Experimentele Protocol voor de behandeling van de gedragsmatige reactie profielen in larvale vissen: toepassing op de Neuro-stimulerende cafeïne
24 juli 2018
Hier presenteren we een protocol te onderzoeken larvale zebravis en fathead minnow motorische activiteiten en photomotor Reacties (PMR) met behulp van een geautomatiseerd tracking-software. Wanneer opgenomen in algemene toxicologie bioassays, geven analyses van deze gedragingen een diagnostisch instrument om te onderzoeken van chemische topicale. Dit protocol wordt beschreven met behulp van cafeïne, een neurostimulant model.
Vismodellen hebben veel voordelen en worden daarom steeds meer gebruikt in de biomedische wetenschappen. Van ontwikkeling tot geneesmiddelontdekking en toxicologische studies. Het gedrag van vismodellen wordt eveneens steeds meer gebruikt voor milieu- en biomedisch onderzoek.
Hier is het bijzonder belangrijk om decennia van onderzoekservaring op het gebied van aquatische toxicologie en gedragsecologie te benutten om de milieu-biomedische wetenschappen vooruit te helpen. Onze methode kan worden gebruikt om de bioactiviteiten van chemicaliën en de voordelen en gevaren die ze kunnen opleveren te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een gevoelige en snelle aanpak biedt om de chemische activiteiten van diagnostiek te begrijpen die nuttig zijn voor de milieu- en biomedische wetenschappen.
De implicaties van deze techniek zijn bedoeld om de diagnose van commerciële bioactiviteiten en gedragseffecten te ondersteunen. De meeste van deze chemicaliën hebben vaak geen belangrijke toxiciteitsinformatie. Het kan echter ook worden toegepast om de effecten van andere chemicaliën zoals farmaceutische producten en pesticiden te begrijpen.
Dit aspect is belangrijk om te overwegen, aangezien vergelijkende milieufarmacologie en toxicologiegegevens vaak ontbreken voor industriële verbindingen. Naast het meten van de larvenlocomotorische activiteit tijdens veranderende lichte, donkere fotoperioden, kan dit protocol worden gebruikt om larvenfotomotorische reacties te meten. Die effectief de omvang van de bewegingsverschillen tussen licht naar donker en donker naar licht overgangen onderzoeken.
Om te beginnen, lost cafeïne op in gereconstituteerd hard water. Voer vervolgens seriële verdunningsreeks uit om lagere cafeïnebehandelingsniveaus te produceren. Om de individuele blootstellingskamers voor te bereiden, giet 20 milliliter oplossing in vier glazen bekers van 100 milliliter voor de zebravis.
Giet 200 milliliter oplossing in drie glazen bekers van 500 milliliter voor de fathead minnows. Gebruik vervolgens een overdrachtspijp om 10 gerijpte zebravis-embryo's van vier tot zes uur na bevruchting in elk van de bekers te plaatsen. Gebruik een aangepaste overdrachtspijp om 10 fathead minnow-larven die binnen 24 uur na het uitkomen zijn geplaatst in elk van de blootstellingskamers.
Plaats de zebravis- en fathead minnow-kamers in een incubator. Laad na 96 uur individuele vissen in afzonderlijke putjes van 48 en 24 welplates. Plaats een welplaat met ten minste één larvenvis in de opnamekamer.
Klik vervolgens in de videotrackingsoftware op bestand genereer protocol. Voer in het vak locatietelling het aantal individuele putjes van de welplaat in. En klik op OK.Klik bovenaan het scherm op volledig scherm bekijken.
Om een overheadcameraweergave van de welplaat weer te geven. Klik vervolgens op het pictogram gebieden tekenen. Selecteer het cirkelpictogram in het veld gelabelde gebieden.
Gebruik de cursor om het cirkelvormige videotrackinggebied van de bovenste linkerput van de plaat af te bakenen. Selecteer de bovenste rechter markering en omlijn het weergavegebied van de bovenste rechterput. Selecteer vervolgens de onderste markering om het onderste rechterputje te omlijnen.
Nadat de weltrackinggebieden zijn gedefinieerd, klikt u op bouwen om de software te laten weergavegebieden van de resterende putten af te bakenen. Klik in het kalibratiegebied op schaal tekenen en teken een horizontale lijn over de plaat. Zodra de lijn is getekend, verschijnt een dialoogvenster met de label kalibratiemeting.
