Name: Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer een paringsgebaseerde overexpressie-screeningmethode in gist om genetische factoren te identificeren die de toxiciteit van eiwitopathieën moduleren. Deze techniek versnelt onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de nadenkende gesprekken met leden van het Ju-laboratorium en Zhong laboratorium, en de financiële steun van de Wright State University.

Opmerking: De hier beschreven protocol is ontworpen voor het screenen van bibliotheek plasmiden vervat in tien 96-wells-platen maar kunnen worden geschaald omhoog of omlaag dienovereenkomstig. Het protocol moet worden herhaald om te voltooien van de hele bibliotheek screening. Gewoonlijk, kan screening tegen 10 platen van bibliotheek genen telkens comfortabel worden behandeld door 1 persoon.
1. voorbereiding van de 96-Wells gist transformatie
Opmerking: Deze stap wordt gedaan als eerder beschreven7,10.
<ol><li>Aliquot 5 µL (ongeveer 50 – 100 ng) van plasmide DNA uit een mediawisselaar gekleed plasmide in ieder putje van een ronde bodem 96-wells-plaat. Opmerking: Een voorbeeld van een dergelijke bibliotheek zou een gist gene overexpressie bibliotheek10.</li>
	<li>Gist-pepton dextrose (YPD) media in een maatkolf van 500 mL met een kolonie (2 – 3 mm doorsnede) van het haploïde giststam W303α 150 mL beënten. Incubeer ze 's nachts bij 30 ° C met schudden (200 rpm).</li>
	<li>De volgende ochtend, meten de OD600 van de overnachting cultuur en verdunnen van de cultuur van de gist tot OD600 = 0.1 in (maximaal) 2 L van YPD. Incubeer bij 30 ° C met schudden (200 rpm) voor ~ 5 h tot de cultuur OD600 bereikt = 0,4-0,6.</li>
</ol>2. gist transformatie
<ol><li>Oogst de cultuur van de gist door 8 steriele 250 mL centrifuge flessen vullen en centrifugeren hen bij kamertemperatuur bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Opmerking: Voer alle centrifugeren stappen uit bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van de gist met steriele-gedistilleerd H2O. Hiervoor Voeg 100 mL steriele H2O aan elke centrifuge fles en vortex te resuspendeer de pellet cel. De gewassen cellen combineren tot 2 flessen en centrifuge hen bij 3000 x g gedurende 5 min. af het supernatant giet.</li>
	<li>Wassen van de cellen in elke fles in 100 mL 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) en centrifugeer ze bij 3000 x g gedurende 5 min. Pour uit het supernatant.</li>
	<li>Tijdens het centrifugeren, kook 5 mL zalm sperma DNA (10 mg/mL) bij 100 ° C, met behulp van een blok kachel voor 3 min en vervolgens afkoelen in de ijskast.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in elke fles, combineren de geresuspendeerde cellen en hen overbrengen in een maatkolf van 150 mL. Voeg 5 mL van de vooraf afgekoelde zalm zaadcellen DNA en na het bebroeden bij 30 ° C met schudden (225 rpm) voor 30 min.</li>
	<li>Giet het mengsel van de cel in een steriele wegwerp reagens reservoir en 35 µL van het mengsel van de cel met behulp van een meerkanaalspipet, overdragen aan elk putje van de ronde onderkant 96-wells-plaat met de bibliotheek plasmide DNA. Vortex de 96-wells-platen met behulp van een plaat-vortexer voor 1 min bij 1000 omwentelingen per minuut. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 30 ° C zonder schudden. Opmerking: Niet stapelen de platen, zodat de warmte efficiënter kunt overbrengen. We hebben ontdekt dat vortexing de 96-wells-platen op 1000 rpm veroorzaakt geen vloeistof te morsen uit de putten, maar een veilige vortex snelheid moet worden getest voordat u de stap uitvoert.</li>
	<li>Bereiden in een maatkolf van 200 mL van de buffer van de transformatie met een eindconcentratie van 40% PEG3350, 10% DMSO en 0,1 M LiOAc. Voorbereiden van de transformatie buffer onmiddellijk vóór gebruik en meng het door schudden.</li>
