Optisch biosensing

Opticale biosensoren zijn sensoren die een biologisch doelwit of doelwitten van belang detecteren met behulp van licht. Deze apparaten hebben toepassingen gevonden in de gezondheidszorg, de farmaceutische industrie, milieubewaking, Homeland Security en zelfs op het slagveld. Optische biosensoren worden grofweg onderverdeeld in label-gebaseerde en label-vrije sensoren. Een voorbeeld van label-gebaseerd detectie is Polymerase Kettingreactie, of PCR, dat gebruikmaakt van fluorescente labels, of fluoroforen, om het geamplificeerde doelwit DNA te kwantificeren. Een voorbeeld van een label-vrije methode is Surface Plasmon Resonance, of SPR. Hier wordt de interactie van de ongewijzigde biomoleculen met het sensoroppervlak gekwantificeerd door het meten van een fundamentele eigenschap van de sensor, zoals de hoek van reflectie. Deze video bespreekt de basisprincipes van beide typen optische biosensingtechnieken en de kritieke componenten, de werkingsprincipes en veelvoorkomende toepassingen van optische biosensoren.

Laten we eerst de algemene principes van label-gebaseerde optische biosensing bekijken. Typisch wordt een sonde of bioherkenningselement, zoals een complementaire antistof, op het sensoroppervlak bevestigd met behulp van traditionele immobilisatiechemie. De monsteroplossing wordt vervolgens over het sensoroppervlak gevoerd. Het doelmolecuul, dat complementair is aan het geïmmobiliseerde bioherkenningselement, wordt selectief gevangen uit de complexe monstersoplossing. Vervolgens wordt de overtollige monstersoplossing weggespoeld met buffer of water. Om de hoeveelheid gebonden doelwit te visualiseren en te kwantificeren, wordt een secundaire molecuul, dat complementair is aan het doelwit en gekoppeld is aan een fluorofoor, door het systeem geleid. Na enige tijd, wanneer de binding van de secundaire molecuul aan het doelwit is opgetreden, wordt de overtollige ongebonden fluorofoor weggespoeld. De intensiteit van de gebonden fluorofoor kan vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van een fluorescerende microscoop. Deze intensiteit wordt eerst geplot voor verschillende bekende doelconcentraties om een calibratiecurve te creëren, die vervolgens de directe meting van een onbekende hoeveelheid gevangen doelwit mogelijk maakt. Dus, label-gebaseerde technieken gebruiken de fluorescentie-intensiteit van uiterst gevoelige fluoroforen om de concentratie van de biomolecuul van belang te kwantificeren.

Nu we de principes van label-gebaseerde optische biosensoren hebben besproken, laten we een veel gebruikt voorbeeld bekijken, de huidige standaard voor DNA-amplificatie, Kwantitatieve PCR, of qPCR. De qPCR-reactiemix bevat een gelabelde sonde voor kwantificering van de reactie in real-time. De sondesequentie is bevestigd aan zowel fluorescente reporter- als quenchermoleculen en bindt aan een specifieke DNA-sequentie. Het quenchermolecuul dooft de emissie van de fluorofoor uit terwijl ze beide aan de sonde zijn bevestigd. Tijdens de PCR-reactie degradeert het polymerase-enzym de sonde-DNA en scheidt fysiek de fluorofoonreporter, waardoor quenching wordt voorkomen en resulterend in een toename van fluorescentie. Om qPCR uit te voeren, voegt u eerst alle componenten van de reactie, inclusief de gelabelde sondes, toe aan een PCR-buis of put. Plaats vervolgens de PCR-putjes in een gespecialiseerde thermocycler en voer de parameters voor elke cyclus en het aantal cycli in. De thermocycler die voor qPCR wordt gebruikt, bevat een lichtbron met de vereiste optische componenten om een golflengte te selecteren en een detector om de fluorescentie-intensiteit in real time tijdens de PCR-reactie te meten. Aan het einde van elke thermische cyclus wordt de fluorescentie-intensiteit vanwege de vrijgelaten Fluoroforen opgenomen en uitgezet. De fluorescentie-intensiteit is direct evenredig met het logaritme van de doelconcentratie in de reactieput, en dus, voor een bekende fluorescentie, kan de onbekende doelconcentratie worden berekend.

Laten we nu eens kijken hoe detectie kan worden bereikt zonder enige reporters, zoals fluoroforen, met behulp van label-vrije optische detectietechnieken. Voor label-vrije technieken is de immobilisatie van het bioherkenningselement hetzelfde als de label-gebaseerde techniek. Elke biomolecuulbevestiging op het oppervlak van deze sensoren wijzigt de brekingsindex in de onmiddellijke nabijheid van het optische apparaat. De doelmoleculen binden zich aan het oppervlak van het functionele optische apparaat en vormen een dunne laag en wijzigen verder de brekingsindex. Deze veranderingen in de brekingsindex kunnen worden gemonitord door de verandering in de natuurlijke trillingsfrequentie, of de resonantiefrequentie van het systeem, bij te houden. Het verschil in de resonantiefrequenties voor en na het doelbinden, genoemd de f-shift, is direct evenredig met de concentratie van het gevangen doelwit.

Laten we nu eens kijken naar de basisprincipes van een veel gebruikte label-vrije optische detectietechniek, Surface Plasmon Resonance, of SPR. Een typisch SPR-instrument combineert een beweegbare laserbron, een optische detector voor het meten van intensiteitsverschuiving en een sensorchip met een glazen prisma dat aan één kant met goud is bedekt. Het goudbedekte prisma is geïntegreerd met een vloeistofsysteem dat een doorstromende werking mogelijk maakt. In een experiment wordt de sondemolecuul, of bioherkenningselement, aan het goudoppervlak bevestigd. Het doelelement stroomt vervolgens over het oppervlak en bindt zich aan de geïmmobiliseerde sonde. Detectie maakt gebruik van het SPR-fenomeen. Dit gebeurt wanneer gepolariseerd licht op het oppervlak van metaal, zoals goud, wordt getoond onder een specifieke hoek, theta SPR. Dit resulteert in de generatie van oppervlakteplasmonen, die coherente elektronenoscillaties zijn die bestaan op het grensvlak van twee materialen met permittiviteiten van tegengestelde tekens. Wanneer de massa die aan het sensoroppervlak is bevestigd verandert, worden de resonantiecondities van de oppervlakteplasmonen veranderd. Bijgevolg, wanneer alleen het bioherkenningselement op het oppervlak is gebonden, wordt de straal op één hoek, theta een, gereflecteerd. Dan, wanneer meer massa aan het oppervlak