Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Deze methode kan worden gebruikt om een belangrijke vraag op het gebied van somatosensatie aan te pakken, het mechanisme waardoor een dier, zoals drosophila melanogaster, zijn favoriete omgevingstemperatuur selecteert. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de voorkeurstemperatuur van de groep larven in een enkele test kan vaststellen wanneer deze wordt geconfronteerd met een continu temperatuurbereik. Naast het verschaffen van inzicht in de temperatuursvoorkeuren van drosophila-larven, kan de impress plate ook worden aangepast voor gebruik met andere modelorganismen zoals de worm, C elegans.

Maak eerst gistpasta om flesjes voor een kruising voor te bereiden. Meng gistkorrels in gedistilleerd water en maal ze tot een pasta met een stamper. Voeg vervolgens een druppel gistpasta dicht bij de binnenwanden van standaard drosophila-flesjes net boven het oppervlak van het voedsel.

Om de larven te produceren, verzamel 12 tot 35 vrouwtjes en maximaal de helft zoveel mannetjes, maar niet meer dan 10 mannetjes. Combineer deze groepen in het flesje met gistpasta. Laad de voorbereide flesjes in een lade met 100 flesjes.

Voeg 20 open flesjes met water toe aan de lade om vocht te bieden. Sluit vervolgens de lade in een doorzichtige plastic zak en incubeer deze 48 uur op 25 graden Celsius. Na 48 uur voeren en paren, verplaats de vliegen naar nieuwe voedingsflesjes om eieren te verzamelen.

Draai ze om. Gebruik geen koolstofdioxide. Laat vervolgens de vliegen gedurende drie uur bij 25 graden Celsius eieren leggen.

Verwijder later de volwassenen en plaats de flesjes met de eieren terug in de lade met waterflesjes en sluit de zak. Ontwikkel vervolgens de eieren bij 25 graden Celsius tot het gewenste larvale stadium. Om een enkelrichtingsgradiënt voor te bereiden, creëer eerst een menselijke omgeving voor de test.

Plaats twee aluminium blokken verbonden met afzonderlijke waterbaden op natte papieren handdoeken, 10 centimeter uit elkaar. De waterbaden moeten van tevoren worden opgewarmd. Maak vervolgens 100 milliliter 1% agarose en voeg 25 milliliter toe aan elke testplaat op een vlak oppervlak.

Zodra de agarose is gestold, wrijf voorzichtig met een melamine spons over het oppervlak om het oppervlak licht ruw te maken. Vul vervolgens eventuele openingen tussen de aluminium blokken in de testplaten met water uit een spuitfles om een efficiënte temperatuuroverdracht te bevorderen. Plaats nu de testplaten op de aluminium blokken en zorg ervoor dat de afbakening twee centimeter van beide randen is om exact overeen te komen met de randen van de aluminium blokken.

Spray vervolgens een laagje water op het oppervlak van de platen zodat de gels niet uitdrogen. Bedek vervolgens het systeem met een kartonnen doos om verdamping te verminderen en de temperatuur van het geloppervlak te stabiliseren. Wacht vijf tot 10 minuten om de temperatuur te laten stabiliseren.

Controleer vervolgens de oppervlaktetemperatuur op de plaat op minstens 12 locaties om ervoor te zorgen dat er overal een gelijkmatige temperatuur is, plus of min twee graden Celsius. Vervang vervolgens het doosdeksel totdat de test wordt uitgevoerd. Om schone larven te isoleren, voeg eerst ongeveer 40 milliliter 18% sucrose-oplossing toe aan een 50 milliliter testbuis.

Breng vervolgens larven van de voedselhopen over in de oplossing met behulp van een spatel. Meng vervolgens de larven grondig door de oplossing met de spatel. Wacht nu 30 tot 60 seconden totdat de larven naar de bovenste laag van de buis stijgen.

Giet vervolgens de oplossing met larven af in een andere 50 milliliter buis en vul deze aan met vers 18% sucrose. Wacht opnieuw tot de larven omhoog drijven. De aanwezigheid van voedsel kan de resultaten beïnvloeden.

Daarom is het belangrijk om de larven grondig schoon te maken om besmetting met voedsel te minimaliseren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Doe dit voorzichtig om schade aan de larven te voorkomen. Plaats vervolgens een 300 micron celzeef bovenop een 50 milliliter buis en verwijder dode volwassen lichamen en drijvend puin van het oppervlak van de sucrose-oplossing.

Giet nu de larven door de zeef om ze op het gaasscherm te verzamelen. Loop vervolgens ongeveer 50 milliliter water twee keer door de zeef om de larven verder te reinigen. Spoel vervolgens de meeste larven van de zeef af op een lege 35 millimeter schotel met behulp van water.

Gebruik een penseel om de resterende larven op het gaas over te brengen. Sifon vervolgens het meeste water van de schotel af met behulp van een micropipet. Plaats vervolgens de deksel ondersteboven op de schotel zodat de larven niet kunnen ontsnappen.

Laat de larven nu 10 tot 20 minuten herstellen voordat u de test start. Verwijder eerst de kartonnen doos boven het gel en controleer snel de temperatuur van het geloppervlak. Als het oppervlak droog is, spuit dan een kleine hoeveelheid water op het oppervlak.

Als het gel goed is, laad dan 100 tot 200 larven in het midden van elke plaat, met behulp van een kleine penseel. Plaats vervolgens een deksel over elke testplaat om de larven te vangen en bedek de opstelling met een kartonnen doos om lichtblootstelling te voorkomen. De test is nu aan de gang.

Verwijder na 10 tot 30 minuten de kartonnen doos en het microplaatdeksel. Fotografeer vervolgens de platen van bovenaf om de positie van de larven vast te leggen. Plaats de doos boven de camera om reflectie op het oppervlak van het gel te voorkomen.

Om de plaat op te ruimen, aspireer alle larven waar ze zich ook mogen hebben verspreid. Bereken nu het percentageverdeling van larven in elke zone met behulp van software voor beeldanalyse. Maak lijnen om de twee centimeter, gebaseerd op de afbakening op de testplaat en tel het aantal larven in elke zone.

Negeer bij het tellen larven die zich in richels bevinden op 0,5 centimeter van elke rand, om