	<li>Verwijderen 96-wells-platen van de 30 ° C incubator en meng ze voor 30 s 1000 rpm met behulp van de vortexer van de plaat. 125 µL van de buffer van de transformatie op toevoegen aan elk goed en vervolgens de vortex de platen voor 1 min 1000 rpm.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 30 minuten en dan het verwarmen van schok de gist door het plaatsen van de platen in een incubator 42 ° C gedurende 15 minuten. Opmerking: Niet stapelen de platen.</li>
	<li>De platen gedurende 5 minuten op 3000 x gcentrifugeren. De buffer van de transformatie uit de putten verwijderen door het omkeren van de platen over een prullenbak en krachtig dumping de buffer van de platen. Snel wissen de omgekeerde platen op een schone papieren handdoek te verwijderen van een vloeistof op de bovenkant van de platen.</li>
	<li>Spoel de cellen door toe te voegen aan de platen 200 µL van het minimale uitval middellange overeenkomen met selecteerbare markering op de bibliotheek plasmide. Opmerking: We gebruikt een synthetische Ura-medium.</li>
	<li>De platen gedurende 5 minuten op 3000 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie over een prullenbak zoals in stap 2.10.</li>
	<li>Voeg 160 µL van minimale Ura-medium met 2% glucose. Vortex de platen voor 1 min op 1000 rpm en hen bij 30 ° C gedurende 48 h zonder schudden uit te broeden. Na 48u, rekening mee dat een pellet van getransformeerde gist zichtbaar aan de onderkant van elk putje.</li>
	<li>Met behulp van een vloeistof dispenser, voeg 100 µL van Ura-media bevatten glucose in ieder putje van een nieuwe reeks van 96-wells-platen.</li>
	<li>Vortex de platen met de getransformeerde gist (uit stap 2.13) bij 1000 t/min voor 30 s. met behulp van een steriele kunststof 96-pins replicator, plaatst u de pinnen in de putjes met de getransformeerde gist en enten ze vervolgens in de overeenkomstige putten van de nieuwe platen gevuld met media. Incubeer de nieuwe platen bij 30 ° C gedurende 24 uur. Opmerking: Als u werkt met 10 platen, het medium kan ook achterwege worden gelaten handmatig met behulp van meerkanaals pipetten.</li>
	<li>Na 24 h, moet een pellet van gist zichtbaar zijn in de bodem van elk putje met succes getransformeerd gist. Als u wilt deze giststammen opslaan als glycerol voorraden, voeg 50 µL 50% glycerol aan elk putje, vortex de platen voor 30 s bij 1.000 tpm, verzegelen van de platen met tape afdichten en bevriezen ze bij-80 ° C. Opmerking: De bovenstaande stappen moeten slechts eenmaal worden uitgevoerd. Toekomstige voorstellingen van verschillende gist modellen tegen het dezelfde bibliotheek wegwerp reagens reservoir te beginnen uit de voorraden van glycerol en gaan onmiddellijk uit de onderstaande stappen.</li>
</ol>3. paring tussen cellen met bibliotheek genen en Query gist
<ol><li>Nemen om te blazen de bibliotheek stammen uit de voorraad van glycerol, de 96-wells-platen uit de vriezer-80 ° C, verwijderen de afdichtende tape, en laat de gist bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten ontdooien.</li>
	<li>Zodra de gist heeft ontdooid, gebruikmaken van een steriele kunststof 96-pins replicator te enten van de voorraden van glycerol 160 µL van verse Ura-media met 2% glucose in 96-wells-platen en hen uit te broeden bij 30 ° C gedurende 24 h. onmiddellijk nadat de bibliotheek stammen worden gebruikt , verzegelen van de platen met tape afdichten, en deze terugsturen naar de vriezer-80 ° C.</li>
	<li>Op dezelfde dag de bibliotheek stammen (W303α) zijn ontdooid, enten de query giststam (hier, FUS in W303a) aan 50 mL YPD en 's nachts groeien bij 30 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.</li>
	<li>De volgende ochtend giet de query giststam een steriele wegwerp reagens reservoir en aliquoot 160 µL van de stam van de query aan elk putje van een 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet.</li>
	<li>Met behulp van de vloeistof dispenser, afzien 160 µL van YPD media in elk putje van tien 96-wells-platen. Deze platen later gebruiken voor paring van de query giststam met de gist van de bibliotheek.</li>
