Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel
19 januari 2019
Acute inbeslagneming modellen zijn belangrijk voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epileptiform gebeurtenissen. Bovendien biedt de mogelijkheid om het genereren van epileptiform evenementen op afroep een zeer efficiënte methode om te bestuderen van de exacte volgorde van de gebeurtenissen ten grondslag liggen aan hun inleiding. Hier beschrijven we de acute 4-aminopyridine corticale inbeslagneming modellen gevestigd in muis en menselijk weefsel.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van aanvallenmechanismen, zoals, welke neurale subpopulaties verantwoordelijk zijn voor het begin en de beëindiging van de elektrografische aanval. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het elektrografische aanvallen kan reproduceren, op aanvraag, en in vivo en in vitro modellen die doen denken aan die klinisch waargenomen. Deze techniek kan ook worden gebruikt om te zoeken naar mogelijke anti-aanval therapieën, door te proberen om elektrografische aanvallen gebeurtenissen veroorzaken tijdens de toepassing van verschillende anti-aanval drug kandidaten.
Om de corticale plakjes voor te bereiden, lijm het preklinische hersenweefsel op het Vibratome-stadium, met behulp van instant lijm. Plaats de speciminhouder voorzichtig in de bufferlade. Zorg ervoor dat het dorsale gedeelte van de hersenen wordt geconfronteerd met het mes van de Vibratome.
Snijd de hersenen in 450 micrometer dikke secties, in de rug naar ventrale richting. Maak de eerste snede in de preklinische dierlijke hersenen om de olfactorische bol te verwijderen. Maak vervolgens latere bezuinigingen totdat het somatosensorische motorgebied wordt waargenomen.
Gebruik een brede boring pipet. Breng de beoogde coronale plakjes naar een Petrie-schaal met koude dissectieoplossing. Voor de coronale plakjes, maak een dwarse snede net onder de neo corticale commissure, en vervolgens gesneden op de middellijn om de hemisferen te scheiden.
Gebruik vervolgens een nieuw scheermesje om overtollig weefsel van de plakjes af te snijden. Het is van cruciaal belang om de hersensnijprocedure efficiënt uit te voeren. Elk moment dat het hersenweefsel niet wordt ondergedompeld in ACSF, is schadelijk voor de kwaliteit ervan.
Beschadigde, slechte kwaliteit hersenweefsel is minder kans op elektrografische aanvallen gebeurtenissen te genereren. Breng het dorsale gedeelte van de coronale plakjes, die de neo-cortex bevatten, voor een moment over naar een tweede Petrie-schaal gevuld met 35 graden Celsius ACSF. Breng vervolgens de plakjes onmiddellijk over naar een incubatiekamer, met 35 graden Celsius carbogenated ACSF.
Laat de hersenen plakjes iets ondergedompeld in de incubatiekamer op 35 graden Celsius gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens de incubatiekamer uit het waterbad en laat deze terugkeren naar kamertemperatuur. Wacht een uur tot de hersenen plakjes te herstellen, voordat het uitvoeren van elektrofysiologische opnames.
In deze procedure, uitgesneden lens papier dat is iets groter dan de hersenen slice. Gebruik een brede pipet of een detaillering borstel om een hersenen slice over te dragen op de uitgesneden lens papier dat op zijn plaats wordt gehouden met behulp van een tandcezer. Breng vervolgens het lenspapier met een hersenschijf naar de opnamekamer en zet het in positie met een harpscherm.
Vervolgens, overvloedig de hersenen slice in de opnamekamer met carbogenated ACSF op 35 graden Celsius met een snelheid van drie milliliter per minuut. Gebruik een digitale thermometer om ervoor te zorgen dat de opnamekamer 33 tot 36 graden Celsius is. Vul vervolgens de glazen elektroden met 10 microliters van ACSF, met behulp van een Hamilton spuit.
Onder de 20 keer stereomicroscoop, begeleiden de opname glas elektrode in de oppervlakkige corticale laag, twee, drie, met behulp van handmatige manipulatoren. Bekijk de elektrische activiteit van de hersenen slice met standaard software. Om elektrografische epileptische aanvallen-achtige activiteiten te induceren, overvloedig de hersenen slice met ACSF met 4-AP op 100 micromolar.
Bekijk de elektrische activiteit van de hersenen slice met standaard software. Voor het genereren van elektrografische aanval-achtige gebeurtenissen, met behulp van optogenetische strategie op de hersenen plakjes van optogenetische muizen, gebruik maken van een handmatige manipulator om een 1,000 micron snoer diameter optische vezel direct boven de opname regio positie. Breng een korte puls blauw licht aan om een ictal event te starten.
