Name: Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer native massaspectrometrie voor eiwitcomplexen en ligandbindingen. Deze methode analyseert oligomere toestanden en stabiliteit om inzicht te geven in biomoleculaire interacties en biologische assemblages.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij zou willen bedanken Karl-Peter Hopfner en Robert Thomas Byrne voor vriendelijk bieden HerA en HerA-NurA EiwitSteekproeven en voor hun medewerking aan de proefopzet. Wij danken ook Dr. Eamonn Reading voor zijn beoordeling van het manuscript. We mijn dankbaarheid uitspreken aan onze financierende instanties: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] en Royal Society [RG150216 naar A.P.].

Geen belangenconflicten verklaard.

MS speelt een steeds belangrijkere rol in het karakteriseren van de stoichiometrie, interacties en subeenheid architectuur van eiwitcomplexen. IM-MS gegevens kunnen worden gebruikt om te definiëren van topologische regelingen van subeenheden binnen multicomponent complexen. Vergeleken met andere bestaande structurele biologiemethodes, heeft MS verschillende voordelen. Native MS is een snelle en uiterst gevoelige techniek en kan worden gebruikt om de heterogene EiwitSteekproeven sonde. Wanneer gekoppeld aan in-oplossing verstoring experimenten, kunnen dissociatie trajecten van eiwit samenstellingen worden gecontroleerd. Samen met kristalstructuren of homologie modellen, de informatie die wordt aangeboden door structurele MS biedt een instrument voor het onderzoeken van eiwit-ligand interacties en bieden in de buurt van-native modellen en vergadering trajecten11.
Hier beschrijven we de nodige experimentele procedures voor het analyseren van de stoichiometrie en de samenstelling van eiwit-ligand interacties, met één of meer liganden, met behulp van integratieve MS. Het gaat hierbij om de bereiding van de monsters van de MS, data-acquisitie, data-analyse en de integratie van MS gegevens met behulp van computerhulpmiddelen. Om dit te doen, hebben we gebruikt de DNA-resectie HerA-NurA hetero-oligomere eiwit complex, gebonden aan drie liganden (DNA, ATP en ADP), als ons modelsysteem. Het protocol wordt het gebruik van de momenteel beschikbare software om te helpen gegevensanalyse en presentaties.
Het verkrijgen van hoge kwaliteit spectra is belangrijk voor ligand bindende analyse, dus voorzichtig monster voorbereiding stappen zijn kritisch, met inbegrip van EiwitReiniging, ligand titratie en buffer uitwisseling. Een beperking van nESI native MS bij de studie van ligand bindende aspecifieke bindend is. Niet-specifieke binding treedt op tijdens de druppel desolvation gedurende het gehele proces electrospray. Dit verhoogt de ligand-concentraties en daarom verandert de verhouding van eiwit/Ligand29. De binding van nucleotiden resulteert in een relatief kleine massa verschil tussen apo en nucleotide-gebonden eiwit dat niets aan de ionisatie efficiëntie50,51 verandert.
We gebruikten de Synapt G2-Si MS systeem voor ons werk, maar de protocollen voor verschillende onderzoeken van andere complexen van de eiwit-ligand met behulp van andere verkrijgbare nano-electrospray massaspectrometers toepasselijk zijn. Integratieve structurele MS speelt steeds een belangrijke rol bij het aanpakken van biologische problemen van grotere complexiteit. De workflow en de hier beschreven technieken zijn zeer geschikt voor de structurele gevolgen te begrijpen en de opbouw van mechanismen voor complexe eiwit en eiwit-ligand vorming die anders moeilijk te bestuderen met behulp van conventionele structurele technieken .