	<li>Kort vortex de 96-wells-plaat met de stam van de query en vervolgens gebruik een steriele 96-pins replicator overdracht van de query op de platen van de YPD stam.</li>
	<li>Kort vortex de bibliotheek stam platen en, voor elke bibliotheek stam plaat, gebruikmaken van een nieuwe steriele 96-pins replicator overbrengen van de stammen van de bibliotheek naar de YPD platen die hebben zijn geënt met de query-stam. Opmerking: Cellen in glycerol verliezen hun levensvatbaarheid na meerdere dooi-freeze cycli. Terugkeer van de stammen van de bibliotheek naar de langetermijnopslag (diepvriezer-80 ° C) zo spoedig mogelijk zal houden van de bibliotheek in goede kwaliteit, en klaar voor toekomstig gebruik. Goed onderhouden, kan de voorraad glycerol worden bevroren en ontdooid ten minste 10 keer. Wij raden het ook houden van een werkend exemplaar en back-ups van de voorraad van glycerol. Wanneer de voorraad werken niet werkt, onmiddellijk werken maken een nieuwe kopie van de back-up.</li>
	<li>Incubeer de platen van de YPD bij 30 ° C gedurende 24 h. opmerking dat een pellet van gist zichtbaar in de bodem van elk putje na 24 h zijn zal.</li>
	<li>Opvulling 96-wells-platen met een minimale uitval medium met 2% raffinose, overeenkomt met de selecteerbare merkers op het plasmide in de query-stam en de bibliotheek plasmide (bijvoorbeeldhier Ura - zijn-).</li>
	<li>Gebruikmaken van een steriele 96-pins replicator gist van de YPD paring culturen aan de selectieve media overzetten. Incubeer de 96-wells-platen bij 30 ° C gedurende 48 h; alleen gist cellen die hebben gekruist en gevormde diploïde cellen en dus zowel het query-plasmide bevatten en de bibliotheek plasmide zullen kunnen groeien in deze media. Na 2 dagen, constateren dat een pellet zichtbaar aan de onderkant van de putten.</li>
</ol>4. spotten Assay
<ol><li>
Na 48u van groei in de raffinose-bevattende selectieve media, ter plaatse de gist op agar platen.
	<ol>
<li>Bereiden van 2 sets van Ura-zijne-dropout platen met 2% agar met behulp van duidelijke polystyreen platen, één met 2% galactose en de andere met 2% glucose.</li>
		<li>Vortex de 96-wells-platen voor 1 min bij 1000 omwentelingen per minuut, dan ter plaatse de gist aan de Ura-zijne-dropout platen met 2% galactose en 2% agar (FUS en bibliotheek genen worden veroorzaakt) en aan de Ura-zijne-dropout platen met 2% glucose en 2% agar (FUS en bibliotheek genen onderdrukt) met behulp van een robot spotten machine, waardoor de cultuur in elk goed is bevlekt op de platen van de agar in viervoud (dat wil zeggen, de cultuur in 1 goed is gespot op 4 plekken op de agarplaat).</li>
		<li>Na het spotten van, laat de agar platen droog en plaats ze vervolgens ondersteboven in een 30 ° C incubator. Foto de agar platen elke 24 uur opnemen van een snellere/meer gist groei waarin de toxiciteit voor de query stam wordt gered of om een trager/minder groei waarin de toxiciteit voor de query stam wordt verergerd. Incubeer de platen gedurende 4 dagen. Opmerking: De cultuur in elk goed kan worden gespot op agar platen 1-op-1, zoals in een vorige transformatie gebaseerde methode10. Echter, de 1-tot-4 hier spotten (die kan worden gemakshalve ingesteld met de robotic spotten machine) aanzienlijk verhoogt de robuustheid van de bepaling door het verminderen van het aantal valse positieven. Positieve hits zijn alleen overwogen wanneer alle 4 kolonies van hetzelfde goed Toon een soortgelijke fenotype.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
<li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14657499">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+links+between+Abeta+toxicity%2C+endocytic+trafficking%2C+and+Alzheimer%27s+disease+risk+factors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).</li>
<li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li>
