Name: Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie van retinale arteriolen uit ratten voor elektrofysiologische en calciumbeeldvormingsstudies. Deze methode helpt onderzoekers bloedstroomregulatie in het netvlies te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ontwikkeling van de protocollen die zijn beschreven in dit document werd gesteund door subsidies van de volgende financieringsinstanties: BBSRC (BB/I026359/1), de strijd voor zicht (1429 en 1822), de Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), Britse Hartstichting (PG/11/94/29169), HSC R & D divisie (STL/4748/13) en MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr. Joanna Kur is nu een vaste medewerker van Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, USA), haar huidige werk niet in strijd met die hier gepresenteerd.

De hierboven beschreven protocollen vereisen praktijk maar moeten haalbaar met minimale probleemoplossing. Op een gemiddelde dag wij 6-8 bruikbaar arteriolen te verkrijgen van de isolatie en bereiken van 3-4 succesvolle experimenten. Als u problemen ondervindt, echter zijn er enkele stappen die kunnen worden genomen ter verbetering van de slagingspercentages. Af en toe hebben we gevonden, met name bij het gebruik van jongere ratten (< 8 weken), dat de opbrengst van de arteriolen laag kan zijn. Om te omzeilen van dit probleem, raden we de retinale weefsel (10-30-s 500 x g) tussen elk van de verpulvering centrifugeren stappen in stappen 1.12-1.14. Dit helpt bij het verbeteren van het rendement van schepen vaak maar zal ook de verhoging van het bedrag van cel puin binnen de voorbereiding.
Wanneer vaartuigen voor druk myography studies cannulating is het belangrijk om te controleren de arteriolen zorgvuldig voor elke zij-takken die kunnen hebben al cleaved dicht bij de bifurcatie site. Dit is een veelvoorkomende oorzaak van lekkage en verlies van druk tijdens experimenten. Het belangrijkste probleem dat kan ontstaan met de [Ca2 +]ik protocollen is de hoeveelheid kleurstof laden. Slechte kleurstof laden leidt tot lage signal-to-noise ratio's, terwijl de overbelasting leidt tot verstoring van de normale Ca2 + homeostase. Verklein de kans op een van deze punten en een kleine hoeveelheid retinale homogenaat kan worden verwijderd, en geïsoleerde schepen gecontroleerd periodiek tijdens het laden-protocol. Wanneer de onderneming patch-clamp experimenten, het slagingspercentage van gigaseal formatie is sterk afhankelijk van hoe goed heeft de basale lamina zijn verteerd. Wanneer in eerste instantie testen dit protocol of met behulp van nieuwe veel enzymen het kan nodig zijn om de concentratie/duur van enzym spijsvertering. Zorgvuldig toezicht op de scheiding van de lagen endotheel en glad spierweefsel zorgt voor voldoende spijsvertering om genoeg basale laminaal om toegang te krijgen. Zorgvuldige controle is ook noodzakelijk om te voorkomen dat overmatig spijsvertering, die zich manifesteren kan als het schip begint te vernauwen. Als dit gebeurt, zijn de zachte spiercellen vaak te kwetsbaar voor patch klem opname. Bij toepassing van enzymen, is het belangrijk om op te nemen DNAse ik om verwijdering van strengen van DNA bevrijd uit cellen beschadigd tijdens het isolement. DNA-fragmenten zijn kleverig en veroorzaken de verlostang te houden aan de arteriole tijdens de laatste stadia van het reinigingsproces (stap 4.4), vaak resulterend in het verlies van het vaartuig. Reiniging van vaartuigen is technisch moeilijk en wordt best uitgevoerd bij hoge vergroting (20 X) met zachte vegende bewegingen van de gesloten tang van de fijnste mogelijk tip diameter. Reinig de verlostang met lab roll tussen veegt.
Als gemarkeerde eerder, was een belangrijke motivatie achter de ontwikkeling van de protocollen die worden beschreven in dit manuscript om beter te begrijpen waarom de bloedtoevoer wordt verstoord tijdens retinale vasculaire ziekten. Meeste van ons werk tot op heden heeft gericht op diabetische oog ziekte28,33. Arteriolen kunnen worden geïsoleerd uit het netvlies van experimentele knaagdier modellen van diabetes met behulp van de methoden die worden beschreven in sectie 1. Wanneer experimenteren op geïsoleerde retinale arteriolen van diabetische dieren, is het belangrijk om te proberen om te repliceren nauw de hyperglycemic voorwaarden ervaren door de schepen in vivo. Om deze reden verhogen we normaal gesproken zou de D-glucose niveaus in onze isolatie en experimentele oplossingen tot 25 mM. Verdikking van vasculaire kelder membranen is een goed erkende fenomeen in netvlies schepen tijdens diabetes34,35. Bij het gebruik van dieren met langdurige diabetes (> 1 maanden ziekte duur), zijn de concentratie van de verhoogde enzym of spijsvertering maal vaak nodig om de toepassing van de patch-clamp opname methoden.
Een belangrijke beperking van het gebruik van ex vivo geïsoleerd retinale arteriolen studie retinale vasculaire fysiologie en pathofysiologie is het verlies van de omliggende retinale neuropile. Hoewel verwijdering van de retinale gliale en neuronale cellen gemakkelijk toegang tot de retinale vasculaire zachte spiercellen voor cel fysiologie studies kunt, kan de reactie van de schepen op vasoactieve mediatoren drastisch veranderen in de afwezigheid en aanwezigheid van retinale weefsel. De acties van adenosine tri-fosfaat (ATP), bijvoorbeeld, bieden een goede illustratie van dit punt. In geïsoleerde rat retinale arteriolen, toevoeging van ATP triggers een robuuste vernauwing van de vaartuigen36, terwijl in de aanwezigheid van een intact neuropile, de bloedvaten verwijden37. Dus, waar mogelijk, wij gewoonlijk proberen te valideren van de belangrijkste bevindingen van onze voorbereidingen van de geïsoleerde arteriole met ex vivo retinale geheel-mounts en in vivo metingen van schip diameter en bloed stroom16,37 . Van de nota, nieuwe methoden opgedoken onlangs voor het bestuderen van kleine arteriolen en haarvaten in de hele geperfundeerd varkens netvlies ex vivo38,39. Dergelijke preparaten zijn waarschijnlijk aanzienlijk verbeteren ons begrip van hoe de retinale neuropile retinale arteriolar en capillaire Toon regelt en hoe veranderingen in netvlies hemodynamiek moduleren Neuronale activiteit in het netvlies.
Hoewel de in dit artikel beschreven procedures zijn gericht op het gebruik van geïsoleerde rat retinale arteriolen voor begrip arteriolar gladde spieren celfysiologie, ontwikkelen wij momenteel protocollen zodat ook de studie van de functie van het endotheel cel in deze schepen. Bij voorbereidende werkzaamheden, zijn wij erin geslaagd zijn in het aanpassen van de enzymatische vertering van retinale arteriolar segmenten levensvatbare endotheliale cellen buizen die zijn vatbaar voor Ca2 + beeldvorming en patchclamp studies opname opleveren. Cannulation van de geïsoleerde arteriolen aan beide uiteinden, om intraluminale levering van drugs, kan in de toekomst ook inschakelen endotheel-afhankelijke vasodilatory reacties op deze schepen worden onderzocht.