Native massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten en hun complexen wordt uitgevoerd met behulp van electrospray en nano-electrospray ionisatie (nESI), die behouden vouwing van eiwitten en niet-covalente interacties tijdens de behandeling door ionisering proces1, 2. In native MS, de structuur van eiwitten en hun complexen worden bewaard in een in de buurt van-native staat in de gasfase3,4. Native MS detecteert meerdere geladen eiwitten ionen, die worden gescheiden volgens hun massa verhouding (m/z) waardoor de massa van het eiwit of eiwit-ligand opladen complex moet worden berekend. Deze gegevens kunnen de bepaling van een intact eiwit stoichiometrie, subeenheid samenstelling ligand bindende en interactie netwerken3,4,5,6. Native MS heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere technieken dergelijke röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie5. Ten eerste, inheemse MS is een snelle en uiterst gevoelige techniek, vereisen slechts een paar microliters (2-3 µL) van monster bij relatief lage complexe eindconcentraties in de hoge nM tot lage µM bereik6. Anderzijds kan inheemse MS ondervragen heterogene EiwitSteekproeven waardoor het analyseren van meerdere eiwitten en valt bestuurlijk gezien onder oligomere gelijktijdig kan worden gebruikt. Ten derde, inheemse MS vereist geen EiwitSteekproeven te worden gewijzigd vóór de analyse door chemische crosslinking of eiwit etikettering. Deze voordelen hebben structurele MS een krachtig hulpmiddel voor het structurele onderzoek van eiwitcomplexen gemaakt.
Native MS kan worden gecombineerd met ion mobiliteit (IM), een techniek die meet de tijd dat een eiwit-ion neemt om te reizen door middel van een elektrisch veld, waardoor het collisional doorsnede (CCS) te bepalen. Het CCS biedt lage resolutie structuurgegevens, waarmee topologie en conformationele heterogeniteit informatie van eiwitten kunnen worden verkregen. Bovendien kan het de behandeling van structurele modellen eiwit gegenereerd door computationele benaderingen.
Gas-fase eiwitstabiliteit kan worden onderzocht met behulp van botsing geïnduceerde ontvouwen (ICB) gemeten door IM-MS. Tijdens het proces van de ICB, zijn eiwit ionen versneld en geactiveerd door middel van verhoogde versnellende botsingen met een gas inerte buffer binnen een massaspectrometer7,8,9. Dit collisional activeringsproces zorgt ervoor dat het eiwit te gedeeltelijk ontvouwen, wat zich in een toename van CCS vertaalt. Deze verandering in CCS en de energie die nodig is te ontvouwen van het eiwit kan worden gemeten met behulp van IM-MS. deze aanpak, kan het effect van ligand eiwitstabiliteit bindt gemeten10. Subcomplexes kunnen worden gegenereerd in oplossing in-oplossing verstoring methoden zoals de toevoeging van organische oplosmiddelen gebruiken voor het controleren van native-achtige topologieën van eiwitcomplexen. Verstoring van de eiwitcomplexen is voornamelijk te wijten aan de verstoring van de niet-covalente interacties binnen. De sub complexen native-achtige topologieën handhaven en, na MS detectie, onthullen informatie over Inter subeenheid connectiviteit.
Integratieve benaderingen in de structurele biologie combineren verschillende methoden om te bestuderen van de structuur en de dynamiek van eiwitten en hun complexen3,4,5,6. Native MS en IM-MS zijn gebruikt om te ontdekken de moleculaire details van uitdagende biologische systemen. Er zijn verschillende voorbeelden van toepassingen met inbegrip van de studie van eiwit vergadering trajecten11,12,13,14, bestuderen van de eiwit-eiwit interactie netwerken15 , 16 , 17, membraan eiwitten6,18,19,20,21, en eiwit-ligand interacties zoals nucleïnezuren22,23 ,24.