<li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies%3A+the+first+15+years+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een plasmide overexpressie scherm in gist met paring te introduceren de plasmide-bibliotheek in het model van de gist. Met behulp van deze aanpak, kunnen meerdere gist modellen van neurodegeneratieve ziekte eiwit toxiciteit worden gescreend met behulp van dezelfde collectie van gist getransformeerd met een plasmide-bibliotheek. Het moeizame proces van transformatie hoeft alleen te worden uitgevoerd zodra, na welke hoogefficiënte gist paring wordt gebruikt om de plas...

De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae heeft wijd gebruikt in fundamenteel wetenschappelijk onderzoek1 om te begrijpen van de cellulaire processen rechtstreeks verband houdt met ziekten bij de mens. Bovendien, het is gebruikt als een modelorganisme bestuderen van menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten, zoals die in verband met de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale sclerose (ALS)2. Een voordeel van de gist-model is het gemak waarmee een genoom-brede scherm kan worden uitgevoerd om te identificeren van cellulaire routes in verband met de toxiciteit van ziekte-gerelateerde eiwitten, waardoor inzicht in het mechanisme van hun toxiciteit. Één dergelijke scherm heet een overexpressie bibliotheek scherm, waarin elk van de 5.500 gist genen in een gekleed bibliotheek is omgevormd tot een model van de gist om te identificeren welke genen toxiciteit wanneer overexpressie kunnen wijzigen. Deze screeningmethode is succesvol toegepast in de modellen van de gist van meerdere neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten, met inbegrip van huntingtin voor de ziekte van Huntington3, α-synuclein voor de ziekte van Parkinson4,5 , Aβ voor Alzheimer's disease6, FUS en TDP-43 voor ALS7,8,9. Terwijl het gebeurt meestal in een high-throughput wijze10, is de meest arbeidsintensieve stap van het scherm afzonderlijk 5.500 gist genen uit een gekleed bibliotheek transformeren. Deze stap moet worden uitgevoerd telkens wanneer die de screening wordt herhaald, en wanneer een nieuw opgerichte gist-model moet worden bestudeerd. Het is belangrijk om te vinden van een meer efficiënte manier om deze taak te volbrengen.
Gistcellen kunnen stabiel in zowel haploïde en diploïde vormen bestaan. Er zijn twee tegenover paring soorten haploïde cellen, paring type een en α. haploïde cellen van elke paring Typ produceren en afscheiden van hun eigen specifieke paring feromoon, waarop alleen de tegenovergestelde paring type cellen reageren. Hierdoor wordt de paring tussen een en α cellen tot stabiele diploïde cellen, een/α. Dit proces is spontaan en hoogefficiënte11. We kunnen profiteren van deze unieke levenscyclus van S. cerevisiae in te voeren van de plasmide-bibliotheek. Meer in het bijzonder, zal elk gen in de gekleed plasmide-bibliotheek worden omgezet in haploïde cellen van één paring type, dat wil zeggen, α-cel. Deze cellen met de genen van de bibliotheek zal dan in glycerol voorraad in een gekleed 96-Wells-indeling worden opgeslagen. Voor elk gist-model dat moet worden onderzocht, kunnen gistcellen die de bibliotheek genen bevatten worden ontdooid uit de voorraad van glycerol en de screening kan worden gedaan door de paring met het model van de gist van belang in het tegenovergestelde paring type, dat wil zeggen, paring type een. Dit idee van het gebruik van de paring aan het samenbrengen van twee genen in gist is niet nieuw. Het is met succes toegepast in de gist van de high-throughput screening van de twee-hybride, in die een aas bouwen (dat wil zeggen, Gal4-DNA-bindende domein fusies) in één paring type is samengebracht door paring met een prooi construct uit een gekleed bibliotheek 12. deze strategie heeft echter nooit zijn toegepast in overexpressie bibliotheek vertoningen, die altijd gebruik van traditionele transformatie methoden gemaakt hebben.
