Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie. Zoals het bepalen hoe monocyten subset verhoudingen, of expressie van verschillende markers, worden gewijzigd in ziektetoestanden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, is dat de cellen dicht bij hun oorspronkelijke staat, en dat duidelijke instructies en rechtvaardiging worden gebruikt, om een gestandaardiseerde gating methode te bieden.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn bij deze methode worstelen, omdat veel documenten geen duidelijke instructies geven over hoe gating van de cellen werd uitgevoerd. Begin dit protocol met het verzamelen van bloedmonsters en bepaling van het aantal witte bloedcellen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun het bloed met fosfaatgebufferde zoutoplossing, om de concentratie aan te passen aan ongeveer 5 miljoen witte bloedcellen per milliliter.

Bereid voldoende master mix voor het aantal buizen door het combineren van bloed, anti CD14-V450, anti CD16-APC en anti HLA-DR-PerCP. Vortex en pipet 51.9 microliter van mix in elke buis. Voeg PE gelabeld M1 en M2 marker antilichamen, evenals markers voor T-cellen, B-cellen, neutrofielen, en natuurlijke killer cellen aan hun overeenkomstige buizen.

Vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Voeg nu 250 microliters gecombineerde rode bloedcellyse en witte bloedcelbindingsoplossing toe, en onmiddellijk het mengsel, voorzichtig. Broed het vortexed mengsel gedurende 10 minuten in het donker, op vier graden celsius.

Voeg na 10 minuten 250 microliter PBS toe en draai de cellen op 260 g af, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant, en resuspend de cellen in 300 microliter van 1%formaldehyde. Bewaar de cellen op vier graden Celsius, beschermd tegen licht totdat de analyse wordt uitgevoerd.

Flow cytometrie moet worden gedaan binnen 48 uur na de voorbereiding van het monster. Controleer om te beginnen het stroomcytometerlogboek om ervoor te zorgen dat het personeel van de faciliteit kwaliteitscontroles heeft uitgevoerd. Om het flow cytometrieexperiment in te stellen, klikt u op nieuw experiment, gevolgd door een nieuw exemplaar en een nieuwe buis om buizen toe te voegen.

Selecteer bivariate-plots door op het pictogram te klikken en gebruik de vervolgkeuzemenu's om de toegangsparameters te selecteren. Zorg ervoor dat een CD16/CD14-plot en een plot met een detector naast de tijd worden opgenomen om de acquisitie te controleren. Plaats de buis en klik, verwerf.

Controleer de spanningsinstellingen van het instrument, zodat detectorsignalen niet van schaal zijn. Observeer cellen die in de monocytenpoort van de CD14/CD16-plot vallen. Stel de opnamedrempel in op 5.000 gebeurtenissen voor de klassieke monocytegate en klik op record.

Doorgaan met het opnemen van gegevens voor de resterende buizen. Nadat gegevens voor alle buizen zijn geregistreerd, exporteert u de stroomgegevens als fcs-bestanden voor analyse. Als u monocyte gating wilt uitvoeren, opent u bestanden in de analysesoftware, dubbelklikt u op de buisnaam en selecteert u parameters in de vervolgkeuzemenu's om de cellen op een voorwaartsstredgebied te visualiseren versus de spreidingshoogteclot naar voren.

Maak een doublet exclusion gate door op het pictogram van het gereedschap veelhoekpoort te klikken en de cellen in te sluiten. Selecteer de gated cellen door te dubbelklikken op het gated gebied. Pas in het nieuwe weergavevak de vervolgkeuzemenuparameters aan om de cellen weer te geven op een forward scattergebied versus side scatter area plot.

Klik op het rechthoekige poortpictogram en selecteer royaal de monocytenpopulatie, op basis van voorwaartse en zijverstrooiende eigenschappen, om de meerderheid van de lymfocyten, natuurlijke killercellen en granulocyten uit te sluiten. Selecteer de gated cells en redisplay op een CD14/CD16 plot en selecteer de parameters met behulp van de vervolgkeuzemenu's. Klik op de veelhoekpoort om monocyten te selecteren op basis van hun karakteristieke, omgekeerde l-vorm.