Native MS heeft echter ook haar beperkingen. Native MS metingen worden vaak uitgevoerd in vluchtige buffers zoals waterige ammoniumacetaat waarin sommige eiwitten niet hun gevouwen geboortestaat3,25 behouden. Niettemin, recente onderzoek heeft aangetoond dat deze beperking kan worden overwonnen door optimalisatie van het spuiten van naald tip diameter (0,5 mm tips) zodanig dat eiwit en eiwit complexe ionen kunnen gevormd worden rechtstreeks vanuit niet-vluchtig buffers met hoge-Ionische-sterkte die beter de fysiologische omgeving26na te bootsen. Daarnaast inheemse MS gebruikt electrospray ioniseren en overbrengen van niet-covalente verzamelingen van oplossing naar de gasfase; derhalve kan de relatieve overvloed van gedetecteerde complexen niet geheel vertegenwoordigen die in oplossing5,27. Bovendien in vergelijking met in oplossing, de gas fase hydrofobe interacties worden zwakker en elektrostatische interacties sterker geworden en daarom favoriet3,28.
In dit artikel geven wij protocollen, data-analyse en interpretatie voor eiwit identificatie en ligand bindende gebruik van inheemse MS, IM-MS, ICB, verstoring van de in-oplossing, en modellering. Het DNA repair complex, HerA-NurA, wordt gebruikt als een modelsysteem. Onderbrekingen van de double-stranded DNA (DSBs) zijn een van de meest cytotoxische en schadelijke vormen van DNA-schade, wat resulteert in genetische instabiliteit en de uiteindelijke ontwikkeling van kanker bij de mens. Homologe recombinatie is het mechanisme van de reparatie die DSBs, een proces dat is georkestreerd door de ATP afhankelijke helicase-nuclease complex, HerA-NurA22uitroeit.
Native MS en IM-MS combineren met functionele testen en modelleren toegestaan de onderzoek van: i) de rol van NurA in de vergadering bevleesdheid en de stabiliteit van het complex, ii) de interactie tussen dsDNA en het complex en de invloed daarvan op de algemene stabiliteit van het complex, en iii) de stoichiometrie en impact van ATP bindt de vergadering22. Globaal, is dit werk leidde tot een beter begrip van de moleculaire basis van de HerA-NurA complex door het koppelen van eiwit complexe conformationele veranderingen en stabiliteit met de nucleotide-bindende. Dit protocol is algemeen voor alle eiwit-complex(es) die samenwerkt met één of meerdere ligand(s) typen.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5&prime;-(3-thiotrifosfaat) tetralithiumzout</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-difosfaat </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaatoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin chromatografiekolommen</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin concentrator</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillairen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Eiwitten zijn een belangrijke klasse van biologische macromoleculen die vele spelen een belangrijke rol in de cellulaire functies spelen, met inbegrip van genexpressie, katalyseren metabole reacties, DNA-reparatie en replicatie. Daarom biedt een gedetailleerd inzicht in deze processen kritische informatie over hoe cellen functie. Integratieve structurele MS-methoden bieden structurele en dynamische informatie over eiwit complex vergadering, complexe connectiviteit, subeenheid stoichiometrie, eiwit oligomerisatie en ligand bindend. Recente vooruitgang in integratieve structurele MS hebben toegestaan voor de karakterisatie van uitdagende biologische systemen, met inbegrip van grote DNA-bindende proteÃ¯nen en membraaneiwitten. Dit protocol wordt beschreven hoe diverse MS om gegevens te integreren, zoals native MS en ion mobiliteit-massaspectrometrie (IM-MS) met moleculaire dynamica simulaties inzichten te krijgen in een helicase-nuclease DNA herstellen eiwit complex. De daaruit voortvloeiende aanpak biedt een kader voor gedetailleerde studies van ligand binding met andere eiwitcomplexen betrokken bij belangrijke biologische processen.

Native MS resultaten bleek de oligomere staat, de samenstelling en de topologie van de HerA-NurA complex (Figuur 1). Als niet-covalente interacties worden bewaard in de gasfase, inheemse MS van ATP-γ-S en ADP titraties experimenten bepaald de paarsgewijze nucleotide binding aan HerA-NurA (Figuur 2) en die verhoging van de ATP-γ-S-concentratie stijgt de relatieve intensiteit van hexameer HerA (Figuur 3). Structurele informatie met betrekking tot subeenheid interacties werden verkregen-oplossing verstoring gevolgd door inheemse MS en werden in overleg met en theoretische massa (Figuur 4 en tabel 1).
