic+fibrosis+based+on+nasal+potential+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).</li>
<li>De Boeck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+biomarkers%3A+time+for+promotion+to+surrogate+end-point%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point.</a> European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).</li>
<li>Leal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+protocol+of+anaesthesia+for+measuring+transepithelial+nasal+potential+difference+in+spontaneously+breathing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice.</a> Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).</li>
<li>Lubamba, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18006891">Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).</li>
<li>Lubamba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+delivery+of+low-dose+miglustat+normalizes+nasal+potential+difference+in+F508del+cystic+fibrosis+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).</li>
<li>Lubamba, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20562123">Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice.</a> European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).</li>
<li>Vidovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-CFTR%CE%94R+Rescues+the+Cystic+Fibrosis+Phenotype+in+Human+Intestinal+Organoids+and+Cystic+Fibrosis+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).</li>
<li>Stutts, M. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7543698">CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269 (5225), 847-850 (1995).</li>
<li>Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%3A+insight+into+CFTR+pathophysiology+and+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy.</a> Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2570460">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+cloning+and+characterization+of+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).</li>
<li>Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inverts+protein+kinase+A-mediated+regulation+of+epithelial+sodium+channel+single+channel+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).</li>
<li>Ismailov, I. I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8617738">Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).</li>
<li>Althaus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENaC+inhibitors+and+airway+re-hydration+in+cystic+fibrosis%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art.</a> Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).</li>
<li>Wilke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+cystic+fibrosis%3A+phenotypic+analysis+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).</li>
<li>Van Doorninck, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+cystic+fibrosis+delta+F508+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation.</a> The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).</li>
<li>Colledge, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+a+delta+F508+cystic+fibrosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model.</a> Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).</li>
<li>Zeiher, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+delta+F508+allele+of+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).</li>
<li>Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+nasal+membrane+potential+difference+with+inhaled+amiloride+and+loperamide+in+the+cystic+fibrosis+%28CF%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse.</a> Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).</li>
<li>Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+blockers+and+uridine+triphosphate%3A+effects+on+nasal+potential+difference+in+cystic+fibrosis+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice.</a> European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.scirp.org/journal/PaperInformation.aspx?paperID=19066">Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice.</a> Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).</li>
<li>Tannenbaum, J., Bennett, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Russell+and+Burch%27s+3Rs+then+and+now%3A+the+need+for+clarity+in+definition+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25650968">AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).</li>
<li>Salinas, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+involvement+in+nasal+potential+differences+in+mice+and+pigs+studied+using+a+thiazolidinone+CFTR+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cell+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor.</a> American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).</li>
<li>Fisher, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+processing+and+function+of+human+and+ferret+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).</li>
<li>Kaza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ferrets+for+electrophysiologic+monitoring+of+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport.</a> PLoS One. 12 (10), 0186984(2017).</li>
<li>Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. <a target="_blank" href="https://dial.uclouvain.be/pr/boreal/object/boreal:187347">Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72(2017).</li>
<li>Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+airway+epithelial+Na%2B+absorption+produces+cystic+fibrosis-like+lung+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice.</a> Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).</li>
<li>Shah, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+acidification+initiates+host+defense+abnormalities+in+cystic+fibrosis+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice.</a> Science. 351 (6272), 503-507 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het doel van deze paper is te beschrijven een voldoende protocol voor het meten van de nasale PD onder continue perfusie van oplossingen in spontaan ademhaling muizen voor een lengte van de tijd die nodig is voor het testen van de integriteit van ion vervoerders, voornamelijk CFTR en ENaC. Alle stappen van het protocol zijn zorgvuldig geoptimaliseerd om ervoor te zorgen volledige dierlijke herstel en goede kwaliteit en reproduceerbare gegevens. In bepaalde, kritische stappen zijn verdoving beoordeling en beheer, en voldo...

