Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist
6 juli 2018
Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurodegeneratieve ziekten, zoals welke genetische factoren en paden de toxiciteit van ziektegeassocieerde eiwitten reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zeer efficiënte proces van gistparing wordt gebruikt om gistmodellen te screenen tegen een grote verzameling bibliotheekgenen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de toxiciteit van eiwitten bij neurodegeneratieve ziekten, kan deze ook worden toegepast op de studie van andere cellulaire processen in gist, zoals tolerantie voor andere stresscondities.
Begin deze procedure door vijf microliter plasmide-DNA per put van een gearrayde plasmidebibliotheek te pipetteren in ronde bodem 96-well platen. Bewaar de platen op vier graden Celsius. Inoculeer vervolgens 150 milliliter gistpeptondextrose of YPD-medium in een 500 milliliter fles met een kolonie van de haploïde giststam W303 Alpha.
Incubeer de cultuur bij 30 graden Celsius met schommelen bij 200 rpm overnacht. De volgende ochtend, na het meten van de OD600 van de overnachte cultuur, verdun de cultuur tot een OD600 van 0,1 in twee liter YPD. Incubeer bij 30 graden Celsius met schommelen bij 200 rpm gedurende ongeveer vijf uur, totdat de cultuur een OD600 van 0,4 tot 0,6 bereikt.
Om de gistcultuur te oogsten, vul acht steriele 250 milliliter centrifugeflessen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3000 xG op kamertemperatuur. Giet het supernatant af zonder de pellet te verstoren. Was de gist zoals beschreven in het tekstprotocol en consolideer de cellen in twee centrifugeerbuizen.
Resuspendeer elk celpellet in 25 milliliter van een 0,1 molaire lithiumacetaatoplossing. Combineer de resuspendeerde cellen, voeg vijf milliliter zalmzaad-DNA toe en breng ze over naar een 150 milliliter fles. Incubeer bij 30 graden Celsius met schommelen bij 225 rpm gedurende 30 minuten.
Na 30 minuten, giet het cellenmengsel in een steriele wegwerpreagens en gebruik een multikanaals pipet om 35 microliter van het cellenmengsel over te brengen naar elke put van de ronde bodem 96-well platen, die eerder bereide bibliotheekplasmide-DNA bevatten. Vortex de 96-well platen gedurende één minuut bij 1000 rpm.
Incubeer de platen bij 30 graden Celsius zonder schommelen gedurende 30 minuten. Stapel de platen niet, zodat de warmte efficiënter kan overgaan. Verwijder de 96-well platen uit de 30 graden Celsius incubator en meng ze gedurende 30 seconden bij 1000 rpm.
Voeg 125 microliter transformatiebuffer toe aan elke put, en vortex vervolgens de platen gedurende één minuut bij 1000 rpm. Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Vervolgens schok de gist thermisch door de platen 15 minuten in een 42 graden Celsius incubator te plaatsen.
Centrifugeer de platen bij 3000 xG gedurende vijf minuten. Verwijder de transformatiebuffer uit de putten door de platen om te draaien boven een afvalinische en de buffer krachtig uit de platen te dumpen. Deponeer de omgekeerde platen snel op een schone papieren handdoek om eventuele vloeistof bovenop de platen te verwijderen.
Spoel de cellen door aan elke put 200 microliter minimaal medium toe te voegen dat overeenkomt met de selecteerbare marker op het bibliotheekplasmide. Hier wordt synthetisch ura-min medium gebruikt. Centrifugeer de platen bij 3000 xG gedurende vijf minuten.
Verwijder het supernatant over een afvalinische zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 160 microliter minimaal ura-min medium, bevattend 2% glucose toe aan elke put en vortex de platen gedurende één minuut bij 1000 rpm. Incubeer de platen zonder schommelen bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur.
Na 48 uur zou een pellet van getransformeerde gist zichtbaar moeten zijn op de bodem van elke put. Voeg met behulp van een vloeibare dispenser 100 microliter ura-min medium met glucose toe aan elke put van een nieuwe set 96-well platen. Vortex de platen met de getransformeerde gist gedurende 30 seconden bij 1000 rpm.
Gebruik een steriele plastic 96-pin replicator om de pins in de putten met de getransformeerde gist te plaatsen en inoculeer ze vervolgens in de corresponderende putten van de nieuwe platen gevuld met media. Incubeer de nieuwe platen bij 30 graden Celsius gedurende 24 uur. Na 24 uur zou een pellet gist zichtbaar moeten zijn op de bodem van elke put die succesvol getransformeerde gist bevat.
Om deze giststammen op te slaan als glycerolvoorraad, voeg 50 microliter 50% glycerol toe aan elke put, vortex de platen gedurende 30 seconden bij 1000 rpm, sluit de platen af met aluminiumfolie en bevries ze bij min 80 graden Celsius. Om de bibliotheekstammen uit de glycerolvoorraad te herleven, haal de 96-well platen uit de min 80 graden Celsius vriezer, verwijder de aluminiumfolie en laat de gist ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur ontdooien. Zodra de gist is ontdooid, gebruik een steriele plastic 96-pin replicator om de glycerolvoorraad te inoculeren tot 160 microliter verse ura-min media bevattend 2% glucose in 96-well platen en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 24 uur.