De experimentele CCS waarden van eiwitten en hun complexen was afgeleid van IM-MS experimenten (Figuur 5). Deze waarden zijn rotatie gemiddelde gasfase transversale berekeningen van de moleculaire vorm, en beschrijven de dimensionale staat van het eiwit. CCS waarden worden vergeleken met theoretische metingen van röntgendiffractie en een goed akkoord afleidt dat de inheemse vorm in bewaard in de gas-fase (tabel 1). Dit wordt gevalideerd met behulp van CCS waarden voor het bouwen van lage-resolutie modellen voor de vergadering eiwit48.
Experimentele CCSs kunnen worden berekend voor elke tenlastelegging staat ion. Een native-achtige eiwitten conformer kan aanleiding geven tot opladen staat ionen met gelijkaardige waarden van CCS. Echter verhoogd hogere kosten staat ionen coulombic repulsions die tot eiwit gasfase openende en grotere CCS waarden ten opzichte van de theoretische CCSs leiden kunnen. De CCS-waarde van de laagste kosten staat ionen daarom meestal zijn gebruikt49. Voor HerA-NurA, experimenten van de verstoring van de in-oplossing met HerA en HerA-NurA met en zonder DNA gevraagd de generatie van het traject van een vergadering starten met monomeren dan vormen de hele hexameer HerA (HerA6)-dimeric NurA (NurA2) complex met DNA (Figuur 6).
Verschillen in de ICB ontvouwen percelen apo (ligand-vrij) en ligand gebonden definiëren de verandering in complexe stabiliteit op ligand bindend. Een hogere CV50 of KECOM waarde impliceert een meer gestabiliseerde ion in de gas-fase. ICB en KECOM -analyse bleek dat DNA-gebonden HerA-NurA is stabieler dan het complex van DNA-gratis (Figuur 7Aii). Uit de analyse van de ICB-MS in de respectieve staten van de ATP-binding, de vier-ATP-γ-S gebonden staat minder complexe stabiliteit in de gas-fase en de zes -ATP-γ-S gebonden staat waar zijn alle sites zijn bezet was het meest stabiel (Figuur 7Bii). Native MS kan onthullen de discrete nucleotide bindend Staten van HerA; echter niet kan het onderscheiden welke HerA subeenheden ATP bindend zijn en waar deze binding plaatsvindt. Deze informatie kan worden afgeleid uit de expliciete oplosmiddel MD simulaties op de hexameer HerA en de HerA-NurA na de samengevatte Workflow (Figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Figuur 1. Ondervragen de oligomere staat, de samenstelling en de topologie van de HerA-NurA niet-covalente complex. (A) massaspectra van HerA, HerA-NurA en HerA-NurA in aanwezigheid van DNA (15,4 kDa 25 bp double-stranded DNA). Het HerA sub complex bestaat zowel een hexamer als een heptamer. NurA dimeer bindt en een hexamer van de HerA opleggen van oligomere conversie. Het DNA bindt het gevormde HerA - NurA complex (aangepast uit Z. Ahdash et al., 201722resultaten). (B) de relatieve intensiteiten van de geïdentificeerde soorten zijn berekend aan de hand van UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Figuur 2. Native ESI-MS blijkt het mechanisme waarmee het HerA-NurA nucleotide binden. Massaspectra (A) HerA-NurA en (B) HerA-NurA-DNA met toenemende concentraties van (i) ATP-γ-S en (ii) ADP. Gemeten massa's worden vergeleken met theoretische massa's en de hoeveelheid ATP-γ-S of ADP gebonden worden bepaald. Gemeten massa's en aantal afhankelijke nucleotiden worden weergegeven op de spectra. ATP-γ-S en ADP titraties experimenten bepaald de paarsgewijze nucleotide-bindende HerA-NurA alleen en bij complex met DNA die aangeeft van een cyclische reactiemechanisme (aangepast uit Z. Ahdash et al., 201722resultaten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Figuur 3. Het meten van het effect van de toenemende concentraties van de ATP-γ-S op HerA oligomere staat. (A) massaspectra van HerA op toenemende concentraties van ATP-γ-S. (B) grafiek waarin de relatieve intensiteiten