Voer de welplaatlengte in dit vak in en klik op OK.Klik op toepassen op groep in het kalibratiegebied. Om de tekengebiedmanager te verlaten, klikt u op het pictogram gebieden tekenen. Klik vervolgens op het tegelpictogram.
Gebruik de cursor om alle dozen die op het beeldscherm verschijnen te markeren, zodat elke doos groen is. Klik op bekijken en volledig scherm. Klik vervolgens in het vak detectiedrempel op bkg en gebruik de drempelaanpassingsbalk om de pixeldetectiedrempel in te stellen.
Zodra de juiste drempel is geselecteerd, klikt u op toepassen op groep. Voer in het vak bewegingsdrempel de gewenste snelheidsparameters voor het bijhouden van bewegingen in. Zodra de snelheidsparameters zijn ingesteld, klikt u op toepassen op groep.
Klik vervolgens op protocolparameters in het vervolgkeuzemenu. Selecteer in het dialoogvenster het tabblad tijd en voer de observatie- en integratietijden in. Klik op ok en open het dialoogvenster met de lichtbesturingsinstellingen door lichtbesturing te selecteren in het vervolgkeuzemenu parameters.
Stel de lichtdonkere fotoperiodetijden en lichtintensiteit voor elke fotoperiode in. Klik vervolgens op ok. Sla vervolgens het observatieprotocol op.
Plaats eerst de welplaat met de experimentele vissen in de gedragsopnamekamer. Open vervolgens het eerder ontwikkelde trackingprotocol. Zorg in de videotrackingviewer dat alle larven zichtbaar zijn, dat er slechts één larve in elk putje aanwezig is en dat de putjes zijn uitgelijnd met de gedefinieerde observatiegebieden.
Klik vervolgens op experiment en voer uit. Geef de naam en opslaglocatie van de gegevens op. Klik op het pictogram met meerdere live-afbeeldingen om alle vooraf gedefinieerde weergavegebieden te markeren.
Sluit ten slotte het paneel van de opnamekamer en klik op achtergrond gevolgd door start op het computerscherm. Na 96 uur blootstelling aan cafeïne werd de fotomotorische respons van fathead minnow-larven bij lagere niveaus dan zebravissen door cafeïne veranderd. Er werd echter een opmerkelijk groter aantal fotomotorische eindpunten bij zebravissen beïnvloed.
Bovendien werd lichte en donkere locomotorische activiteit geanalyseerd voor drie snelheidsdrempels voor afgelegde afstand, aantal bewegingen en duur van bewegingen. Bij beide soorten remde cafeïne de activiteit op alle significant beïnvloede locomotorische eindpunten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat gedragsanalyses moeten worden verbonden met een nauwkeurige specifieke tijdsvenster.
<Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het onderzoeken van de locomotorische activiteiten en fotomotorische reacties van zebravislarven en vetkopminnows met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware. De methode is erop gericht toxicologische bioassays te verbeteren door inzicht te bieden in chemische bioactiviteit, geïllustreerd aan de hand van het gebruik van cafeïne als modelneurostimulant.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Gedragsecologie
- Aquatische toxicologie
- Biomedisch onderzoek
Achtergrond
- Vismodellen worden in toenemende mate ingezet in de biomedische wetenschappen.
- Gedragsstudies bij vissen kunnen bijdragen aan milieukundig en biomedisch onderzoek.
- Inzicht in chemische bioactiviteiten is essentieel voor het beoordelen van de voordelen en risico's ervan.
- Vergelijkende gegevens over milieufarmacologie en toxicologie ontbreken vaak.
Doel van de studie
- Om een gevoelige en snelle methode te ontwikkelen voor het beoordelen van chemische activiteiten.
- Om de diagnose van commerciële bioactiviteiten en gedragseffecten te ondersteunen.
- Om een gestandaardiseerde aanpak te bieden voor het evalueren van de effecten van diverse chemicaliën.
Gebruikte methoden
- Het oplossen van cafeïne in gereconstitueerd hard water voor blootstelling.
- Het gebruik van geautomatiseerde trackingsoftware om locomotorische en fotomotorische reacties te analyseren.
