Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen
4 juli 2018
Hier presenteren we een protocol voor het meten van de nasale potentiaalverschil in muizen. De test kwantificeert de functie van transmembraan ion vervoerders zoals de cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regelgever en de epitheliale natrium-kanaal. Het is waardevol om te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor cystic fibrosis.
De nasale potentiaalverschil is een waardevolle methode om het fenotype te karakteriseren van transgene muizen die cystic fibrosis modelleren. Het maakt onderzoek mogelijk naar de effectiviteit van nieuwe soorten therapieën voor cystic fibrosis. De belangrijkste voordelen van de techniek zijn dat het betrouwbare metingen biedt in muizen die continu worden gefokt.
Het vermindert gerelateerde sterfte en het maakt herhaling van de test bij hetzelfde dier mogelijk. Om de dubbele lumen nasale katheter voor te bereiden, houdt u het midden van een 20 centimeter lange polyethyleenbuis ongeveer 10 tot 15 seconden in de vlam totdat deze zacht genoeg is om te trekken. Trek vervolgens de twee uiteinden uit elkaar om een zeer dunne capillaire buis van ongeveer 15 centimeter lang en een buitendiameter van 0,1 millimeter voor de nasale sonde te verkrijgen.
Reinig en ontvet vervolgens de twee capillairen met zuivere ethanol. Verbind ze met plakband en lijm ze samen met cyanoacrylaatlijm. Snijd de overtollige lengte van de sondes weg met een scheermes om de dubbele lumen katheter van ongeveer acht centimeter lang te verkrijgen.
Injecteer vervolgens water door beide lumina om te controleren of ze doorlaatbaar zijn en maak een markering op een afstand van vijf millimeter van de punt. Bereid vervolgens een crèmemix voor door de elektrolytcrème en verzadigde drie molaire kaliumoplossing te mengen in een verhouding van één op één, waarbij de vorming van kleine luchtbellen wordt vermeden. Voor de experimentele opstelling, om hypothermie tijdens en na de test te voorkomen, gebruikt u twee verwarmingspads, één voor de meetopstelling en de andere voor de doos waarin het dier aan het einde van de test voor herstel zal worden geplaatst.
Schakel de computer in, die is aangesloten op de gegevensgeheugen hoge ingangsimpedantie en hoge resolutie voltmeter. Open vervolgens de software voor gegevensopname. Sluit de elektroden aan op de voltmeter.
Dompel de punt van de elektroden samen in de crèmemix. Controleer de initiële elektrode-offsetwaarde en verwerp de elektroden als de waarde groter is dan plus of min twee millivolt. Schakel vervolgens de peristaltiekpomp in en steek de pompslang in het perfusielumina van de nasale katheter.
Vul een lumen van de nasale katheter met elektrolytcrèmemix door een 10 microliter pipettetip. Pas de katheter aan op een siliconenbuisconnector en vul de connector met crèmemix. Steek vervolgens de positieve elektrode in de connector.
Controleer de offsetwaarde van de meetelektrodebrug en verwerp de bruggen als de waarde groter is dan plus of min twee millivolt. Verbind vervolgens de proximale uitlaat van de pompslang met het flesje met de geselecteerde oplossing voor nasale perfusie. Verbind vervolgens de distale uitlaat van de pompslang met het perfusielumina van de nasale katheter.
Vul vervolgens het tweede lumen van de nasale katheter met verse oplossing A1.Dompel de punt van de nasale katheter in het flesje met oplossing A.Keer de richting van de peristaltiekpomp om de lengte van de nasale katheter te vullen die overeenkomt met 10 seconden perfusie. Vouw vervolgens een vel absorberend weefsel om een kussen van drie centimeter breed te maken dat zal worden gebruikt als ondersteuning voor het muishoofd. Bedek de verwarmingspad met het vel absorberend weefsel.