Begrijpen hoe de bloedstroom wordt gecontroleerd in het netvlies is een belangrijk doel, aangezien abnormale bloedstroom heeft betrokken bij de pathogenese van een verscheidenheid van zicht-bedreigende retinale ziekten1,2,3, 4. Het netvlies omloop, die de innerlijke retinale zenuwcellen en gliacellen levert, heeft een einde slagader regeling, met al het bloed van de retinale slagaders en de arteriolen doorgeven via de haarvaten aan het netvlies venules en tenslotte de aderen5. Doorbloeding in het netvlies wordt gereguleerd door de Toon van de retinale slagaders en arteriolen evenals de contractiele activiteit van de pericytes gelegen op de muren van de retinale haarvaten en post capillaire venules6,7, 8. de controle van retinale vasculaire Toon is complex en is door een aantal ingangen van de bloedsomloop en de omringende retinale weefsel, met inbegrip van bloed gassen, circulerende moleculen en hormonen, gemoduleerd en vasoactieve stoffen vrijkomen uit de netvlies vasculaire endotheel en macroglia9,10,11. Het netvlies arteriolen zijn de kleine arteriële takken van het netvlies en zijn samengesteld uit een enkele laag van vasculaire zachte spiercellen en een binnenvoering van lengterichting gerangschikt endotheliale cellen12,13, 14. deze schepen vormen de hoofdsite van de vasculaire weerstand binnen het netvlies verkeer en daarom een belangrijke rol spelen in de lokale besturing van de retinale bloedstroom. Netvlies arteriolen regelen capillaire doorbloeding in het netvlies door leerstoornissen of hun luminal diameter, gemedieerd door veranderingen in vasculaire gladde spieren contractility10,15,16vernauwen. Inzicht in de moleculaire mechanismen via welke retinal arteriolen reguleren retinale perfusie vereist daarom preparaten waar de arteriolar zachte spiercellen kunnen worden benaderd en studeerde in omstandigheden zo dicht mogelijk bij fysiologische mogelijk.
Ex vivo preparaten van geïsoleerde retinale bloedvaten geven toegang tot de vasculaire zachte spiercellen, terwijl nog steeds hun functionaliteit en interconnectiviteit met de onderliggende endotheel behouden blijven. De meeste studies tot op heden met behulp van geïsoleerde vaartuigen hebben gericht op grote runderen of varkens arteriële schepen (60-150 µm). Deze kunnen gemonteerd worden in de handel verkrijgbare draad of myograph drukleidingen om farmacologische ondervraging van vasculaire glad spierweefsel cel contractiele mechanismen17,18. Dergelijke preparaten hebben sterk bijgedragen aan onze kennis van retinale vasculaire fysiologie onder normale omstandigheden. Enkele studies hebben gebruik gemaakt van netvlies arteriolen geïsoleerd van kleine laboratoriumdieren als hun kleinere diameter (~ 8-45 µm) voorkomt dat hun gebruik in conventionele myography systemen19,20,21,22. Een belangrijk voordeel is van het gebruik van vaartuigen van kleine laboratoriumdieren echter de brede beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde, transgene en netvlies ziekte modellen. Kleine proefdieren zijn ook meer vatbaar voor in vivo interventiestudies.
Hier beschrijven we eenvoudig protocollen bij het opsporen en cannulating van de retinale arteriolen rat voor druk myography experimenten. CA2 + beeldvorming en electrofysiologie protocollen met behulp van deze vaartuigen zijn ook gedetailleerd. Deze kunnen verder bieden inzicht in de regulering van vasculaire gladde spieren contractility en doorbloeding in de retina.