Voor bijna drie decennia, zijn elektrische potentiële verschil (PD) metingen gebruikt voor de evaluatie van de functionele status van transmembraan ion vervoerders uitgedrukt op de nasale mucosa, als vertegenwoordiger van de distale airways1. Zoals een meerstaps dynamische test2,3, nasaal PD functionele dissectie van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) en epitheliale natrium kanaal (ENaC) activiteit maakt, gelokaliseerde zowel in de apicale membraan van epitheliale cellen en belangrijke rol in de luchtweg oppervlakte hydratatie uit te oefenen. De belangrijke klinische toepassing van de nasale PD-test is te helpen bij de diagnose van CF, de meest voorkomende fatale erfelijke aandoening in de Kaukasische bevolking met een gemiddelde incidentie van 1 van 2.500 levendgeborenen in Europese landen. De test heeft lang bewezen nuttig bij het diagnosticeren van verzwakte, oligo - of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasie4. Meer recent, clinometric evaluatie van de therapeutische modulatie van de fundamentele CFTR defect5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 gebruik heeft gemaakt van de nasale PD in klinische proeven van nieuwe CF-therapieën. De test is in de instelling van de preklinische aangepast aan de muis17 dat onderzoek van de topicale van nieuwe CF doel therapieën18,19,20,21. De techniek is in muizen, delicaat, gebaseerd op soorten-gerelateerde anatomische verschillen in grootte van de nasale regio tussen knaagdieren en de mens, en vooral op de essentiële rol van sensorische input uit de nasofacial regio in knaagdieren. Het vereist opgeleide en bekwame operatoren, speciale apparatuur en benodigdheden.
CF is een multi-systemische aandoening van exocrine klieren, in welke chronische ademhalingsziekte domineert het klinisch beeld. De ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het gen dat de cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) codering-geregeld CFTR chloride kanaal22. Tot op heden meer dan 2.000 CFTR-mutaties geweest geïdentificeerde23. De meest voorkomende mutatie24,25, gevonden in bijna 90% van CF allelen, komt overeen met een schrapping van de fenylalanine in positie 508 van de polypeptide keten van het eiwit (F508del-CFTR). Het CFTR-eiwit is een zuiver Ohmse kleine huidgeleiding chloride kanaal. Er is ook aanzienlijke bewijs dat CFTR andere vervoer mechanismen, in het bijzonder ENaC26,27 regelt. Defecte elektrolyt vervoer, met inbegrip van verlaagde CFTR-afhankelijke chloride geleidingsvermogen en verhoogde ENaC-afhankelijke natrium geleidingsvermogen, is een kenmerk van CF epitheel. Het voormalige defect wordt weerspiegeld door een verlaagd of afgeschaft repolarisatie in reactie op zowel een elektrochemische gradiënt gunste chloride efflux en de toevoeging van isoprenaline (een β-adrenergic agonist die verhoogt van intracellulaire cAMP) of forskolin (een adenylaat cyclase agonist, niet goedgekeurd voor klinisch gebruik). Het laatste defect wordt weerspiegeld door een basale hyperpolarisatie van de nasale mucosa (een negatiever PD) en een verhoogde reactie op amiloride, een diureticum drug die ENaC28 blokkeert.
CF Muismodellen zijn vaak gebruikt in CF onderzoek en zijn onschatbare waarde bij het ontleden van CF pathologie. Tegenwoordig, zijn ten minste vijftien modellen beschreven29, waarvan er drie homozygoot voor de klinisch meest relevante31,F508del mutatie30,-32 zijn. Een van deze drie stammen30, ontwikkeld aan de Erasmus Universiteit in Rotterdam, is al bijna 20 jaar gebruikt in de Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. De Cftrtm1Eur model30 heeft bewezen zeer nuttig te bestuderen van de multiorgan pathofysiologie van CF ziekte en te testen van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische strategieën18,19,20, 21. Talrijke problemen zich voordoen tijdens of na vroege (< 24u) de nasale PD test in muizen. In deze paper, de voldoende diepte van anesthesie nodig voor het houden van een nasale katheter in situ voor continue perfusie, en maatregelen om te vermijden broncho-aspiratie van geperfundeerd in de neus oplossingen worden beschreven. De verzorging van de dieren aan het einde van de test is ook beschreven, met inbegrip van de administratie van een combinatie van antidota van verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Over het geheel genomen is deze procedures kunnen betrouwbare metingen in spontaan ademhaling muizen, verminderde test-gerelateerde sterfte en herhalen de test in hetzelfde dier. Representatieve gegevens verkregen uit de nasale PD-test in een CF en in een wild-type muis worden getoond en besproken.
Het lymfkliertest nasale PD testprotocol wordt gerapporteerd in drie sessies: overstromingsbeoordeling en – beheer vóór, tijdens en na de test. In de voortest overstromingsbeoordeling en -beheer, wordt het protocol van voorbereiding van de dubbele lumen nasale katheter en oplossingen gebruikt voor continue nasale perfusie uitvoeriger beschreven. Tijdens de beoordeling en het beheer van gedeelten van de test, is de experimentele opstelling en de behandeling van de muis minutieus ontleed. Ten slotte, beheer van het dier aan het eind van de test wordt beschreven om het herstel van de volledige dier verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Portex polyethyleen buis&nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, Engeland CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td><td>om capillaire buizen voor nasale sonde voor te bereiden</td></tr><tr><td>Elektrodecrème</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux crème</td><td>om elektrodebrils te bouwen</td></tr><tr><td>Ag/AgCl-elektroden</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>meet- en referentie-elektroden</td></tr><tr><td>amiloridhydrochloride</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>om perfusieoplossingen voor te bereiden</td></tr><tr><td>forskoline</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>om perfusieoplossingen voor te bereiden</td></tr><tr><td>Knick Portamess voltmeter</td><td>Elektronisch Me&beta;ger&auml;te, Berlijn, Duitsland</td><td>Portavo 904 pH</td><td>om potentiaalverschil te meten</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 Software&nbsp;</td><td>Elektronisch Me&beta;ger&auml;te, Berlijn, Duitsland</td><td>Paraly SW112 software</td><td>om potentiaalverschilgegevens vast te leggen</td></tr><tr><td>midazolam&nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, België</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>om als anesthetische premedicatie te dienen</td></tr><tr><td>fentanyl</td><td>Janssen Cilag, Berchem, België</td><td>Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml</td><td>om als anesthetische medicatie te dienen</td></tr><tr><td>medetomidine</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>om als anesthetische medicatie te dienen</td></tr><tr><td>droperidol&nbsp;</td><td>Janssen&nbsp; Cilag, Berchem, België</td><td>Dehydrobenzperidol 2,5 mg/ml</td><td>om als anesthetische medicatie te dienen</td></tr><tr><td>clonidine&nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Duitsland</td><td>Catapressan 0,15 mg/ml,</td><td>om als anesthetische medicatie te dienen</td></tr><tr><td>referentie IV-katheter</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0,75 IN, BD Insyte-W</td><td>om elektrodebrils te bouwen</td></tr><tr><td>tang&nbsp;</td><td>Fine science Tools, Heidelberg, Duitsland</td><td>Dumont #5, Fine science Tools</td><td>om de nasale katheter te plaatsen</td></tr><tr><td>naloxon&nbsp;</td><td>Braun Medical, Brussel, België</td><td>Narcan, 0,4 mg/ml</td><td>om als anesthetische antagonist te dienen</td></tr><tr><td>atipamezole&nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, België</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>om als medetomedine-specifiek tegengif te dienen&nbsp;</td></tr><tr><td>Verwarmingskussens&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>om hypothermie tijdens en na de test te voorkomen</td></tr><tr><td>Peristaltische pomp P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Zweden</td><td>18111091</td><td>om oplossingen in de muizenneus te perfunderen</td></tr><tr><td>cyanoacrylaatlijm</td><td>Loctite, Henkel, D&uuml;sseldorf, Duitsland&nbsp;</td><td>superlijm 3</td><td>om twee capillaire buizen&nbsp; voor nasale sonde aan elkaar te lijmen</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>Na gluconaat</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>Ca gluconaat</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Farma-kwaliteit, USP</td></tr><tr><td>BD-naald&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, VS</td><td>BD 26G (0,45x10 mm)</td><td>intraperitoneale injectie</td></tr></tbody></table>

