Name: Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer een temperatuurgradiënt-assay voor thermische voorkeur van Drosophila-larven. Deze methode gebruikt aluminium blokken en agaroseplaten om voorkeurstemperatuur te bepalen in somatosensatie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.M. wordt ondersteund door de financiering van de NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) en de NIAID (1DP1AI124453).

<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om het welslagen van dit protocol, is het belangrijk maatregelen te nemen voor het verkrijgen van voldoende aantal larven uit te voeren van de experimenten. Deze omvatten vooraf voeden de vliegen in gist plakken-bevattende flesjes voor 2-3 d te verbeteren met het leggen van eieren. De flesjes moeten worden geplaatst in een lade met flesjes water en ingesloten in een doorzichtige plastic zak, die houdt het vocht van het levensmiddel en bevordert effectief voeden door de larven terwijl blootstelling aan normale licht-donke...

Thermotaxis is werkzaam bij mobiele dieren te selecteren van een omgeving met de meest gunstige voorwaarden1,2,3. Als het klimaat is extreem warm of koud, dit probleem is van vitaal belang voor het voortbestaan. Daarnaast veel dieren zijn gevoelig voor zeer kleine verschillen in temperatuur in het comfortabele bereik en omgeving met een ideale temperatuur uitzoeken. Dit is van bijzonder belang voor poikilothermic organismen zoals fruitvliegjes, die equilibreer hun lichaamstemperatuur met het milieu. Testen om te controleren van larvale thermotaxis hebben bijgedragen in de identificatie en verduidelijking van de rol van moleculaire sensoren zoals Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële (TRP) kanalen4,5,6, rhodopsins7,8, en ionotropic receptor receptoren (IRs)9, die deze dieren met temperatuur gevoeligheden begiftigen over verschillende temperatuurbereiken.
Een tweeweg multiple-choice test biedt een aanpak om te bestuderen van thermische voorkeuren in larven6,7. De bepaling brengt met zich mee tot de oprichting van twee verschillende temperatuurzones en laat de dieren om te selecteren van de ene kant boven de andere. De resultaten van twee richtingen keuze tests kunnen robuust, vooral als de temperatuurverschillen tussen de twee opties groot zijn. Bovendien, aangezien elke bepaling classificatie van slechts twee groepen impliceert, kan de gegevens worden uitgedrukt als een eenvoudige voorkeur-index. Het gemak en de eenvoud van twee richtingen keuze tests zijn ook vatbaar voor genetische schermen. Een belangrijk minpunt is echter dat veel experimenten nodig om de gewenste temperatuur van de wild-type of mutant dieren zijn.
Een kleurovergang assay biedt de mogelijkheid om de gewenste temperatuur in een enkele assay-8. Bovendien, in tegenstelling tot de twee richtingen multiple-choice test, het maakt het mogelijk de evaluatie van de verdeling van een groep dieren, wanneer geconfronteerd met een doorlopend bereik van temperaturen. Een kleurovergang assay gebruikt een petrischaal en enkele dieren en is geschikt voor het karakteriseren van de gedetailleerde gedrag van individuele dieren10. Echter, aangezien petrischaaltjes ronde zijn, de grootte van de temperatuurzones variëren en geleidelijk kleiner zijn afhankelijk van de afstand van het centrum. Dus, deze setup is niet ideaal voor het toezicht op de selecties van de temperatuur van de populaties van dieren.
Een continu thermisch kleurovergang apparaat dat is geschikt voor het beoordelen van de voorkeuren van de temperatuur van groepen van larven maakt gebruik van een rechthoekige arena en hier wordt beschreven. Het apparaat is eenvoudig te construeren en te assembleren. Bovendien, het verloop is lineair, en is flexibel, aangezien het kan worden gebruikt om te beoordelen van thermotaxis over grote temperatuur variëren van 10 ° C tot 42 ° C. De bepaling is snel en eenvoudig uit te voeren en reproduceerbare gegevens levert. Naast de rapportage van de favoriete temperatuur van larven, blijkt het de voorkeuren van de bevolking van dieren over een gehele lineaire bereik in een enkele experiment. Als gevolg van deze voordelen is het een uitstekende keuze voor de identificatie van genen die nodig zijn voor thermotaxis.