Ons laboratorium gevestigd eerder een model van de gist van de ALS-geassocieerde proteïne FUS7. Door overexpressie bibliotheek screening met de transformatie methode ontdekten we vijf gist genen(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1en VHR1) die het redden van de toxiciteit van FUS wanneer overexpressie. Deze bevindingen werden onafhankelijk van elkaar met een gelijkaardige studie bevestigd door een andere groep8. hUPF1, een menselijke homolog van ECM32, werd later aan het onderdrukken van de toxiciteit in primaire neuronale cellen13 en in een diermodel van ALS14 ook aangetoond. Met behulp van deze vijf genen als bewijs van beginsel, we laten zien dat alle vijf genen ook FUS toxiciteit redden, wanneer zij worden binnengebracht in het model van de gist FUS door paring. Omdat gistcellen met de genen van de bibliotheek kunnen worden permanent in glycerol voorraad opgeslagen en nieuw leven ingeblazen wanneer nodig, zal deze paring gebaseerde methode de tijdrovende stap van transformatie telkens die de bibliotheek worden gescreend moet tegen verwijderen. Omdat de paring is zeer efficiënt met geen plasmide transformatie betrokken, vermindert deze strategie ook aanzienlijk de kosten in verband met reiniging en transformatie van een grote plasmide-bibliotheek. We zullen met succes deze methode toepassen op een bibliotheek screening tegen gist model van FUS.
De procedure voor paring gebaseerde screening wordt kort beschreven in Figuur 1. In eerste instantie is de gekleed plasmide-bibliotheek omgevormd tot een haploïde giststam van het type α met een hoge gegevensdoorvoer gist transformatie protocol waarin elk putje van een 96-wells-plaat gist getransformeerd met een specifieke bibliotheek plasmide bevat paring. Deze collectie van getransformeerde gist wordt opgeslagen als een glycerol voorraad die kan worden ontdooid en nieuw leven ingeblazen voor gebruik later. Het model van de gist van belang, in dit geval FUS toxiciteit, moet worden gegenereerd in een haploïde giststam met de tegenovergestelde paring type (type paring een). In een high-throughput wijze met behulp van steriele 96-pins replicators, zijn de FUS stam giststammen met de bibliotheek van de plasmide overgedragen aan 96-wells-platen met rijke media en kunnen van de stuurman. Na de paring, een klein volume van elk putje van de paring cultuur wordt overgedragen aan 96-wells-platen met synthetische dropout media in welke alleen diploïde gist met zowel de FUS en bibliotheek genen kunnen groeien. Een robotic spotten machine wordt vervolgens gebruikt voor het overzetten van gist cultuur van elk putje op agar platen waar de uitdrukking van FUS en de genen van de bibliotheek wordt geïnduceerd.  Bovendien is gist cultuur gespot om agar platen waar FUS en de bibliotheek genen niet worden uitgedrukt. Na groei op agar platen, genen die redden of verergeren FUS toxiciteit worden geïdentificeerd.