- Het uitvoeren van seriële verdunningen om verschillende cafeïneconcentraties te beoordelen.
- Het monitoren van het gedrag van vislarven tijdens licht- en donkercycli.
Belangrijkste resultaten
- Cafeïne veranderde de fotomotorische reacties bij koppige elritsen bij lagere concentraties dan bij zebravisjes.
- Zebravisjes vertoonden een groter aantal beïnvloede fotomotorische eindpunten.
- Beide soorten vertoonden een geremde activiteit over alle locomotorische eindpunten.
- Het tijdstip van de dag beïnvloedt het gedrag van larvale vissen significant.
Conclusies
- Het protocol biedt een kader voor het beoordelen van de gedragseffecten van chemicaliën.
- Methoden kunnen worden gestandaardiseerd voor andere chemicaliën om aanvullende vragen te onderzoeken.
- Deze aanpak vergroot het begrip van visgedrag in toxicologische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit protocol maakt snelle gedragsprofilering van vislarven mogelijk om de effecten van neuroactieve verbindingen te beoordelen, wat vroege-fase targetvalidatie in de neurofarmacologie ondersteunt. Door fotomotorische en locomotorische reacties te kwantificeren, biedt het mechanistische inzichten die helpen bij het verminderen van risico's van CNS-actieve verbindingen voorafgaand aan testen bij zoogdieren. De vergelijkende gevoeligheid tussen zebravis en vetkopminnows biedt een translationeel voordeel voor soortspecifieke gedragsscreening in zowel milieu- als biomedische contexten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het meten van neurostimulant-geïnduceerde gedragsveranderingen in larvale vismodellen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via kwantificeerbare fotomotorische en locomotorische eindpunten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door het identificeren van verbindingen met significante gedragseffecten bij milieurelevante concentraties.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarzetten van de assay: Bereidt gevalideerde gedragsassays voor voor downstream compound-screening met behulp van geautomatiseerde tracking.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare locomotorische en fotomotorische gegevens over snelheidsdrempels voor hit-bevestiging.
- Reproduceerbaarheid: Standardiseert licht/donker-cyclusprotocollen om consistente gedragsmetingen over experimenten heen te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Modelleert neurofarmacologische responsen die relevant zijn voor de target-interactie bij aandoeningen van het centrale zenuwstelsel.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen gedrags-ecotoxicologie en biomedische screening via geconserveerde gedragseindpunten.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door soortspecifieke verschillen in gevoeligheid voor responsen op neuroactieve verbindingen te belichten.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows en ondersteunt hypothesetoetsing en lead-identificatie via gedragsfenotypering van larvale vissen die zijn blootgesteld aan neuroactieve verbindingen.
- Discovery Biology: Faciliteert de verduidelijking van pathways door blootstelling aan verbindingen te koppelen aan veranderd fotomotorisch en locomotorisch gedrag.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare gedragsmetingen voor het vergelijken van effecten van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve bewegingsdrempels en metrieken voor de fotomotorische respons voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt gedrags-ecotoxicologie met preklinische neurofarmacologie via geconserveerde gedragsassays.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor gedragsprofielering dat toepasbaar is op diverse chemische bibliotheken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit bij de screening van neuroactieve verbindingen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van gedragstesten over verschillende soorten en laboratoria heen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van CNS-actieve verbindingen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering op basis van kwantitatieve drempelwaarden voor gedragseffecten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de husbanderie van vislarven en het bedienen van software voor gedragsregistratie.
- Afhankelijk van geautomatiseerde videotracking-systemen en gecontroleerde omgevingsincubatoren.
- Vereist standaardisatie tussen teams van blootstellingsprotocollen en definities van gedragsmatige eindpunten.
- Moet rekening houden met diurnale gedragsvariabiliteit bij het plannen van assays.
- Beperkt tot gedragsmatige eindpunten; vervangt geen mechanische of moleculaire targetvalidatie.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
1:46
Exposing Fish to Chemical Treatment
2:53
Calibration of Video-tracking Parameters
5:56
Observation of Larval Fish Locomotor and Photomotor Behavior
7:00
Results: Caffeine Significantly Alters Zebrafish and Fathead Minnow Behavior
7:43
Conclusion
