Name: Spectrale Reflectometric microscopie op Myelinated axonen In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer spectrale reflectometrie voor labelvrije nanoschaalbeeldvorming van gemyeliniseerde axonen in intacte hersenweefsel. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van axonale nanostructuren mogelijk zonder complexe kleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het Institute of Basic Science (IBS-R015-D1) en door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2017R1A6A1A03015642).

Alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Sungkyunkwan Universiteit.
1. de monstervoorbereiding
Opmerking: Autoclaaf alle chirurgische instrumenten vóór hun dierlijke behandeling. Alle chirurgische prestaties in een ruimte gewijd aan chirurgische ingrepen verrichten. Steriele chirurgische jassen en handschoenen moeten gedragen worden door al het personeel in de chirurgische kamer te allen tijde.
<ol><li>
Weefsel fixatie
	<ol>
<li>Twee 10 mL spuiten, die elk gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS voor te bereiden.</li>
		<li>Anesthetize van een 7-12-weken oude muis, (C57BL/6J of geen muis lijnen met beide geslachten) door het toedienen van een mengsel van zoletil en xylazine (1:1, 20 mg/kg per stuk) of een alternatieve geschikt verdoving regime (b.v., mix van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine) met een intraperitoneale injectie.</li>
		<li>Zodra de muis bereikt een chirurgische vliegtuig van anesthesie (gebruik de teen snuifje-respons methode), bloot het hart door het afsnijden van de huid en de ribbenkast met een schaar.</li>
		<li>Snip het juiste atrium met een kleine schaar te afvoer van het bloed en de oplossing van het PBS en PFA opeenvolgend door het linkerventrikel perfuse met een naald (perfusie tarief = 4 mL/min, volume = 10 mL voor elke oplossing). Opmerking: De muis wordt stijf als de procedure is voltooid. Het gebruik van oog zalf of sterilisatie is niet nodig omdat de procedure terminal is. De fixatie procedure kan worden overgeslagen. Deze stap wordt echter aanbevolen om te minimaliseren van structurele vervormingen met inbegrip van mechanische weefselschade en ischemische axonale zwelling. Voor meer informatie over weefsel fixatie, verwijzen naar het artikel door Gage, G. J. et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van het segment van de hersenen
	<ol>
<li>Decapitate de muis met een chirurgische schaar via de ventrale borststuk en buik.</li>
		<li>Verwijder de hoofdhuid en het beenvlies met behulp van een voldoende kleine schaar tot volledig bloot de schedel.</li>
		<li>Het voorhoofdsbeen breken en snijd de schedel langs de Sagittaal hechtdraad uit het occipitale bot met behulp van kleine schaar met zorg niet aan de hersenen beschadigen.</li>
		<li>De schedel en de dura mater opeenvolgend met fijne pincet voorzichtig te verwijderen.</li>
		<li>Pak de hersenen met behulp van een zachte kunststof lepel, verzorgen niet om schade aan het weefsel.</li>
		<li>Spoel en geniet van de uitgepakte hersenen in een 4% PFA-oplossing gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Snijd de vaste hersenen in 100 – 150 µm secties met behulp van een vibratome. Opmerking: Voor nadere bijzonderheden over de voorbereiding van het weefsel, verwijzen naar het artikel door Segev et al. 11. voor latere procedures, het weefsel moet worden gesneden in secties dunner beeldscherm mogelijk dan de dikte van het tussenstuk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage van het segment van de hersenen