van verschillende soorten van inheemse MS berekend aan de hand van UniDec deconvolutie software32. Aangezien de ATP-γ-S-concentratie stijgt, verhoogt de relatieve intensiteit van hexameer HerA ook. Aantal moleculen van ATP-γ-S gebonden wordt getoond op de spectra (aangepast uit Z. Ahdash et al., 201722resultaten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Figuur 4. Massa spectra en sub complexe dissociatie producten van HerA (A) en (B) HerA-NurA (i) alleen en in de aanwezigheid van (ii) DNA volgende van verstoring van de-oplossing. In-oplossing verstoring experimenten werden uitgevoerd met behulp van 10-40% van acetonitril, Methanol (MeOH) of dimethylsulfoxide (DMSO) en resulteerde in de vorming van verschillende subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Figuur 5. Ion mobiliteit aankomst tijd distributies komt te staan op de as van een CCS voor complexen en gegenereerde sub complexen. Pictogram voor elk sub complexe correlaat met die aantekeningen op de spectra in Figuur 4. Experimentele en berekende massa's en CCS waarden van sub complexen zijn vermeld in tabel 1 die allemaal een overeenkomst tussen experimentele en berekende waarden toonde (na bestudering van de typische onzekerheid in de resolutie van de reizen van Golf ion mobiliteit massaspectrometrie ±5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Figuur 6. Vergadering traject van het complex van de HerA-NurA gegenereerd vanuit native MS en IM-MS. gekleurde cirkels geven voorwaarden waar elke sub complex werd waargenomen van de verstoring van de-oplossing: native (groen, voorafgaand aan de verstoring), Methanol (geel), DMSO (paars) of Acetonitril (rood). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Figuur 7. Onderzoeken van het stabiliserende effect van (A) DNA op HerA-NurA en (B) ATP-binding aan HerA-NurA-DNA. (i) gas-fase ICB-MS Staanplaatsen en (ii) center-van-mass botsing energieën (KEcom) berekening blijkt dat de aanwezigheid van dsDNA het HerA-NurA complex stabiliseert en dat de zes ATP-γ-S staat gebonden de meest stabiele is. Stabilisatie voor verschillende gratis Staten wordt weergegeven. Percelen werden gegenereerd met behulp van PULSAR 33. De resultaten van (A) uit Z. Ahdash et al., 201722aangepast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Figuur 8. Workflow voor de modellering procedures voor differentiële moleculaire dynamica simulaties. (A) het genereren van het complex onder onderzoek door het bouwen van de topologie van bestaande subeenheden en herbouw van de ontbrekende residuen. (B) workflow voor het uitvoeren van moleculaire dynamica simulaties op het eiwit complex met en zonder ligand. Moleculaire dynamica simulaties zijn liep voor de proteïne alleen die handelt als een referentie en die wordt afgetrokken van de simulatie van eiwit plus ligand. Dit wordt gevolgd door het berekenen van de differentiële kwadratische gemiddelde schommelingen (RMSF) tussen de simulaties en vaststellen van het effect van ligand bindend. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Complex / sub complex</td>
			<td>Theoretische massa (kDa)</td>
			<td>Experimentele massa (kDa)</td>
			<td>Theoretische CCS (Å2)</td>
			<td>Experimentele CCS (Å2) [gratis]</td>
			<td>Voorwaarde HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>10% ACN, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>10-40% ACN, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40% meth, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, kan 10-40%, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226,2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Experimentele en berekende massa en CCS waarden van HerA-NurA en haar sub complexen gegenereerd formulier in-oplossing verstoring studies.