<table><tbody><tr><td>Bekers</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Gebogen schaar</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Weggeef plastic pipette/overdracht</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL is het beste, maar andere maten zijn acceptabel; verwijder tip om opening te vergroten</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Elk equivalent fijn pincet</td></tr><tr><td>Pasteurpipet</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Vuur gepolijst om wrijving te verminderen, maar niet genoeg om de punt te versmallen</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>Of enig gelijkwaardig 10cm product</td></tr><tr><td>Pipetdop</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Gezuiverd watervoorraad</td><td>Merek</td><td>Milli-Q Integral Water Purification System</td><td>Of enig gelijkwaardig systeem</td></tr><tr><td>Rondbodemproefbuis</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; elk gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Seratted pincet</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Eénzijdige messen</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Of enig buigzaam oppervlak&nbsp;</td></tr><tr><td>Proefbuisrek</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Druk myografie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-assige mechanische manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (of elk gelijkwaardig product)</td></tr><tr><td>3-weg kranen</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Luchttafel</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Clean Bench</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Analyse software&nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td><td>Gratis beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Analyse plugin</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Aangepaste plugin voor imageJ Vrij beschikbaar voor download</td></tr><tr><td>Cannulatiepipet glas</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Of elk gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Digitaal thermometer</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Maak 1 mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Elk equivalent fijn pincet</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Maak 1 mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Glasbodem opnamekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Helperpipet glas</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Inline verwarming</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Commerciële gelijkwaardige SH-27B Solution In-Line Heater van Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Inverteer microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Microelektrode puller</td><td>Sutter instruments</td><td>P97</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Olympus CX 31 microscoop</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter instruments</td><td>MP-285</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Multi-kanaals distributie manifold&nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Pipetvuller&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Spuit verwarmd en getrokken naar interne diameter van pipet</td></tr><tr><td>Pipethouder</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Zuigpomp</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Geconverteerde beluchtingspomp door het omkeren van de bel</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Of elk gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Wolfraamdraad</td><td>Advent</td><td>W558818</td><td>75&mu;m diameter</td></tr><tr><td>Tygon Buizen</td><td>VWR</td><td>diverse maten</td><td>Of elk gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>USB camera</td><td>&nbsp;Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Video capture software</td><td>Hypercam</td><td>version 2.28.01</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>x20 lens</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>x4 lens</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Patch clamping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-weg kranen</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>3-assige mechanische manipulator</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Luchttafel</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Clean Bench</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg dagelijks opgelost in 50 &mu;L van DMSO (soniceren om op te lossen)</td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200a</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Analoge digitale converter</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Collagenase Type 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>0.1mg/mL in LCH</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>Digitaal thermometer</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Of enig gelijkwaardig product</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Werkend voorraad 1 MU mL-1 (10 MU