Een gebruiksvriendelijk MATLAB gebaseerd programma werd speciaal ontwikkeld om de verschillende soorten epileptiforme gebeurtenissen die optreden in de in vitro en in vivo 4-AP aanval modellen te detecteren en te classificeren. Dit detectieprogramma is beschikbaar in de Valiante Labs GitHub repository. De toepassing van 100 micromolar 4-AP op goede kwaliteit 450 micron-sized corticale hersenen plakjes van een jonge VGAT channelrhodopsine muis, betrouwbaar geïnduceerde terugkerende ictal-achtige gebeurtenissen binnen 15 minuten.
De toepassing van 100 micromolar 4-AP op plakjes van slechte kwaliteit, resulteerde in barstende gebeurtenissen of stekelige activiteit. Gemiddeld 40% van de plakjes van elk ontleed preklinisch brein, genereerde met succes ictal-achtige gebeurtenissen. Bovendien resulteerde 83% van de ontleedmuizen in ten minste één hersenschijf dat ictal-achtige gebeurtenissen succesvol genereerde.
In hersenschijfjes met spontaan voorkomende ictal-achtige gebeurtenissen, de toepassing van een korte lichtpuls van 30 milliseconden op de hersenschijf, betrouwbaar geactiveerd een ictal-achtige gebeurtenis die identiek was in morfologie. Dezelfde bevindingen werden gedaan in de hersenen plakjes van Thy een Channelrhodopsin twee muizen. Dus, ongeacht welke neuronale subpopulatie werd geactiveerd, elke korte synchronisatie gebeurtenis in de geïsoleerde corticale neurale netwerk, leidde tot het begin van een ictal-achtige gebeurtenis.
Deze ictal-achtige gebeurtenissen bestonden uit een sentinel spike, tonic-achtige vuren, kloniek-achtige vuren, en burst-achtige activiteit tegen het einde. Ze waren vergelijkbaar met de elektrografische handtekeningen in verband met klinische aanvallen. Na deze procedure, andere vormen van hersentoestand overgangen kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden, zoals, wat zijn de neuro biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de hersenen staat overgangen?
En hoe kunnen we deze overgangen reguleren om toegang tot verschillende pathologische hersentoestanden te voorkomen?
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het gebruik van acute epileptische modellen, specifiek met behulp van 4-aminopyridine, om de mechanismen van epileptiforme activiteit in zowel muizen- als menselijke corticale weefsels te onderzoeken. De mogelijkheid om op verzoek elektrographische epileptische events op te wekken, maakt een gedetailleerd onderzoek mogelijk van het neuronale gedrag dat geassocieerd is met het begin en het einde van een aanval.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Epilepsieonderzoek
Achtergrond
- Het begrijpen van de onderliggende mechanismen van epileptische aanvallen is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve behandelingen.
- Acute aanvalsmodellen maken real-time observatie van de dynamiek van aanvallen mogelijk.
- Elektrofyziologische registraties bieden inzicht in de initiatie en propagatie van aanvallen.
- De techniek heeft potentiële toepassingen bij het testen van anti-epileptica.
Doel van de studie
- Om neurale subpopulaties te verkennen die verantwoordelijk zijn voor het begin en het beëindigen van epileptische aanvallen.
- Om de effectiviteit van potentiële therapieën tegen epileptische aanvallen op een gecontroleerde manier te beoordelen.
- Om de karakterisering van ictale-achtige gebeurtenissen in corticale hersensneden te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- In dit onderzoek zijn acute corticale hersenseneden gebruikt, bereid uit muizen- en menselijke weefsels.
- Er zijn elektrofysiologische opnames uitgevoerd om epileptische activiteit te meten die is geïnduceerd door 4-aminopyridine.
- Er zijn gedetailleerde snij- en incubatieprotocollen toegepast om de levensvatbaarheid van het weefsel te waarborgen.
- Optogenetische strategieën zijn geïntegreerd om ictale events uit te lokken via nauwkeurige lichtstimulatie.
- Er is software op basis van MATLAB ontwikkeld voor het detecteren en classificeren van epileptiforme events.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol induceerde betrouwbaar insult-achtige gebeurtenissen in hoogwaardige hersensecties binnen 15 minuten na toediening van 4-AP.
- Er werd vastgesteld dat 40% van de secties succesvol deze gebeurtenissen genereerde, wat duidt op een effectieve weefselpreparatie.
- De responsen omvatten een kenmerkende sentinel spike en diverse ontladingsfasen die wijzen op epileptische activiteit.
- Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in verschillende muismodellen, wat de robuustheid van de techniek onderstreept.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een betrouwbare methode voor het induceren en bestuderen van elektrografische aanvallen, wat inzicht biedt in de neuronale mechanismen die betrokken zijn bij epilepsie.
