De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van autofagie, zoals hoe de vorming van autofagosomen wordt gereguleerd en hoe verschillende celbehandelingen en -omstandigheden bulkautofagie beïnvloeden. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het endogeen cargo-sequestratiemeten. Daarom is de methode breed toepasbaar en onafhankelijk van kunstmatige overexpressie of introductie van cargo-sondes.

De procedure wordt gedemonstreerd door Paula Szalai en Morten Luhr, promovendi uit mijn laboratorium. Om te beginnen, kweek adherente cellen in 75 vierkante centimeter weefselkweekkolven in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius. Laat de cellen groeien tot ze een bijna confluente cellayer bereiken.

Was vervolgens de cellen met drie milliliter PBS bij 37 graden Celsius met een pH van 7,4. Verwijder het PBS en vervang het door drie milliliter 0,25% trypsin EDTA. Incubeer in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius tot de cellen loslaten.

Suspenseer vervolgens de cellen in zeven milliliter kweekmedium met 10% FBS en breng ze over naar een steriele 50 milliliter buis. Gebruik een pipettentip van 0,5 tot 20 microliter om 10 microliter celsuspensie over te brengen naar een microcentrifugebuisje met 10 microliter trypanblauw. Gebruik dezelfde pipettentip om onmiddellijk een tellingskamerplaatje te vullen en tel de cellen in een geautomatiseerde celteller.

Gebruik vervolgens kweekmedium met 10% FBS om een geschikte verdunning van de celsuspensie te bereiden. Gebruik aseptische technieken om één milliliter van de verdunde celsuspensie in elke put van een 12-puts weefselkweekplaat te zaaien. Incubeer in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius tot de gewenste celdichtheid is bereikt.

Bij de gewenste experimentele behandelingen laat één set putten onbehandeld om de achtergrondniveaus van sedimenteerbare LDH te definiëren. Drie tot vier uur voor de oogst, voeg een verzadigde hoeveelheid post-sequestratieremmer Bafilomycine A1 toe aan elke put. Incubeer in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius.

Aan het einde van de behandelingsperiode, zuig om het medium te aspireren. Voeg 200 microliter oplossing voor celdetachment, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, toe aan elke put. Incubeer bij 37 graden Celsius tot de cellen loslaten.

Voeg 500 microliter PBS op kamertemperatuur met een pH van 7,4 en 2% BSA toe aan elke put. Gebruik een pipettentip om elke put te resuspenderen tot er geen celklonters meer zichtbaar zijn. Transfer vervolgens de celsuspensie in elke put onmiddellijk naar een aparte 1,5 milliliter microcentrifugebuisje op ijs.

Centrifugeer de buisjes bij 400 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen te sedimenteren. Gebruik zuiging om het supernatant grondig te aspireren, waarbij de cellagen zo droog mogelijk worden gelaten. Voeg vervolgens 400 microliter oplossing met 10% sucrose in ultrapuur water toe aan elke buis.

Gebruik een pipettentip om de cellagen te resuspenderen om een bijna single cel suspensie te verkrijgen. Breng deze suspensie over naar een elektroporeercuvet van vier millimeter. Plaats de cuvet in een elektroporeerapparaat met exponentiële verval en laad een enkele elektrische puls van 800 volt, 25 microfarad en 400 ohm af.

Gebruik een nieuwe pipettentip om de celdisruptaat over te brengen naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met 400 microliter ijskoud fosfaatgebufferd sucrose-oplossing en meng kort door middel van pipetten. Herhaal dit resuspenderen, elektro-disruptie en mengproces voor elk monster. Als u de procedure voor de eerste keer uitvoert, zorg er dan voor dat u efficiënte en selectieve plasmamembraan elektro-disruptie verifieert zoals beschreven in de tekst.

Om gesedimenteerde LDH-fracties te verkrijgen, verwijder 550 microliter uit elke verdunde cel-disruptaat-oplossing en breng het over naar een eigen twee milliliter microcentrifugebuisje met 900 microliter ijskoud resuspendatie-buffer met 0,5% BSA en 0,01% Tween 20. Pijpette kort om te mengen. Centrifugeer bij 18.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 45 minuten om pellets met gesedimenteerde LDH te produceren.

Gebruik zuiging om het supernatant grondig te aspireren om de pellets zo droog mogelijk te laten. Bewaar de gesedimenteerde LDH-monsters bij min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn om te worden geanalyseerd. Voor totale LDH-fracties, breng 150 microliter van elk van de verdunde cel-disruptaat-oplossingen over naar een nieuwe buis.

Bewaar deze in een min 80 graden Celsius vriezer tot ze klaar zijn om te worden geanalyseerd. Ontdooi zowel de gesementeerde LDH als de totale LDH-monsters op ijs. Voeg eenmaal ontdooid 300 microliter ijskoud resuspendatie-buffer met 1,5% Triton X-405 toe aan de totale LDH-monsters.

Roteer de monsters op een roller in een koude kamer gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 750 microliter ijskoud resuspendatie-buffer met 1% Triton X-405 toe aan de gesementeerde LDH-monsters. Gebruik een pipettentip om de pellets te resuspenderen totdat de oplossing homogeen is.

Centrifugeer alle monsters bij 18.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om onopgelost cellulair puin te sedimenteren. Nadat de centrifugatie voltooid is, zet de monsters op ijs. Bepaal de niveaus van LDH in de supernatanten met behulp van een klassieke enzymatische assay zoals beschreven in de tekst of een van de vele commercieel verkrijgbare kits.

In deze studie wordt de bulk autofagische sequestratieactiviteit gemonitord in een aantal verschillende zoogdiercellijnen. Zoals hier getoond, worden zowel de basale als de door honger geïnduceerde LDH-sequestratievrijlating en LNCaP-cellen volledig afgeschaft door de pan-PI3-kinase-remmer, 3MA. De selectieve PI3-kinase Klasse drie-remmer, SAR-405 en de ER-calciumpomp-remmer