<table><tbody><tr><td>zalm Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD bouillon</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Gegranuleerde Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydraat</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfaat</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisch Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Gist aminozuur drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Gist Stikstof Base zonder Aminozuren en Ammonium Sulfaat</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaat, watervrij</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, ronde bodem met deksel</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>niet behandeld, steriel</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp;&nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paring gebaseerde overexpressie bibliotheek screening in het gist

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Ontluikende gist is wijd verbeid gebruikt als een model in het bestuderen van eiwitten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens. Genoom-brede genetische screening is een krachtig hulpmiddel gebruikte gist studies. De expressie van een aantal neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten in gist zorgt ervoor dat de cytotoxiciteit en statistische vorming, Recapitulerend bevindingen gezien bij patiënten met deze aandoeningen. Hier beschrijven we een methode voor het screenen van een model van de gist van de Amyotrofische laterale sclerose-geassocieerde proteïne FUS voor parameters van de toxiciteit. In plaats van transformatie, berust dit nieuwe platform voor screening op de paring van de gist te introduceren een gekleed bibliotheek van plasmiden in het model van de gist. De paring methode kent twee duidelijke voordelen: ten eerste, het is uiterst efficiënt; Ten tweede, de vooraf getransformeerde gekleed bibliotheek van plasmiden kan worden opgeslagen voor de lange termijn als een voorraad van glycerol en snel toegepast op andere schermen zonder de arbeidsintensieve stap van transformatie naar het model van de gist telkens. We laten zien hoe deze methode kan met succes worden gebruikt aan het scherm voor de genen die de toxiciteit van FUS wijzigen.

De ALS-geassocieerde proteïne FUS, een RNA/DNA-bindend-proteïne, was eerder studeerde in haploïde gist7,8. Genetische screening met de transformatie gebaseerde methode ontdekt verschillende gist genen die FUS toxiciteit onderdrukken. De menselijke homolog van één van de genen van gist werd later aangetoond te worden effectief in het onderdrukken van de toxiciteit in een primaire neuronale cel en rat model ALS13</...

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurodegeneratieve ziekten, zoals welke genetische factoren en paden de toxiciteit van ziektegeassocieerde eiwitten reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zeer efficiënte proces van gistparing wordt gebruikt om gistmodellen te screenen tegen een grote verzameling bibliotheekgenen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de toxiciteit van eiwitten bij neurodegeneratieve ziekten, kan deze ook worden toegepast op de studie van andere cellulaire processen in gist, zoals tolerantie voor andere stresscondities.Begin deze procedure door vijf microliter plasmide-DNA per put van een gearrayde plasmidebibliotheek te pipetteren in ronde bodem 96-well platen. Bewaar de platen op vier graden Celsius. Inoculeer vervolgens 150 milliliter gistpeptondextrose of YPD-medium in een 500 milliliter fles met een kolonie van de haploïde giststam W303 Alpha.Incubeer de cultuur bij 30 graden Celsius met schommelen bij 200 rpm overnacht. De volgende ochtend, na het meten van de OD600 van de overnachte cultuur, verdun de cultuur tot een OD600 van 0,1 in twee liter YPD. Incubeer bij 30 graden Celsius met schommelen bij 200 rpm gedurende ongeveer vijf uur, totdat de cultuur een OD600 van 0,4 tot 0,6 bereikt.Om de gistcultuur te oogsten, vul acht steriele 250 milliliter centrifugeflessen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3000 xG op kamertemperatuur. Giet het supernatant af zonder de pellet te verstoren. Was de gist zoals beschreven in het tekstprotocol en consolideer de cellen in twee centrifugeerbuizen.Resuspendeer elk celpellet in 25 milliliter van een 0,1 molaire lithiumacetaatoplossing. Combineer de resuspendeerde cellen, voeg vijf milliliter zalmzaad-DNA toe en breng ze over