	<ol>
<li>Bereiden 1 glasplaatje en 2 vierkante cover glazen (22 × 22 × 0,17 mm) voor elk segment van het weefsel.</li>
		<li>Één van de vierkante cover-bril in de helft gesneden (twee rechthoekige stukken) met behulp van een glassnijder.</li>
		<li>Bevestig de twee van de gehalveerde cover bril met behulp van een super lijm op het dia-glas. Opmerking: De ruimte tussen de twee gehalveerde bril moet iets groter dan de grootte van het segment van het weefsel.</li>
		<li>Oogst van het segment van de hersenen met een borstel of een pipet en leg het weefsel op het glas van de dia tussen het tussenstuk. Wees voorzichtig niet te vouwen van het weefsel.</li>
		<li>Breng 100 μl van PBS op het oppervlak van het weefsel.</li>
		<li>Plaats de andere vierkante cover glas op de top van het weefsel. Vermijd het insluiten van luchtbellen tijdens deze etappe.</li>
		<li>Seal rond het glas van de cover met behulp van een nagellak (of als alternatief geschikt lijmen) ter voorkoming van verdamping van PBS en verontreiniging door stof tijdens de daaropvolgende imaging-sessie. Opmerking: De experimentator kan onderbreken in dit stadium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kalibratie
<ol><li>Inschakelen van de Microscoop ten minste 1 uur vóór de beeldvorming toe thermische stabilisatie van de laser bron (Zie Tabel van materialen). Vervolgens zet de software voor het scannen van spectrale (Zie Tabel van materialen) en klik op de knop ophalen op de bovenkant van GUI (Figuur 3a).
</li>
	<li>Inschakelen van de sluiter van de software voor de wit-light laser (WLL) en fotomultiplicator (bet) (Figuur 3a).</li>
	<li>Selecteer de xyΛ modus op de drop-down lijst in de Modus van de overname, dan de invoermodus laser wordt automatisch gewijzigd van constante procent in Constant vermogen. Schakel het selectievakje automatische SPverkeer. En stel vervolgens de spectrale venster van de input laser 470-670 nm en de spectrale stap-grootte naar 4 nm op Λ-excitatie Lambda Scan instellingen (Figuur 3b).</li>
	<li>Stel in het spectraal bereik van bet op 450-690 door erop te dubbelklikken of het verplaatsen van de balk voor aanpassing voor spectraal bereik (Figuur 3 c). Opmerking: Deze spectrale moet omvatten de volledige bandbreedte van de ingangsbron.</li>
	<li>Selecteer een water-immersie objectief, naar behoren met een hoge numerieke diafragma (nb > 0,7) en geef een willekeurige waarde aan de bet en laser macht om AOBS configuratie en Live scannen knop te activeren. Schakel de optische weglengte door het controleren van de reflectie in de AOBS configuratie (afbeelding 3d).</li>
	<li>Monteren van een referentie-spiegel (Zie Tabel van materialen) in het werkgebied van de Microscoop. Het spiegelend oppervlak moet tegen de objectief worden geconfronteerd. Als het is niet gemakkelijk om te zetten van de spiegel in het werkgebied van de Microscoop, obligatie een spiegel op de vlakke plaat (bijvoorbeeld dia glas).</li>
	<li>Controle het stadium van de Microscoop het brandvlak aan het spiegelend oppervlak worden uitgelijnd.</li>
	<li>De bet winst en de kracht van de laser overweegt het dynamisch bereik van de detector aanpassen en wijzig vervolgens de invoermodus laser van constante procent Constant vermogen. Opmerking: Zoals gebruikelijk, een bet winst van 500 (V) en een relatieve laser kracht van 0,1% worden gebruikt bij 570 nm.</li>