Leg vervolgens de muis op zijn rug op de verwarmingspad en plak de ledematen en de staart op de pad. Steek vervolgens de intraveneuze referentiekatheter in de subcutane ruimte van een achterpoot. Verwijder de naald en pas deze aan in de siliconenbuisconnector.
Vul de katheter en de connector met crèmemix. Verbind vervolgens de positieve meetelektrode met de nasale katheter en de negatieve referentie-elektrode met de katheter die in de subcutane ruimte van de achterpoot van het dier is ingebracht. Bevestig vervolgens de katheter en de elektrode met plakband zoals vereist om verplaatsing te voorkomen.
Na het plaatsen van de referentie-elektrode en bruggen, verifieer de offsetwaarde van de meetelektrodebrug opnieuw door de punt van de nasale katheter in de elektrodecrèmemix in de connector van de IV-katheter te dompelen. Noteer de stabiele, uiteindelijke offsetwaarde. Bevestig nu de oren van de muis met plakband op de verwarmingspad in een vrije ruimte tussen de twee stukken absorberend weefsel.
Fixeer de vibratie zonder de ogen aan te raken. Om vocht uit de mondholte te absorberen, beweeg de tong zijwaarts en steek een puntige wik van filterpapier ongeveer een centimeter in de mond. Om vocht dat uit de geperfuseerde neusloop loopt te absorberen, plaats een tweede stuk filterpapier bij de neus.
Controleer de positieve controlewaarde van het epitheelpotentieel door de punt van de nasale katheter in de binnenkant van de mond te plaatsen. Houd het vast met fijne pincetten en onder goede directe verlichting, introduceer de nasale katheter delicaat in een neusgat, tot vier tot zes millimeter vanaf de neuspunt. Vijf minuten na het injecteren van de anesthesiegeneesmiddelen, kantelt u de verwarmingspad voorzichtig ongeveer 30 graden met het dierenhoofd naar beneden.
Bewaak de maximale basale PD-waarde. Wanneer deze stabiel is gedurende 30 seconden, begin met het perfunderen van de nasale mucosa met 10 microliters per minuut met de vier gebufferde oplossingen achter elkaar. Perfuseer de eerste oplossing gedurende 10 seconden, en elke volgende oplossing gedurende vijf minuten, of totdat een stabiele spanning is bereikt.
Stop met het perfunderen van Forskolin wanneer de tijdelijke Forskolin-respons begint te dalen. Na de beoordeling, laat de muis los van de verwarmingspad. Toedien hem met het anesthesie-antagonistmengsel en breng hem over naar de herstelbox met verwarmingspad tot volledig herstel.
Hier zijn de representatieve nasale PD-traceringen van een homozygote, normale muis en een muis homozygoot voor de F508-deletie CFTR-mutatie, samen met de individuele waarden die zijn verkregen voor de nasale PD-parameters. Amiloridrespons is het verschil tussen de waarden van nasale PD aan het einde en aan het begin van de perfusie van de nasale mucosa met basale gebufferde zout oplossing bevattende amilorid. Chloridevrije respons is het verschil tussen de waarden van nasale PD aan het einde en aan het begin van de perfusie van de nasale mucosa met chloridevrije gebufferde zout op
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van het nasale potentiaalverschil bij muizen, waarmee de functie van transmembraan-iontransporteurs wordt gekwantificeerd. De methode is bijzonder nuttig voor het evalueren van nieuwe therapieën voor cystische fibrose.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Transgene Modellen
Achtergrond
- Het potentiaalverschil in de neus is een methode om transgene muizen te karakteriseren.
- Het helpt bij het beoordelen van de effectiviteit van nieuwe therapieën voor cystische fibrose.
- De techniek is voordelig voor muizen die continu worden gefokt.
- Het minimaliseert de daarmee samenhangende sterfte en maakt herhaalde tests in hetzelfde dier mogelijk.
Doel van de studie
- Om het neussap-potentiaalverschil bij muizen te meten.
- Om de functie van ionentransporteurs zoals CFTR en ENaC te evalueren.