Direct nadat de bibliotheekstammen zijn gebruikt, sluit de platen af en plaats ze terug in de min 80 graden Celsius vriezer. Op dezelfde dag dat de bibliotheekstammen worden ontdooid, inoculeer de query-giststam in 50 milliliter YPD en kweek bij 30 graden Celsius met schommelen bij 250 rpm overnacht. De volgende ochtend, giet de query-giststam in een steriele wegwerpreagens en pipet 160 microliter van de querystam in elke put van een 96-well plaat.
Gebruik de vloeibare dispenser om 160 microliter per put van YPD media in 96-well platen te doseren. Vortex kort de 96-well platen met de querystam en de bibliotheekstamplaten en gebruik vervolgens een steriele 96-pin replicator om de bibliotheekstammen over te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een op paring gebaseerde methode om overexpressiescherming in knopsporengist te vergemakkelijken met behulp van een gearrayde plasmidebibliotheek. Deze techniek kan inzichten bieden in de toxiciteit van eiwitten die neurologische aandoeningen veroorzaken en kan worden toegepast op andere cellulaire processen in gist.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurologische aandoeningen
- Cellulaire processen in gist
- Genetische screeningstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van genetische factoren bij neurologische aandoeningen is cruciaal.
- Gistmodellen zijn nuttig voor het bestuderen van cellulaire toxiciteit.
- Efficiënte screeningsmethoden kunnen onderzoek versnellen.
- Gistparing biedt een uniek voordeel voor genscreening.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor overexpressiescherming in gist.
- Om genetische paden te onderzoeken die eiwittoxiciteit reguleren.
- Om toepassingen te verkennen die verder gaan dan neurologische aandoeningen.
Gebruikte methoden
- Aliquoteren van plasmide-DNA in 96-well platen.
- Inoceren van giststammen in YPD-medium.
- Gebruik van gistparing voor efficiënte screening.
- Analyseren van de effecten van verschillende genen op toxiciteit.
Belangrijkste resultaten
- De methode screent succesvol tegen een grote collectie bibliotheekgenen.
- Inzichten in de toxiciteit van ziekte-geassocieerde eiwitten werden verkregen.
- Mogelijke toepassingen voor andere stresscondities werden geïdentificeerd.
- De techniek toonde hoge efficiëntie in screening.
Conclusies
- Deze op paring gebaseerde methode is effectief voor overexpressiescherming.
- Het kan het begrip van neurologische aandoeningen verbeteren.
- De aanpak is veelzijdig voor het bestuderen van verschillende cellulaire processen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This mating-based overexpression library screening method addresses a key bottleneck in yeast genetic screening by enabling rapid, reusable interrogation of gene function in disease models. By leveraging efficient yeast mating to introduce pre-arrayed plasmid libraries, the approach supports high-throughput target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. The platform’s compatibility with long-term glycerol stock storage enhances cross-project reproducibility and reduces redundant transformation efforts, aligning with enterprise goals for scalable discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables systematic interrogation of genetic modifiers that rescue or enhance toxicity of disease-associated proteins like FUS in ALS models.
- Operational Value: Uses mating to bypass labor-intensive transformation, allowing rapid screening of arrayed libraries against yeast models of human pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative growth-based readouts under inducible promoters (e.g., galactose) to assess gene-specific effects on protein toxicity.
- Operational Value: Produces arrayed yeast strains suitable for pinning and spotting, supporting standardized, replicable assay formats across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Identifies conserved genetic pathways that modulate cytotoxicity, offering mechanistic insights translatable to mammalian neurodegenerative models.
- Operational Value: Enables revival of library strains from glycerol stocks for repeated use in secondary validation or orthogonal assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation through functional genetics and enabling lead identification via suppression/enhancement screening in yeast-based disease models.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by identifying genes that modulate FUS toxicity, clarifying genetic regulators of proteinopathy.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative growth phenotypes after 48 hours of selection, enabling arrayed library screening with minimal batch effects.
- Analytics: Utilizes growth comparison on galactose vs. glucose plates to distinguish suppressors from enhancers of toxicity, supporting data-driven hit selection.
- Translational Research: Connects yeast genetic interactions to conserved pathways relevant to human ALS, informing target prioritization.
- Enterprise Reuse: Arrayed library stored as glycerol stock at −80°C allows rapid redeployment across multiple screens without re-transformation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming modifier effects in a diploid yeast model expressing both query and library genes.
- Operational Value: Standardizes library delivery via mating, reducing variability and increasing reproducibility across users and timepoints.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by rapidly assessing genetic modifiers of toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by revealing genetic networks that buffer or exacerbate disease-relevant phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast handling, mating efficiency, and selection marker compatibility.
- Dependent on sterile 96-pin replicators, robotic spotters, and incubators with precise temperature control.
- Necessitates standardization of media formulations (e.g., ura-his-dropout, galactose/glucose ratios) across teams.
- Must account for potential mating-type dependencies in the query strain phenotype.
- Library storage and revival protocols add operational steps but enable long-term reuse.