	<li>Bevestigen in een pseudo-kleurmodus om te controleren of er geen verzadiging in het golflengtegebied. Als verzadiging wordt waargenomen, verlaagt u de kracht van de laser (Figuur 3a).</li>
	<li>De overname van Lambda Scan uitvoeren</li>
	<li>De spiegel uit het werkgebied verwijderen en herhaal de zelfde overname zonder een monster met het oog op de donkere verwijzing (d.w.z., donkere offset).</li>
	<li>De gegevens in een Multistacked TIF -indeling opslaan.</li>
</ol>3. SpeRe Beeldacquisitie
<ol><li>Plaats het gemonteerde weefsel in het werkgebied van de Microscoop. Gebruik de breed-gebied fluorescentie-modus door middel van een oog-delige ruwweg, wilt uitlijnen het weefsel naar het brandvlak van het objectief.</li>
	<li>Met de Live scannen op het stadium van de Microscoop voor het uitlijnen van het brandvlak naar de regio van belang in het weefsel te bepalen. Om te voorkomen dat de achtergrondgeluiden van de cover slip, door de regio van de doelstelling van ten minste 15 μm diepte te selecteren in de glas-weefsel-interface.</li>
	<li>Het verwerven van de spectrale afbeeldingsstapel voor de regio van de doelgroep met de hierboven beschreven procedure zoals beschreven in stappen 2.1-2.10.</li>
	<li>De gegevens voor het weefsel en de donkere verschuiving in Multistacked TIF -indeling opslaan. Opmerking: De experimentator kan onderbreken in dit stadium.</li>
</ol>4. verwerking en analyse van het beeld
<ol><li>Open de spectrale gegevens (multistacked TIF) voor de spiegel van de verwijzing en het hersenweefsel in ImageJ.</li>
	<li>Selecteer de ROIs (regio's van belang) voor de geopende afbeeldingsstapels — het centrale gebied voor de spiegel van de verwijzing en het segment van een axon fiber voor het hersenweefsel.</li>
	<li>De ruwe spectra verwerven voor de geselecteerde ROIs door lopend beeld → stapels → Plot z profiel ImageJ menu.</li>
	<li>Open de donkere offset gegevens, een genomen voor de spiegel van de verwijzing en de andere genomen voor het hersenweefsel.</li>
	<li>Verwerven van de spectra voor de donkere verschuivingen door lopend beeld → stapels → Plot z profiel ImageJ menu.</li>
	<li>Sla alle de verworven spectra met behulp van de opties voor kopiëren en plakken . Opmerking: Voor SpeRe imaging, gebruik van de centrale imaging veld te minimaliseren off-axis optische aberraties wordt aanbevolen. De axon vezels kunnen worden structureel heterogene langs hun lengte. Vandaar, de ROI op een kleine axon segment selecteren, meestal < 5 µm, tot een minimum beperken van partiële-volume artefact is aanbevolen.</li>
</ol>5. correctie van de basislijn en SpeRe signaalanalyse
<ol><li>Aftrekken van de offset spectra van de spectra van de referentie-spiegel en de weefsels van de hersenen.</li>
	<li>Normaliseren elk spectrum door het verdelen van de maximumlichtsterkte van het spectrum.</li>
	<li>Verdeel het genormaliseerde spectrum van het axon door de genormaliseerde spectrum van de referentie-spiegel en aftrekken van de DC-offset uit het genormaliseerde spectrum.</li>
	<li>Meten van de frequentie golfgetal door het aanbrengen van de verworven spectrum aan een sinusoïdale curve (Zie Tabel van materialen) en vervolgens omzetten in de verworven golfgetal periodiciteit door wederkerige nemen.</li>
	<li>De periodiciteit golfgetal omzetten in de diameter van de axon met behulp van de vergelijking in Figuur 4 c.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen: Kwon van J. en M. Choi zijn uitvinders van de octrooi-hangende technologie in dit artikel beschreven.