isolatie van retinale arteriolen voor ex vivo cel fysiologie studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Het netvlies is een zeer metabolisch actief weefsel dat een aanzienlijke bloedtoevoer vereist. Het netvlies verkeer ondersteunt het innerlijke netvlies, terwijl de choroidal schepen de researchdieren leveren. Veranderingen in het netvlies perfusie bijdragen aan talrijke zicht-bedreigende aandoeningen, met inbegrip van diabetische retinopathie, glaucoom en tak van de retinale veneuze occlusie. Inzicht in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de controle van de bloedstroom door het netvlies en hoe deze worden gewijzigd tijdens oogbeschadigingen en/of ziekte kan leiden tot de vaststelling van nieuwe streefcijfers voor de behandeling van deze aandoeningen. Netvlies arteriolen zijn de belangrijkste weerstand schepen van het netvlies, en bijgevolg, spelen een sleutelrol bij de regulering van de retinale hemodynamica door veranderingen in de diameter van de luminal. In de afgelopen jaren hebben we methoden voor het isoleren van de arteriolen uit het netvlies rat die geschikt zijn voor een breed scala aan toepassingen waaronder cel fysiologie studies. Deze voorbereiding is al begonnen met het opleveren van nieuwe inzichten in hoe de bloedstroom wordt gecontroleerd in de retina en heeft ons toegestaan om te identificeren van enkele van de belangrijke veranderingen die zich tijdens oogbeschadigingen en/of ziekte voordoen. In dit artikel, we beschrijven van maatregelen voor de isolering van rat retinale arteriolen en protocollen voor hun gebruik in patch-clamp electrofysiologie, calcium imaging en druk myography studies. Deze schepen zijn ook vatbaar voor gebruik in PCR-, westelijke bevlekken en immunohistochemistry-gebaseerde studies.