- Om de effectiviteit van nieuwe behandelingen voor cystische fibrose te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een dubbellumen neuskatheter.
- Meting van het neuspotentiaalverschil in transgene muizen.
- Beoordeling van de ionentransportfunctie.
- Evaluatie van de therapie-effectiviteit.
Belangrijkste resultaten
- Betrouwbare metingen verkregen uit continu fokkende muizen.
- Vermindering van de mortaliteit gerelateerd aan testprocedures.
- Mogelijkheid om tests in hetzelfde dier te herhalen.
- Inzichten in de effectiviteit van nieuwe therapieën voor cystische fibrose.
Conclusies
- Het nasale potentiaalverschil is een waardevolle methode voor onderzoek naar cystic fibrosis.
- Het protocol verhoogt de betrouwbaarheid van metingen in muismodellen.
- Deze techniek ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De meting van het nasale potentiaalverschil (NPD) bij muizen biedt een functionele weergave van het trans-epitheliale ionentransport, wat preklinische evaluatie van therapieën voor cystische fibrose (CF) mogelijk maakt. Door de CFTR- en ENaC-activiteit in vivo te kwantificeren, ondersteunt deze methode de validatie van targets en het mechanistisch reduceren van risico's in de vroege ontdekkingsfase. Herhaald testen in hetzelfde dier vermindert de variabiliteit en verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid voor go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van CF-therapieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het functionele chloride- en natriumtransport in CF-muismodellen te meten.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van CFTR-modulatoren mogelijk door middel van directe fenotypering van het ionentransport.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door CF te onderscheiden van wild-type fenotypen via amiloride-, chloride-vrije en forskoline-responsen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op assay-standaardisatie met behulp van dubbel lumen neuskatheters en gecontroleerde perfusie.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door stabiele verificatie van de electrode-offset en consistente perfusieprotocollen voor oplossingen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door het meten van ionentransport-responsen op amiloride-, chloridevrije en forskoline-oplossingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door functionele defecten in CFTR- en ENaC-transporters in spontaan ademende muizen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt translationele continuïteit door meerdere tests per dier mogelijk te maken, waardoor de inter-individuele variabiliteit tussen dieren wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door kwantitatieve PD-curven te leveren die correleren met het genotype.
Integratie van Pipeline & Workflow
De NPD-methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische evaluatie en levert functionele ionentransportgegevens die bijdragen aan beoordelingen van de therapeutische effectiviteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door basale en gestimuleerde nasale potentiaalverschillen in transgene muizen te meten.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde perfusie van gebufferde oplossingen en stabiele spanningsmetingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (amiloride-respons, chloride-vrije respons, forskoline-respons, totale chloride-respons) voor het vergelijken van condities.
- Translationeel Onderzoek: Draagt bij aan preklinische continuïteit door herhaalde testen in hetzelfde dier mogelijk te maken om longitudinale effecten van behandelingen te monitoren.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare methode voor de karakterisering van CF-modellen over meerdere therapeutische iteraties.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij doelvalidatie via kwantitatieve fenotypering van ionentransport.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via kathetervoorbereiding, elektrodekalibratie en perfusiecontroles.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit bij de werkzaamheid van CFTR- en ENaC-modulatoren.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van de correctie van functionele transportdefecten in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in het beheer van anesthesie bij knaagdieren en technieken voor nasale catheterisatie.
- Instrumentatie, waaronder een hoogimpedantievoltmeter, een peristaltische pomp en temperatuurgecontroleerde warmtematten.
- Standaardisatie tussen teams van de bereiding van oplossingen, verificatie van de elektrode-offset en de timing van de perfusie.
- Overwegingen voor aanpassingen bij verschillende knaagdierstammen en CFTR-mutatiemodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de chirurgische delicatesse bij toegang tot de neusholte en de optimalisatie van de anesthesiediepte om broncho-aspiratie te voorkomen.