SpeRe is een nieuwe label-vrije imaging modaliteit op basis van spectrale interferometrie, die voor het eerst biedt de nanoschaal informatie in levende myelinated axonen. In het huidige protocol voor de verwerving, de ruimtelijke resolutie voor de axon diameter is in de orde van 10 nm. Bovendien SpeRe maakt gebruik van de ordes van grootte lager lichte dosis in vergelijking met andere super resolutie microscopies; het is dus vrij van fototoxiciteit en photobleaching. SpeRe zou voorzien in een nieuwe laan studeren nanosch...

In de zoogdieren zenuwstelsel biedt myeline snelle zenuw geleiding en axonale integriteit door het enwrapping van de axon vezels met meerdere lagen membraanachtig omhulsels. Zijn meerdere lagen structuur bestaat uit afwisselende nanoschaal dun-films samengesteld uit plasma membranen (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), en extracellulaire ruimte (~ 7 nm)1,2. Optische microscopie, met inbegrip van de recente Super resolutie microscopie, zijn niet geschikt voor het observeren van de nanoschaal myeline dynamiek als gevolg van hun onvoldoende resolutie als gevolg van optische diffractie3,4,5. Hoewel elektronenmicroscopie de fijne details van de myeline nanostructuur bieden kan, is het niet compatibel met de levende biologische systemen als gevolg van sterk invasieve staalvoorbereiding waarbij chemische fixatie en ultrasectioning6,7 . Tot voor kort, is er geen techniek toepassing op nanoschaal dynamiek van myelinated axonen in situte observeren.
Shain et al. eerder gemeld dat myelinated axonen kleurrijk licht reflectie8vertonen. Door het aannemen van de spectroscopische analyse van het gereflecteerde licht, hebben we een nieuwe beeldvorming modaliteit voor de nanoschaal beeldvorming van myelinated axonen, genaamd spectrale reflectometrie (SpeRe)9bedacht. SpeRe is gebaseerd op de inmenging van de dunne-film die zich voordoen in de multi-gelaagde structuur van de myelineschede (Figuur 1). Door middel van optische simulatie op verschillende axonen, we hebben aangetoond dat het spectrum van de reflectie een periodieke functie van golfgetal en de periodiciteit (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) is omgekeerd evenredig met de diameter van de axon (d). Deze eenvoudige relatie (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) biedt facile kwantificering van axon diameter van de SpeRe gegevens. Gebruik makend van dit, onthuld wij het overwegend axon bolling onder licht traumatisch hersenletsel in onze voorafgaand verslag.
Het SpeRe systeem is gebaseerd op confocale microscopie en bestaat uit een gespecialiseerde laserbron en filters (Figuur 2). De invoerbron is een wit-light laser, verstrekken van breedband spectrale uitgang voor infrarood regio's zichtbaar. Voor de spectrale scan, het systeem is uitgerust met twee akoestisch-optische apparaten: een akoestisch-optische afstembare filter (AOTF) voor het leveren van een geselecteerde golflengte van de breedband ingangsbron en een akoestisch-optische balk splitter (AOBS) voor de geselecteerde begeleiden weerspiegeld golflengte naar de detector. De software voor hyperspectrale confocale microscopie biedt (Zie Tabel van materialen) een aanpasbare spectrale scan-optie om opeenvolgend verwerven de reflectiecoëfficiënt beelden bij verschillende input golflengten. Bovendien, kan chromatische aberratie kritisch mengen in de spectrale meting; Daarom wordt gebruik van een objectief apochromat aanbevolen.
Wit-licht lasers produceren een ongelijke spectrale vermogen van de nota, en de optische onderdelen ook invloed hebben op de spectrale profiel. Daarom moeten de verworven spectra worden gekalibreerd voor de verdere kwantitatieve analyse. Een beschermde zilveren spiegel wordt het meestal gebruikt als een verwijzing, waarin een bijna constante reflectie (> 97%) over de volledige zichtbare gebied. De verworven spectra worden vervolgens gedeeld door de spectra van de verwijzing van de spiegel.
De spectrale stap-grootte voor de spectrale scan bepaalt de snelheid van de overname; Dus, moet worden geoptimaliseerd. Aangezien een grotere axon een hogere spectrale periode heeft, vereist het fijnere spectrale bemonstering. Een axon met een diameter van 10 µm, een van de grootste fysiologische axonen, heeft bijvoorbeeld een spectrale periode van ~ 8 nm. Door Nyquist bemonstering criteria toe te passen we gebruikt de spectrale voorbeeldinterval van 4 nm ter dekking van alle fysiologische axonen in de muis nerveus weefsels. Deze aanpak meestal neemt enkele seconden voor een volledige spectrale scan en dus niet geschikt voor in vivo toepassingen, waar fysiologische beweging (b.v. ademhaling en hartslag) interfereert stabiele spectrale acquisitie. Wij eerder dit probleem opgelost door het implementeren van een aangepaste rechtop Microscoop, ontworpen om het volledige spectrum voor elk punt met behulp van een array spectrometer (overname snelheid ≈ 30 ms per pixel) verwerven.
In dit verslag, beschrijven we een gedetailleerd protocol op de imaging SpeRe op een vaste brain slice, die kan worden uitgevoerd in een commerciële hyperspectrale Microscoop (Zie Tabel van materialen). Aldus, kan het protocol worden uitgevoerd door onderzoekers zonder expertise in optische instrumentatie. Wij behandelen ook de mogelijke problemen en probleemoplossing voor overname en analyseren van SpeRe gegevens.