Dit manuscript wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van de arteriolen uit het netvlies rat die kunnen worden gebruikt in elektrofysiologische, calcium beeldvorming en druk myography studies beschreven.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Begrijpen hoe de bloedstroom in het netvlies wordt geregeld is een belangrijk doel, omdat abnormale bloedstroom is geïmpliceerd in de ontwikkeling van een verscheidenheid aan zichtbedreigende retinale ziekten, zoals diabetische retinopathie, glaucoom en takslagaderverstoppingen. Retinale arteriolen spelen een sleutelrol in de regulering van de bloedstroom in het netvlies door het verwijden en vernauwen van hun luminale diameter, gemedieerd door veranderingen in de contractiliteit van de gladde spiercellen die deze bloedvaten omringen. Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van retinale perfusie vereist daarom preparaten waarbij retinale arteriolaire gladde spiercellen kunnen worden benaderd en bestudeerd in omstandigheden die zo dicht mogelijk bij fysiologisch liggen.In deze video demonstreren we een eenvoudig protocol voor de isolatie van arteriolen uit het rattennetvlies dat kan worden gebruikt in patch clamp, calcium beeldvorming en drukmyografie studies. De afgelopen jaren is deze voorbereiding gebruikt om meer inzicht te krijgen in de regulering van vasculaire gladde spiercontractiliteit en bloedstroom in het netvlies, zowel in gezondheid als in ziekte. Maak een oplossing van één liter met laag calciumgehalte met Hanks'of LCH, zoals weergegeven in de materiaaltafel.Assembleer de isolatieapparatuur vóór het verzamelen van weefsel. De glazen Pasteur pipet moet vuurgepolijst worden om de punt glad te maken, maar niet te versmalmen. Trim een plastic pipet tot een opening van ongeveer vijf tot zeven millimeter.Plaats de ogen op de dissectieschaal, ondergedompeld in LCH-oplossing. Gebruik een set pincetten om het oog aan de schaal te verankeren door de orbitale spieraanhechtingen of de oogzenuw vast te houden. Zorg ervoor dat het verankeringspunt zo dicht mogelijk bij de sclera is om het oog te stabiliseren.Snij met het mes door het hoornvlies langs de ora serrata en verwijder de lens door voorzichtig op de sclera te drukken met een pincet. Het kleine, ronde gebied dat we aan de achterkant van het oog in deze afbeelding zien is de oogzenuw. Snijd met het mes de oogkom symmetrisch door het optische schijfje.Gebruik gesloten pincetten om voorzichtig de netvliezen uit de twee helften van de oogkom te borstelen, waarbij u ervoor zorgt dat alle resterende aanhechtingen bij het optische schijfje worden verwijderd. Herhaal het proces met het tweede oog en breng de gedissecteerde netvliezen over in het reageerbuisje met behulp van de plastic pipet en een kleine druppel LCH-medium. Vul met de plastic pipet het reageerbuisje met LCH tot ongeveer vijf milliliter en laat de netvliezen naar de bodem van het buisje zakken.Was het weefsel ongeveer drie keer door ongeveer vier milliliter oplossing uit het buisje te verwijderen en vers LCH toe te voegen met behulp van de plastic pipet. Verwijder waar nodig overtollig weefsel. Was de binnenkant van de glazen Pasteur pipet met gepolijste punt met LCH om te voorkomen dat het weefsel aan de pipet kleeft.Gebruik dezelfde pipet om ongeveer vier milliliter oplossing uit het reageerbuisje te verwijderen en voeg ongeveer twee milliliter vers LCH toe. Dissocieer de netvliezen voorzichtig door het weefsel langzaam door de punt van de glazen pipet te trekken en de inhoud in het reageerbuisje uit te stoten. Probeer in dit stadium geen luchtbellen te introduceren en herhaal het proces tot de netvliezen zijn opgebroken tot ongeveer twee tot drie millimeter in het vierkant.Was de binnenkant van de pipet met ongeveer twee milliliter LCH en stoot dit uit in het reageerbuisje. Laat de inhoud vijf tot tien minuten naar de bodem zakken. Herhaal het tritureringsproces zoals eerder beschreven met iets meer kracht totdat de weefselstukken ongeveer een millimeter in het vierkant zijn.Laat het weefsel zakken en herhaal nog een keer met nog meer kracht totdat de inhoud volledig gehomogeniseerd is en er geen stukken netvlies meer over zijn. De oplossing in dit stadium zou er melkachtig uit moeten zien. Deze techniek zal tot acht arteriole segmenten per isolatie opleveren, meten van 200 tot 2.500 micrometer in lengte.Cannulatie van het ene uiteinde van de arteriole met occlusie van het tegenovergestelde uiteinde maakt de meting van door druk veroorzaakte vasoconstrictie mogelijk, ook bekend als de myogene respons. Arteriolariële drukmyografie wordt als volgt uitgevoerd. Een aliquot van retinale homogenaat wordt overgebracht naar een fysiologische opnamekamer gemonteerd op het podium van een omgekeerde microscoop.Laat het homogenaat minimaal vijf minuten op de bodem van de kamer zakken. Scan visueel door de opnamekamer om arteriolen te identificeren die groter zijn dan 200 micrometer in lengte en een open uiteinde hebben waardoor het vat kan worden cannuleerd. Anker een uiteinde van het vat neer met behulp van fijne pincetten en een kleine wolfraamdraadslip geplaatst over het vat.Gebruik de overlappende uiteinden van de wolfraamdraad om het vat zo te manoeuvreren dat het loopt over de bad, zodat het open uiteinde in lijn is met de drukcannula. Perfuseer de kamer met nul calcium Hanks'bij 37 graden Celsius. Cannulaties worden uitgevoerd met glazen pipetten.De cannula wordt op het open uiteinde van het vat geplaatst met behulp van een fijne micromanipulator. De punt wordt direct naast de opening geplaatst, zoals beoordeeld door het focusvlak van de microscoop aan te passen, zodat zowel het uiteinde van het vat als het cannulatuuiteinde tegelijkertijd in focus zijn en de drukcannula wordt geavanceerd in de vaatopening. Een hulppipet is vereist om te helpen bij het cannulatieprozes en wordt gebruikt om het arteriole zachtjes te beteugelen en de arteriole wand te begeleiden over de drukcannula op hetzelfde moment dat de cannula in het vatlumen wordt geavanceerd.Deze procedure vereist gelijktijdige, gecontroleerde beweging van beide manipulatoren en uitgebreide oefening om een hoge slagingsgraad te bereiken. Na een minuut opname bij nul