- De bevindingen ondersteunen het onderzoek naar aanvalsdynamiek in vivo en in vitro.
- Het begrijpen van deze mechanismen kan leiden tot betere behandelstrategieën voor epilepsie en andere aanverwante stoornissen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
On-demand inductie van elektrographische epileptische aanvallen in acute corticale modellen maakt een nauwkeurige analyse mogelijk van de neuronale mechanismen die ten grondslag liggen aan het begin en het einde van een aanval. Deze mogelijkheid ondersteunt target-validatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van geneesmiddelen tegen epilepsie door een reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling mogelijk te maken van de effecten van anti-epileptische verbindingen op gedefinieerde elektrofysiologische fenotypes. De translationele relevantie wordt versterkt door de toepasbaarheid op zowel knaagdier- als menselijk weefsel, wat de cross-species validatie van therapeutische hypothesen faciliteert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om specifieke neurale subpopulaties die verantwoordelijk zijn voor het begin en het einde van electrografische insulten te onderzoeken via optogenetische of farmacologische triggeren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform om te beoordelen of het moduleren van specifieke neuronale paden insult-achtige gebeurtenissen voorkomt of modificeert, wat het testen van doelhypotheses ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare elektrografische epileptische events met een gedefinieerde morfologie (sentinel spike, tonisch-clonische ontladingen, burst-activiteit) die geschikt zijn voor high-content screening.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde inductie van ictal events mogelijk via 4-AP, optogenetische pulsen of neurotransmitter-puffs, waardoor consistent onderzoek naar verbindingen over verschillende laboratoria heen mogelijk is.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de evaluatie van kandidaten voor anti-epileptica door hun effect op de frequentie, duur of elektrografische kenmerken van epileptische aanvallen tijdens inductie op aanvraag te meten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van menselijk corticaal weefsel om klinisch relevante insult-achtige events te genereren, waardoor het voorspellend vertrouwen in therapeutische effectiviteit wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van acute screening naar chronische epilepsiemodellen door te valideren dat geïnduceerde events klinische elektrografische kenmerken repliceren.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door specifieke neuronale manipulaties te koppelen aan veranderingen in de dynamiek van insulten, wat bijdraagt aan de selectie van targets voor preklinische vooruitgang.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een fysiologisch relevante assay te bieden voor targetvalidatie en compound-screening voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van neuronale mechanismen die ten grond liggen aan het begin van aanvallen via precieze, on-demand inductie van ictale events in corticale netwerken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve elektrofysiologische readouts (eventfrequentie, morfologie, duur) die essentieel zijn voor assay-standaardisatie en de vergelijking van verbindingen.
- Analytics: Maakt detectie en classificatie van epileptiforme events mogelijk via MATLAB-gebaseerde software, waardoor objectieve metrieken beschikbaar komen voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de aanvalsdynamiek.
- Translationeel Onderzoek: Maakt gebruik van menselijk weefsel om ziekte-relevantie te waarborgen, waardoor ontdekkingen worden overbrugd naar preklinisch en klinisch epilepsieonderzoek.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar platform voor het evalueren van diverse anti-aanvalmechanismen over meerdere projecten en therapeutische modaliteiten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door ambiguïteit in neuronale mechanismen van convulsiegeneratie en -propagatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbeterde reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van convulsie-inductie in weefselpreparaten van knaagdieren en mensen, ter ondersteuning van multisite screeningcampagnes.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door snelle, kwantitatieve beoordeling van de effecten van anti-convulsieve verbindingen op gedefinieerde elektrofysiologische eindpunten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van hun vermogen om ictale-achtige events te onderdrukken of te modificeren in klinisch relevante modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, weefselsnijden en optogenetische of farmacologische technieken voor het induceren van toevallen.
- Afhankelijk van instrumentatie voor elektrofysiologische registratie, precieze vloeistofperfusie (bijv. 4-AP, ACSF) en optische stimulatie (voor optogenetische triggering).
- Noodzaak van gestandaardiseerde protocollen voor weefselpreparatie om de levensvatbaarheid van de coupes en een consistente generatie van ICTAL-gebeurtenissen te garanderen, aangezien de weefselkwaliteit direct invloed heeft op de succespercentages.
- Vereist aanpassing van inductieparameters (bijv. 4-AP-concentratie, lichtpulsduur, volume van neurotransmitter-puffs) bij vertaling tussen knaagdier- en menselijke weefselmodellen.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in de kwaliteit van de coupes en de noodzaak van vaardige hantering om de weefselgezondheid tijdens preparatie en registratie te behouden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