<table><tbody><tr><td>Glass cutter</td><td>-</td><td>-</td><td>Kan worden gekocht in een lokale buurtwinkel of online winkels.</td></tr><tr><td>Nagellak</td><td>-</td><td>-</td><td>Kan worden gekocht in een lokale buurtwinkel of online winkels.</td></tr><tr><td>Apochromat objectief 40&times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Water-immersie type</td></tr><tr><td>Fluoromeilin Groen</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatief kan Fluoromeilin Rood (F34652) worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Zie de "Configuratie van microscoop" in de Inleidingsectie voor details.</td></tr><tr><td>Beeldvormingssoftware</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Gecoat met beschermd zilver.</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Dikte: #1 (0.13 tot 0.17 mm)</td></tr><tr><td>Glijglas</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Dikte: ~1 mm</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Gebruik een doseerapparaat om contact met de huid of ogen te voorkomen.</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>Wit-licht laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 is stopgezet en vervangen door EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spectrale reflectometric microscopie op myelinated axonen in situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In een zoogdieren zenuwstelsel biedt myeline een elektrische isolatie door enwrapping de axon vezels in een spiraal van meerdere lagen. Geïnspireerd door haar zeer georganiseerde subcellular architectuur, ontwikkelden we onlangs een nieuwe beeldvorming modaliteit, spectrale reflectometrie (SpeRe), waarmee de ongekende label-vrije nanoschaal beeldvorming van de levende myelinated axonen in situgenoemd. Het onderliggende principe is nanostructural om informatie te verkrijgen door het analyseren van het spectrum van de reflectie van de meerdere lagen subcellular structuur. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerde stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van een basic SpeRe beeldvorming van de nerveus weefsels met behulp van een commerciële confocal microscopische systeem, uitgerust met een laser wit-licht en een afstembare filter. Wij behandelen de procedures voor de bereiding van de monsters, verwerving van spectrale gegevens en beeldverwerking voor het verkrijgen van nanostructural informatie.

Volgens het protocol, een vaste hersenen-segment was bereid met exogene kleuring, een fluorophore van myeline-targeting (Zie Tabel van materialen). SpeRe imaging werd uitgevoerd op het segment van de hersenen met behulp van een commerciële hyperspectrale confocal microscoop in combinatie met confocal fluorescentie imaging (figuur 4a). Voor SpeRe, input optische intensiteit werd ingesteld op 5 μW/µm2 met een pixel Nadruktijd ~ 1 µs....

Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor imaging-myelinated axonen in een segment van de vaste hersenen met behulp van een label-vrije nanoschaal imaging techniek gebaseerd op spectrale reflectometrie.