isolation-of-retinal-arterioles-for-ex-vivo-cell-physiology-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ex vivo ERG kan worden gebruikt om elektrische activiteit van retinale cellen rechtstreeks op te nemen van geïsoleerde intacte netvliezen van dieren of mensen. We demonstreren hier hoe gebruikelijke in vivo ERG-systemen kunnen worden aangepast voor ex vivo ERG-opnamen om de elektrische activiteit van retinale cellen te ontleden.

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

Veel visie-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten worden geassocieerd met disfunctionele retinale microvessels. De meting van de retinale arteriole reacties is daarom belangrijk om te onderzoeken van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor muis retinale arteriole isolatie en voorbereiding te beoordelen van de effecten van vasoactieve stoffen op vasculaire diameter.

Voorbereiding stappen voor meting van reactiviteit in muis retinale arteriolen Ex Vivo

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Het protocol beschrijft organotypische explants van het neuro-netvliesvan muizen , gekweekt samen met het retinale pigmentepitheel (RPE), in R16 gedefinieerd medium, vrij van serum en antibiotica. Deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren, goedkoper en tijdrovend in vergelijking met in vivo experimenten en kan worden aangepast aan tal van experimentele toepassingen.

Langdurige, serumvrije teelt van organotypische muis retina explants met intact retinale pigmentepitheel

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van muriene postnatale retinale endotheelcellen die zijn geoptimaliseerd voor celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Deze cellen zijn geschikt voor next-generation sequencing benaderingen.

Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Dit protocol presenteert en beschrijft stappen voor de isolatie, dissectie, kweek en kleuring van retinale explantaten verkregen van een volwassen muis. Deze methode is gunstig als een ex vivo model voor het bestuderen van verschillende retinale neurovasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie.

Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een ex vivo model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten

Er werd een beschermingstest ontwikkeld om de veerkracht van het netvlies tegen overlijden door diabetes/diabetische retinopathie-gerelateerde beledigingen zoals oxidatieve stress en cytokines te controleren.

Een test om bescherming van het netvlies te detecteren tegen diabetesgerelateerde sterfte bij muizen

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

Leer een protocol voor de isolatie van retinale arteriolen uit ratten voor elektrofysiologische en calciumbeeldvormingsstudies. Deze methode helpt onderzoekers bloedstroomregulatie in het netvlies te begrijpen.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Meer video's verkennen