naar een 150 milliliter fles. Incubeer bij 30 graden Celsius met schommelen bij 225 rpm gedurende 30 minuten.Na 30 minuten, giet het cellenmengsel in een steriele wegwerpreagens en gebruik een multikanaals pipet om 35 microliter van het cellenmengsel over te brengen naar elke put van de ronde bodem 96-well platen, die eerder bereide bibliotheekplasmide-DNA bevatten. Vortex de 96-well platen gedurende één minuut bij 1000 rpm.Incubeer de platen bij 30 graden Celsius zonder schommelen gedurende 30 minuten. Stapel de platen niet, zodat de warmte efficiënter kan overgaan. Verwijder de 96-well platen uit de 30 graden Celsius incubator en meng ze gedurende 30 seconden bij 1000 rpm.Voeg 125 microliter transformatiebuffer toe aan elke put, en vortex vervolgens de platen gedurende één minuut bij 1000 rpm. Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Vervolgens schok de gist thermisch door de platen 15 minuten in een 42 graden Celsius incubator te plaatsen.Centrifugeer de platen bij 3000 xG gedurende vijf minuten. Verwijder de transformatiebuffer uit de putten door de platen om te draaien boven een afvalinische en de buffer krachtig uit de platen te dumpen. Deponeer de omgekeerde platen snel op een schone papieren handdoek om eventuele vloeistof bovenop de platen te verwijderen.Spoel de cellen door aan elke put 200 microliter minimaal medium toe te voegen dat overeenkomt met de selecteerbare marker op het bibliotheekplasmide. Hier wordt synthetisch ura-min medium gebruikt. Centrifugeer de platen bij 3000 xG gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant over een afvalinische zoals eerder gedemonstreerd. Voeg 160 microliter minimaal ura-min medium, bevattend 2% glucose toe aan elke put en vortex de platen gedurende één minuut bij 1000 rpm. Incubeer de platen zonder schommelen bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur.Na 48 uur zou een pellet van getransformeerde gist zichtbaar moeten zijn op de bodem van elke put. Voeg met behulp van een vloeibare dispenser 100 microliter ura-min medium met glucose toe aan elke put van een nieuwe set 96-well platen. Vortex de platen met de getransformeerde gist gedurende 30 seconden bij 1000 rpm.Gebruik een steriele plastic 96-pin replicator om de pins in de putten met de getransformeerde gist te plaatsen en inoculeer ze vervolgens in de corresponderende putten van de nieuwe platen gevuld met media. Incubeer de nieuwe platen bij 30 graden Celsius gedurende 24 uur. Na 24 uur zou een pellet gist zichtbaar moeten zijn op de bodem van elke put die succesvol getransformeerde gist bevat.Om deze giststammen op te slaan als glycerolvoorraad, voeg 50 microliter 50% glycerol toe aan elke put, vortex de platen gedurende 30 seconden bij 1000 rpm, sluit de platen af met aluminiumfolie en bevries ze bij min 80 graden Celsius. Om de bibliotheekstammen uit de glycerolvoorraad te herleven, haal de 96-well platen uit de min 80 graden Celsius vriezer, verwijder de aluminiumfolie en laat de gist ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur ontdooien. Zodra de gist is ontdooid, gebruik een steriele plastic 96-pin replicator om de glycerolvoorraad te inoculeren tot 160 microliter verse ura-min media bevattend 2% glucose in 96-well platen en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 24 uur.Direct nadat de bibliotheekstammen zijn gebruikt, sluit de platen af en plaats ze terug in de min 80 graden Celsius vriezer. Op dezelfde dag dat de bibliotheekstammen worden ontdooid, inoculeer de query-giststam in 50 milliliter YPD en kweek bij 30 graden Celsius met schommelen bij 250 rpm overnacht. De volgende ochtend, giet de query-giststam in een steriele wegwerpreagens en pipet 160 microliter van de querystam in elke put van een 96-well plaat.Gebruik de vloeibare dispenser om 160 microliter per put van YPD media in 96-well platen te doseren. Vortex kort de 96-well platen met de querystam en de bibliotheekstamplaten en gebruik vervolgens een steriele 96-pin replicator om de bibliotheekstammen over te

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan &gt; 1000 TFs in een enkele experiment.

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Eiwittechniek door gist Surface Display

Leer een paringsgebaseerde overexpressie-screeningmethode in gist om genetische factoren te identificeren die de toxiciteit van eiwitopathieën moduleren. Deze techniek versnelt onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Meer video's verkennen