nasale potentiaalverschil te kwantificeren trans-epitheliale ion vervoer in muizen

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

De nasale potentiële verschil test is gebruikt voor bijna drie decennia om te helpen bij de diagnose van cystic fibrosis (CF). Het heeft bewezen nuttig zijn in gevallen van verzwakt, oligo - of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasieën. In zowel klinische en preklinische instellingen, is de test gebruikt als een biomarker te kwantificeren reacties op gerichte therapeutische strategieën voor CF. aanpassing de test een muis uitdagend is en leiden een geassocieerde mortaliteit tot kan. Deze paper beschrijft de voldoende diepte van verdoving nodig om te handhaven een nasale katheter in situ voor continue perfusie. Het somt de maatregelen ter voorkoming van broncho-aspiratie van oplossingen geperfundeerd in de neus. Hierin wordt ook de verzorging van de dieren aan het einde van de test, met vermelding van de administratie van een combinatie van antidota van de verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Representatieve gegevens verkregen uit een CF en een wild-type muis tonen aan dat de test tussen CF en niet-CF discrimineert. Over het geheel genomen kunnen het protocol hier beschreven betrouwbare metingen van de functionele status van trans-epitheliale chloride en natrium vervoerders in spontaan ademhaling muizen, evenals meerdere tests in hetzelfde dier terwijl het verminderen van test-gerelateerde sterfte.

Om te illustreren de karakteristieke ion vervoer abnormaliteiten in CF, werden nasale PD-metingen uitgevoerd volgens de hierboven beschreven in een F508del-CF-muis en een wild-type controle van de genetische achtergrond van FVB/129 van de Brussel kolonie protocol CFTRtm1Eur muizen30. Dit klinisch relevante model, herbergen van de meest voorkomende en één van de ernstigste F508del-CFTR mutatie23,24</sup...