Spectrale Reflectometric microscopie op Myelinated axonen In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Deze techniek kan helpen om belangrijke vragen in het myelineveld te beantwoorden, zoals myeline plasticiteit en demyelinisatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie van de nanostructuur van gemyeliniseerde axonen in intact hersenweefsel mogelijk maakt zonder enige complexe markering of monstervoorbereiding. Hier zullen we de toepassing demonstreren op een hersensnede, maar deze techniek kan worden uitgebreid naar levende dieren.Na het fixeren en snijden van muizenhersenweefsel volgens het tekstprotocol, bereidt u één glazen plaat en twee dekglasjes voor elke weefselsonde voor. Gebruik een glazen snijder om één van de vierkante dekglasjes doormidden te snijden. Maak vervolgens een afstandhouder door de twee stukken met superlijm op de glazen plaat te bevestigen.Gebruik een borstel of pipette om een hersensnede te verzamelen en leg het weefsel op een glazen plaat tussen de afstandhouder, zorg ervoor dat het weefsel niet wordt gevouwen. Spuit 100 microliter PBS op het weefseloppervlak. Plaats vervolgens het tweede vierkante dekglas op de bovenkant van het weefsel, waarbij u voorkomt dat er luchtbellen worden geïntroduceerd.Gebruik nagellak om rond het dekglas te verzegelen om verdamping van PBS en verontreiniging door stof tijdens de volgende beeldsessie te voorkomen. Schakel ten minste een uur voor het beeldvormen de microscoop in om thermische stabilisatie van de laserbron mogelijk te maken. Schakel vervolgens de software in voor spectraal scannen en klik op de knop 'verwerven' bovenaan de GUI.Schakel de softwaresluiter in voor de witte lichtlaser en de fotomultiplierbuis. Selecteer onder de acquisitiemodus de XY lambda-modus op de vervolgkeuzelijst. De laserinvoermodus wordt dan automatisch veranderd van constant percentage naar constante vermogen.Onder lambda-excitatie, lambda-scaninstellingen, verwijder het vinkje bij het automatische SP-bewegingsvak en stel het spectrale venster voor de invoerlaser in op 470 tot 670 nanometer en de spectrale stapgrootte op vier nanometer. Stel het spectrumbereik van PMT in op 450 tot 690 nanometer door te dubbelklikken of door de aanpassingsbalk voor spectrumbereik te verplaatsen. Selecteer een water-immersie objectieflens met een hoge numerieke opening.Geef een waarde aan de PMT en laservermogen om de AOBS-configuratie en live scan-knop te activeren. Schakel onder AOBS-configuratie over naar de optische baan door reflectie aan te vinken. Monteer vervolgens een referentiemembraan op de microscooptafel met de oppervlakte naar het objectieflens gericht.Als het niet gemakkelijk is om het spiegel op de microscooptafel te plaatsen, hecht u een spiegel op de vlakke plaat. Pas de microscooptafel aan om het brandvlak te lijnen met het oppervlak van de spiegel. Pas vervolgens de PMT-versterking en het laservermogen aan, rekening houdend met het dynamische bereik van de detector.Controleer onder pseudokleur of er geen verzadiging is over het hele golflengtebereik. Als verzadiging wordt waargenomen, verlaagt u het laservermogen. Voer vervolgens de lambda-scan-acquisitie uit.Verwijder de spiegel van de tafel en herhaal dezelfde acquisitie zonder een monster om de donkere referentie te verkrijgen. Sla vervolgens de gegevens op in een multi-gestapelde TIF-indeling. Om SpeRe-beeldacquisitie uit te voeren, plaatst u het gemonteerde weefsel op de microscooptafel.Om het weefsel grof uit te lijnen naar het brandvlak van het objectieflens, gebruikt u de breedveldfluorescentiemodus door een oogstuk. Met de live scan ingeschakeld, bestuurt u de microscooptafel om het brandvlak uit te lijnen naar het gebied van interesse in het weefsel. Om achtergrondruis van de dekglas te voorkomen, selecteert u een doelgebied van minstens 15 micrometer in diepte vanaf de glasweefselinterface.Verzamel de spectrale beeldafstand voor het doelgebied met dezelfde procedure als eerder in deze video is aangetoond. Sla vervolgens de gegevens voor het weefsel en de donkere offset op in multi-gestapelde TIF-indeling. Om de beelden in ImageJ te verwerken, opent u de spectrale gegevens voor het referentiemembraan en hersenweefsel.Selecteer de ROI's voor de geopende beeldafstanden, het centrale gebied voor het referentiemembraan en het segment van een axonvezel voor het hersenweefsel. Voer vervolgens beeld, stapels, plotten Z-asprofiel uit om de ruwe spectra voor de geselecteerde ROI's te verkrijgen. De axonvezels kunnen structureel heterogeen zijn langs hun lengtes, daarom wordt het aanbevolen om de ROI op een klein axonsegment, typisch minder dan vijf micrometer, te selecteren om artefacten van gedeeltelijk volume te minimaliseren.Open de donkere offsetgegevens, één genomen voor het referentiemembraan en de andere voor het hersenweefsel, en plot het Z-asprofiel zoals net is aangetoond. Gebruik vervolgens de kopieer- en plakopties om alle verkregen opties op te slaan. Om baselinecorrectie en SpeRe-signaalanalyse uit te voeren, trekt u de offsetspectra af van de spectra van het referentiemembraan en het hersenweefsel.Normaliseer elk spectrum door de maximale intensiteit van het spectrum te delen. Voer het golfgetal in door de reciproke van de golflengte te nemen die in het experiment is gebruikt, normaliseer het spectrum van het axon door dat van het referentiemembraan te delen en trek de DC-offset af van het genormaliseerde spectrum. En verkrijg vervolgens het golfgetalfrequentie door het verkregen spectrum aan te passen aan een sinusoïde.Zet de verkregen golfgetalfrequentie om in periodiciteit door de reciproke te nemen en zet de golfgetalperiodiciteit om in axondiameter met behulp van de vergelijking die hier wordt getoond. In dit experiment werden vaste hersensneden fluorescent gemarkeerd tegen myeline en SpeRe-beeldvorming werd uitgevoerd met een lichtdosis die een orde van grootte lager was dan conventionele fluorescentieconfocale microscopie. Het SpeRe-signaal werd gelokaliseerd langs het centrum van de gemyeliniseerde axonen zoals verwacht door de geometrie van de optische reflectie.Uit het reflecterende spectrum van een axonsegment werd de golfgetalperiodiciteit verkregen, die vervolgens werd omg