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Tegenwoordig speelt massaspectrometrie een belangrijke rol in de structurele biologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over belangrijke biologische macromoleculen in hun eigen staat, met name eiwitten en eiwitcomplexen. Inheemse massaspectrometrie is op grote schaal van toepassing op een verscheidenheid van biomoleculaire assemblages, waaronder multiproteïne en nucleïnezuursystemen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel en zeer gevoelig is. Het kan worden gebruikt om heterogene eiwitmonsters te ondervragen, het mogelijk maken om meerdere eiwitten in oligomerische toestand tegelijkertijd te analyseren. Het demonstreren van de procedure zal Andy Lau, een promovendus in mijn groep.Om deze procedure te beginnen, bereidt u de interne haarvaten voor nanoelekrospray zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een ligand-vrij monster als een controle voor elke run als buffer uitwisseling elk in ammonium acetaat. Selecteer vervolgens de tof-modi gevoeligheid, positieve ionenverwerving en mobiliteits- en mobiliteits-TOF.Schakel vervolgens de trap-, API- en IMS-gassen in. Voor IM scheiding gebruik maken van de stikstof en argon uitgangspunten hier getoond en aan te passen als dat nodig is. Stel een geschikte m/z acquisitiereeks in.Voor een onbekend eiwit moeten de eerste optimalisatiestappen een breed bereik gebruiken. Steek de met goud bedekte capillaire in een capillaire houder. Laad vervolgens tussen twee en drie microliters van de eiwitcomplexe oplossing van belang in de capillaire.Draai de capillaire aan en plaats deze op het elektrospraybronpodium. Schuif de fase in positie om gegevens te verzamelen. Breng een lage nanostroom gasdruk tot een druppel vormen aan het puntje van de capillaire.Verplaats de capillaire ten opzichte van de kegel en controleer de ionenstroom om een stabiele ionenstroom te bereiken. Breng een capillaire spanning aan in het bereik tussen 0,9 en 1,6 kilovolt. Stel vervolgens de bemonsteringskegel, bronverschuiving, brontemperatuur en kegelgasstroom in zoals beschreven in het tekstprotocol.Om een goed opgelost massaspectrum en gemaximaliseerde ionentransmissie te verkrijgen, past u de MS-parameters aan en controleert u de resulterende verandering in de spectra. Stel de val botsing energie op een eerste startpunt tussen 10 en 50 volt. Als de spanningsverschuivingen onvoldoende zijn, past u de valbotsingsenergie aan.Stel de val via de spanning op een eerste startpunt tussen 20 en 45 volt. Verbeter desolvation door het optimaliseren van deze spanning. Optimaliseer hierna de golfsnelheid en golfhoogte zoals beschreven in de tekst om de beste mobiliteitsscheiding te bereiken.Voor studies waarbij HerA en NurA gebruik maken van een golfsnelheid van 40 meter per seconde en een golfhoogte tussen 550 en 650 volt. Voor DNA-bindingsanalyse, meng het eiwit en DNA op een kiesverhouding die het mogelijk maakt voor eiwit DNA complexe vorming. Voeg steeds meer van een van de volgende, 5'O-3-thio-triphosfate, tetralithium zout, of ADP.Met behulp van geschikte software meet de massa's van gegenereerde soorten en identificeren van de ligand binding, zoals ATP en ADP binding en oligomeric staten. Gebruik vervolgens de ionenintensiteiten die in de ruwe ESI MS-spectra worden waargenomen om de overeenkomstige relatieve overvloed aan soorten te kwantificeren. Na het optimaliseren van de instrumentomstandigheden voor een stabiele transmissie, vermindert u de botsingsenergie en bemonsteringskegel zo laag mogelijk, met behoud van een goede spectrakwaliteit.Gebruik de eerder bepaalde geoptimaliseerde golfsnelheid en golfhoogte om IM MS te verkrijgen. Meet de ionendrifttijd bij drie verschillende golfsnelheden met behoud van