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de nasale potentiaalverschil in muizen. De test kwantificeert de functie van transmembraan ion vervoerders zoals de cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regelgever en de epitheliale natrium-kanaal. Het is waardevol om te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor cystic fibrosis.

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

De nasale potentiaalverschil is een waardevolle methode om het fenotype te karakteriseren van transgene muizen die cystic fibrosis modelleren. Het maakt onderzoek mogelijk naar de effectiviteit van nieuwe soorten therapieën voor cystic fibrosis. De belangrijkste voordelen van de techniek zijn dat het betrouwbare metingen biedt in muizen die continu worden gefokt.Het vermindert gerelateerde sterfte en het maakt herhaling van de test bij hetzelfde dier mogelijk. Om de dubbele lumen nasale katheter voor te bereiden, houdt u het midden van een 20 centimeter lange polyethyleenbuis ongeveer 10 tot 15 seconden in de vlam totdat deze zacht genoeg is om te trekken. Trek vervolgens de twee uiteinden uit elkaar om een zeer dunne capillaire buis van ongeveer 15 centimeter lang en een buitendiameter van 0,1 millimeter voor de nasale sonde te verkrijgen.Reinig en ontvet vervolgens de twee capillairen met zuivere ethanol. Verbind ze met plakband en lijm ze samen met cyanoacrylaatlijm. Snijd de overtollige lengte van de sondes weg met een scheermes om de dubbele lumen katheter van ongeveer acht centimeter lang te verkrijgen.Injecteer vervolgens water door beide lumina om te controleren of ze doorl

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatieve, gemakkelijk te voeren, en betrouwbare manier te beoordelen olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Dit protocol beschrijft een recording setup, muis weefsel voorbereiding, het verzamelen van gegevens, en de elementaire data-analyse.

Het analyseren Reacties van Mouse Olfactorische sensorische neuronen Met behulp van de Air-fase Electroolfactogram opnemen

This video demonstrates electrophysiological recording of olfactory sensory neurons (OSNs) in mice using a perforated patch-clamp technique. The olfactory epithelium, containing OSNs with fluorophore-tagged odor receptors, is isolated from a mouse and secured in a recording chamber. A recording pipette is clamped to the dendritic knob of an OSN, and nystatin within the pipette perforates the membrane to form electrical connectivity with the cell. Finally, another pipette is used to deliver an...

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

Een effectieve Manual Uitbenerij methode om Intact Mouse neusweefsel bereiden met Bewaarde Anatomische Organisatie

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Hier beschrijven we een fysiologische aanpak die identificatie en diepgaande analyse van een gedefinieerde populatie van sensorische neuronen in acute coronale weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis mogelijk maakt, met behulp van opnames met gehele cel patch-clamp.

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

Dit protocol beschrijft real-time iontoforese, een methode die fysieke parameters meet van de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen. De diffusie van een inert molecuul dat in de ECS wordt vrijgegeven, wordt gebruikt om de ECS volume fractie en tortuositeit te berekenen. Het is ideaal voor het bestuderen van acute omkeerbare veranderingen in hersen ECS.

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het meten van de nasale potentiaalverschil (NPD). Cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regelgever (CFTR) en epitheliale natrium kanaal (ENaC) functie worden geëvalueerd door de verandering in de spanning over de nasale epitheel na superfusion van oplossingen die ion kanaal activiteit, wijzigen mits een resultaat maatregel.

Gestandaardiseerde meting van nasale membraan Transepithelial potentieel verschil (NPD)

Darmepitheel verleent niet alleen opname van voedingsstoffen, maar ook bescherming tegen schadelijke stoffen. De apicale meest epitheliale intercellulaire junctie, d.w.z. de tight junction, reguleert paracellulaire opgeloste stof en ionenpermeabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de bereiding van mucosale vellen en beoordeling van de ionenselectiviteit van tight junctions met behulp van Ussing-kamertechniek.

Functionele beoordeling van intestinale tight junction barrier en ionendoorlaatbaarheid in inheems weefsel door Ussing Chamber Technique

Hier beschrijven we de isolatie, versterking en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcellen (HNE) op het lucht-vloeistofinterface en een biobankingprotocol dat het mogelijk maakt om met succes versterkte HNE te bevriezen en vervolgens te ontdooien. Het protocol analyseert elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde HNE-cellen en CFTR-gerelateerde chloridesecretiecorrectie bij verschillende modulatorbehandelingen.

Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Leer het meten van nasaal potentiaalverschil bij muizen om iontransport te kwantificeren. Deze methode evalueert CFTR-functie en nieuwe cystic fibrosis-therapieën betrouwbaar.

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

Meer video's verkennen