spectral-reflectometric-microscopy-on-myelinated-axons-in-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Source: Kwon, J., et al., Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates the use of spectral reflectometry with a hyperspectral confocal microscope to analyze interference patterns and determine myelinated axon diameters in fixed brain tissue slices.

Using Spectral Reflectometry to Determine Myelinated Axon Diameters in a Fixed Mouse Brain Slice

Source: McCullagh, E. A., et al. Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates fluorescence and Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) imaging to visualize neuronal architecture in rodent brain tissue. Nissl staining labels cell bodies by binding to ribosomal RNA, while CARS imaging targets lipid-rich myelin through laser-induced signals. Overlaying the fluorescence and CARS images provides a...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy to Visualize Myelinated Neurons in Mouse Brain Tissue

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

We presenteren een protocol dat gebruikmaakt van twee-foton excitatie time-lapse microscopie om gelijktijdig de dynamica van axon- en myeline-verwondingen in real time te visualiseren. Dit voorgestelde protocol maakt studies mogelijk van zowel intrinsieke als extrinsieke factoren die het lot van centrale gemyeliniseerde axonen na verwonding kunnen beïnvloeden en kunnen bijdragen aan permanente klinische handicaps.

Een Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) dient als een diermodel van multiple sclerose. Dit artikel beschrijft een benadering voor het scoren van ruggenmergontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel bij EAE. Daarnaast wordt een methode gepresenteerd om oplosbare neurofilamentlichtniveaus in het muizenserum te kwantificeren, waardoor de beoordeling van axonaal letsel bij levende muizen wordt vergemakkelijkt.

Scoren van ontsteking, demyelinisatie en axonletsel van het centrale zenuwstelsel bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer spectrale reflectometrie voor labelvrije nanoschaalbeeldvorming van gemyeliniseerde axonen in intacte hersenweefsel. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van axonale nanostructuren mogelijk zonder complexe kleuring.

Spectrale Reflectometric microscopie op Myelinated axonen In Situ

Meer video's verkennen