Als de niet-klassieke populatie zich niet onderscheidt van de cellen links, dan is besmetting waarschijnlijk en moet worden onderzocht. Selecteer de gated cellen en geef de monocyten weer op een cd/16 HLA-DR plot, met behulp van de vervolgkeuzemenu's om parameters te selecteren. Klik op de veelhoekpoort om de HLA-DR-positieve cellen te selecteren en eventuele resterende natuurlijke killercellen en neutrofielen uit te sluiten.

Selecteer de gated cellen en geef de HLA-DR positieve cellen weer op een CD14/HLA-DR plot met behulp van vervolgkeuzemenu's om parameters te selecteren. Klik op de veelhoekpoort en teken een poort om de HLA-DR high/CD14 lage B-cellen uit te sluiten. Selecteer de gated cellen en gebruik de vervolgkeuzemenu's om ze weer te geven op een CD16/CD14 plot.

Selecteer uit plotopties zebraplot, waarmee monocyten subsetpoorten kunnen worden getekend, om subsetverhoudingen te bepalen. Klik nu op het rechthoekige poortpictogram en selecteer de klassieke monocyten door een rechthoekige poort rond de CD14 high/CD16 low classical monocyte populatie te tekenen. Selecteer onder weergave, toon mediaanen om de mediane fluorescentieintensiteit voor klassieke monocyten weer te geven.

Pas de poort zodanig aan dat de populatie een gelijke verdeling heeft van de mediaan links en rechts, en alle cellen links omvat. Selecteer de tussenliggende populatie door een rechthoekige poort te tekenen die de cellen rechts van de klassieke poort omvat. Pas de onderkant van de poort aan om de niet-klassieke cellen uit te sluiten, door de poort uit te lijnen met de onderkant van de concentrische cirkels, die zich volledig binnen de klassieke monocytenpoort bevinden.

Bekig de niet-klassieke subset door een rechthoekig vak naar beneden te tekenen vanaf de onderste rand van de tussenliggende subset en selecteer alle cellen naar de onderkant van de populatie. Selecteer onder weergave de poortfrequenties om het percentage van elke monocytensubset te bepalen. Selecteer ten slotte cellen uit elke monocytenubset.

Wijzig de vervolgkeuzeparameters om een histogram te maken voor elke monocytenubset, waarbij elke markering wordt weergegeven. Bereken vervolgens de mate van expressie, met behulp van mediaan of geometrisch gemiddelde, zoals beschreven in het tekstprotocol. Met succes gated monocyte populaties worden hier getoond.

En de verhoudingen zijn in lijn met die in de literatuur. De verhoudingen voor deze steekproef werden berekend als 88,1%klassiek, 4,33% tussenproducten en 7,49% niet-klassiek. Door de relatieve positie van andere populaties te beoordelen, is het duidelijk dat de T-cellen en neutrofielen die hier in het blauw worden weergegeven, ver buiten de monocyt, omgekeerde l-vorm, volgen op een CD16/CD14-plot.

Echter, zowel de natuurlijke killer cellen en B-cel populaties, hier weergegeven in het blauw, overlapten met de niet-klassieke monocyten populatie. Warmtekaarten die bevestigen dat vervuilende celtypen zijn verwijderd, worden hier weergegeven. De natuurlijke killer cellen zijn omheind door de HLA-DR CD16 stap, terwijl, de B-cellen zijn omheind door de HLA-DR CD/14 stap.

De expressie van M1- en M2-markeringen in het blauw, ten opzichte van hun isotypebesturingselementen in het rood, wordt hier weergegeven. CD120b een M1 marker, toont een duidelijke verschuiving boven het isotype controle, voor alle monocyte subsets. Dit is ook het geval voor CD93 een M2 marker, met expressie hoger in klassiek, matig op intermediates en laag op niet-klassiek.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen vervuilende cellen worden omheind, omdat ze anders kunnen bijdragen aan gekwantificeerde expressie. Na deze procedure kunnen andere merkers worden onderzocht. Om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe monocyte marker expressie verandert in ziekte.

Vergeet niet dat het werken met menselijk bloed en formaldehyde gevaarlijk kan zijn, en dus voorzorgsmaatregelen zoals, persoonlijke beschermingsmiddelen, en het gebruik van een biohazard kap, moet altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.