dezelfde golfhoogte. Om het eiwition TE bepalen meet CCS vier eiwitkalibbrants, twee met de massa boven het onderzochte eiwit en twee met de massa hieronder, met dezelfde instrumentatievoorwaarden. Bereid eerst de eiwitmonsters voor en buffer wissel ze uit in ammoniumacetaat zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg oplosmiddel in stappen van 10%tot het bereiken van de gewenste hoeveelheid. Een uur lang incubeer op ijs. Hierna een IM-MS-spectrum voor elk monster.Wijs met behulp van de SUMMIT-software eiwitsubcomplexen toe en genereer eiwitinteractienetwerken. U ook handmatig een lijst van theoretische massa's genereren voor de verwachte soorten. Om te beginnen met het onderzoeken van eiwitcomplexe stabiliteit, registreert u IM-MS-gegevens en verhoogt u de spanning van de valversnelling van 10 volt naar 200 volt, die zich geleidelijk zal ontvouwen tot het eiwit en de gasfase.Analyseer de gegevens met behulp van de juiste software en genereer tweedimensionale ontvouwingspercelen door de intensiteit genormaliseerde CCS-distributies te stapelen bij elke versnellingsspanning voor elke laadstatus. Native MS-resultaten onthullen de oligomerische toestand, samenstelling en topologie van het HerA- en NurA-complex. Aangezien niet-covalente interacties in de gasfase behouden blijven, worden inheemse MS van ATP gamma S en ADP titratieexperimenten gebruikt om de paarswijze nucleotidebinding in de HerA en NurA te bepalen.Massaspectra van de HerA oligomeric staten blijkt dat het verhogen van de ATP gamma S concentratie verhoogt de relatieve intensiteit van hexamerische HerA. De experimentele CCS-waarden voor de eiwitten en hun complexen worden vervolgens afgeleid uit de IM-MS experimenten. Deze waarden worden gezien als een goede overeenkomst met theoretische metingen van x-ray kristallografie, die valideert met behulp van CCS waarden voor het bouwen van lage resolutie modellen van eiwit assemblage.CIU en KEcom analyse blijkt dat DNA gebonden HerA-NurA is stabieler dan de DNA-vrije complex. CIU MS-analyse en de respectieve ATP-bindingstoestanden tonen aan dat de vier ATP-gamma S-gebonden toestand de complexe stabiliteit in de gasfase vermindert. Echter, de zes ATP gamma S gebonden staat waarin alle sites bezet zijn, wordt gezien als de meest stabiele.Nauwkeurige metingen van de moleculaire massa van een intact complex geven waardevol inzicht in biomoleculaire karakterisering. We kunnen informatie krijgen over complexe assemblagetrajecten, eiwit oligomerisatie en ligand binding. Het combineren van al deze informatie maakt het mogelijk om gedetailleerde modellen van functionele biologische samenstellingen te genereren.

analyzing-protein-architectures-protein-ligand-complexes-integrative

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Ion mobility-massaspectrometrie is een nieuwe gas-fase ionen technologie die scheidt, op basis van hun botsing doorsnede en massa. De methode biedt drie-dimensionale informatie over de algemene topologie en de vorm van eiwitcomplexen. Hier schetsen we een basisprocedure voor het instrument instellen en optimaliseren, kalibratie van drift tijden en data interpretatie.

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

De NMR-oplossingsstructuur van een metallochaperone modelpeptide met Cu (I) werd bepaald, en een gedetailleerd protocol van monstersvoorbereiding en 1D en 2D dataverzameling tot een driedimensionale structuur wordt beschreven.

Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR

Leer native massaspectrometrie voor eiwitcomplexen en ligandbindingen. Deze methode analyseert oligomere toestanden en stabiliteit om inzicht te geven in biomoleculaire interacties en biologische assemblages.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Meer video's verkennen