<table><tbody><tr><td>Gradient assay apparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Gekoelde/verwarmde 6L Circulerende Bad</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Dit model is niet meer leverbaar. Bijgewerkte vervangende modellen zijn: 1186R00 en 1197U04 voor 120 V, 60 Hz, of 1184L08 en 1197U04 voor 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Aluminium assay plaat (voor eenrichtingsgradiënt)</td><td></td><td></td><td>Buitenafmetingen: 14 x 10,1 x 0,9 cm, binnenafmetingen: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, zwart geanodiseerd.</td></tr><tr><td>Aluminium plaat (voor tweedirichtingsgradiënt)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, zwart geanodiseerd.</td></tr><tr><td>Aluminium blok</td><td></td><td></td><td>Buitenafmetingen: 25,5 x 5 x 1,4 cm, parameters van de binnenkanalen zijn weergegeven in figuur 1D.</td></tr><tr><td>Connector voor aluminium blokken en slangen</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitair Silicone Slang</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wand</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Items en reagentia voor assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pistool</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pistool voor 1,5 mL microcentrifugebuizen</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Thermokoppel</td><td>Fluke</td><td>K type</td><td></td></tr><tr><td>Universele microplate deksel</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35 mm schotel</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Labeling tape (voor tweedirichtingsgradiënt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Bereid 1% oplossing</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Bereid 18% oplossing vlak voor het starten van de assay</td></tr><tr><td>Verfkwast</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifugebuizen</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL ronde fles met brede mond</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Celstrainer (300 mm poriën)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Optioneel item voor het wassen van larven</td></tr><tr><td>Karton doos (buisjesbak)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Drosophila voedsel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td></td><td></td><td>22.400 mL</td></tr><tr><td>Maïsmeel, geel (extra fijn maas, gekruld) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1.609 g</td></tr><tr><td>Brewersgist 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Sojameel (10 kg/eenheid)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, Type II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo light maïsstroop</td><td>Karo</td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoaat (opgehangen in 200 proof ethanol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Propionzuur puriss. p.a., >99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Fosforzuur&nbsp; ACS reagens, &ge;85 wt. % in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

een temperatuurgradiënt assay thermische voorkeur van drosophila larven bepalen

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Veel dieren, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, zijn geschikt voor discriminerende minieme verschillen in omgevingstemperatuur, die hen toelaat om te zoeken naar hun voorkeur thermische landschap. Om de voorkeuren van de temperatuur van larven via een gedefinieerd bereik van de lineaire gedefinieerd, ontwikkelden we een bepaling met behulp van een temperatuurgradiënt. Om vast te stellen een single-directionele verloop, zijn twee aluminium blokken verbonden met onafhankelijke waterbaden, elk waarvan de temperatuur van de afzonderlijke blokken regelt. De twee blokken Stel de boven- en ondergrenzen van het verloop. De temperatuurgradiënt is opgericht door het plaatsen van een agarose-coated aluminiumplaat over de twee water-gecontroleerde blokken, zodat de plaat de afstand tussen hen overspant. De uiteinden van de aluminiumplaat die is ingesteld op de bovenkant van de water-blokken definieert de minimale en maximale temperaturen en de regio's tussen de twee blokken vormen een lineair verloop van de temperatuur. De kleurovergang bepaling kan worden toegepast op de larven van verschillende leeftijden en kan worden gebruikt voor het identificeren van mutanten die vertonen fenotypen, zoals die met mutaties die genen coderend voor TRP channels en opsins, die nodig voor de discriminatie van de temperatuur zijn.

Om vast te stellen een 18 ° C - 28 ° C single-directionele kleurovergangen, we stellen de temperaturen van twee waterbaden op 16,8 ° C en 31 ° C. Door het meten van de temperatuur op 26 posities binnen de bovenste en onderste gedeelten van alle 6 zones, de randen tussen de zones, en aan de extreme uiteinden van het agarose gel oppervlak (figuur 2C, 2E) verkrijgen we de temperaturen op 13 punten. De verdeling van de temperatuur langs het verlo...

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Deze methode kan worden gebruikt om een belangrijke vraag op het gebied van somatosensatie aan te pakken, het mechanisme waardoor een dier, zoals drosophila melanogaster, zijn favoriete omgevingstemperatuur selecteert. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de voorkeurstemperatuur van de groep larven in een enkele test kan vaststellen wanneer deze wordt geconfronteerd met een continu temperatuurbereik. Naast het verschaffen van inzicht in de temperatuursvoorkeuren van drosophila-larven, kan de impress plate ook worden aangepast voor gebruik met andere modelorganismen zoals de worm, C elegans.Maak eerst gistpasta om flesjes voor een kruising voor te bereiden. Meng gistkorrels in gedistilleerd water en maal ze tot een pasta met een stamper. Voeg vervolgens een druppel gistpasta dicht bij de binnenwanden van standaard drosophila-flesjes net boven het oppervlak van het voedsel.Om de larven te produceren, verzamel 12 tot 35 vrouwtjes en maximaal de helft zoveel mannetjes, maar niet meer dan 10 mannetjes. Combineer deze groepen in het flesje met gistpasta. Laad de voorbereide flesjes in een lade met 100 flesjes.Voeg 20 open flesjes met water toe aan de lade om vocht te bieden. S

a-temperature-gradient-assay-to-determine-thermal-preferences

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel tonen we aan testen van thermische nociceptie studeren...

Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Deze video beschrijft de smaakvoorkeurstest, een gedragsmethode die wordt gebruikt om aantrekkingskracht of vermijding te meten voor gekleurde oplossingen die anders smaken door de buikkleuring van de vlieg na inname van de voorkeursstof te beoordelen. Het aanbevolen protocol toont de procedure aan die wordt gebruikt om de voorkeur van vliegen te meten voor oplossingen van verschillende sacharoseconcentraties.

Smaakvoorkeurstest: een methode voor het meten van voedingsgedrag in Drosophila

Drosophila-larven hebben speciale sensorische neuronen - nociceptoren - waarvan de reactie op potentieel schadelijke thermische stimuli aversief - of zogenaamd "nocifensief" - gedrag bij het dier veroorzaakt. Deze video beschrijft een methode om thermische nociceptie te beoordelen door larvaal gedrag op te nemen als reactie op lokale toepassing van een warmtesonde op de cuticula. Deze methode wordt daarom de lokale hittesondetest genoemd.

Lokale hittesondetest: een methode om nociceptie van hoge temperaturen bij Drosophila-larven te beoordelen

Drosophila-fruitvliegen kunnen kleine temperatuurveranderingen onderscheiden en daarom omgevingen met gunstige thermische omstandigheden selecteren. Deze video beschrijft een gedragstest die de temperatuurvoorkeur van Drosophila-larven test op een lineaire thermische gradiënt.

Temperatuurgradiënttest: een methode om de temperatuurvoorkeur bij Drosophila-larven te testen

We hebben onlangs een nieuwe Drosophila circadiane output, temperatuurvoorkeursritme (TPR) geïdentificeerd, waarbij de voorkeurstemperatuur bij vliegen overdag stijgt en 's nachts daalt. TPR wordt onafhankelijk van een andere circadiane output, motorische activiteit gereguleerd. Hier beschrijven we het ontwerp en de analyse van TPR in Drosophila.

Ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in Drosophila

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van Drosophila larvenactiviteit met behulp van de TriKinetics Drosophila Activiteitsmonitor. Het apparaat gebruikt infraroodstralen om bewegingen van maximaal 16 individuele dieren te detecteren. Gegevens kunnen worden geanalyseerd om bewegingsparameters weer te geven, inclusief snelheden en de posities van de dieren binnen de testkamers.

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.

Nieuwe test voor Cold Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Hier presenteren we een protocol om automatisch te bepalen door de motorische prestaties van Drosophila op het veranderen van temperatuur met behulp van een programmeerbare temperatuurgevoelig arena die snelle en nauwkeurige temperatuurveranderingen in tijd en ruimte produceert.

Een automatische methode om te bepalen van de prestaties van Drosophila in antwoord op temperatuurveranderingen in ruimte en tijd

Thermische grenzen kunnen voorspellen de omgevingen organismen tolereren, dat is waardevolle informatie in het gezicht van de snelle klimaatverandering. Hier beschreven zijn high-throughput protocollen om kritische thermische minima en warmte knockdown tijd bij insecten te beoordelen. Beide protocollen maximaliseren de doorvoer en minimaliseren de kosten van de tests.

Hoge doorvoertesten van kritieke thermische grenzen bij insecten

Insecten hebben een optimaal omgevingstemperatuurbereik waar ze binnen willen blijven, en veel externe en interne factoren kunnen deze voorkeur veranderen. Hier beschrijven we een kosteneffectieve en eenvoudige methode om temperatuurkeuze te bestuderen, waardoor insecten vrijelijk hun natuurlijke gedrag kunnen vertonen.

Bepaling van de temperatuurvoorkeur van muggen en andere ectothermen

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van de tijd tot knockdown van volwassen Drosophila melanogaster met behulp van een Drosophila Activity Monitor (DAM2) als reactie op een warmtestressor voor luchtgeleiding in een couveusekamer. De DAM2 meet de activiteit door individuele vliegbewegingen te registreren terwijl ze een infraroodstraal kruisen. De analyse van de gegevens wordt vergemakkelijkt door een nieuw uitvoerbaar bestand dat door de auteurs is gemaakt.

Hittetolerantietesten met behulp van het Drosophila-activiteitsmonitorsysteem : een gids voor een uitvoerbare toepassing voor gegevensanalyse

Leer een temperatuurgradiënt-assay voor thermische voorkeur van Drosophila-larven. Deze methode gebruikt aluminium blokken en agaroseplaten om voorkeurstemperatuur te bepalen in somatosensatie-onderzoek.

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Meer video's verkennen