Name: Analyse van N- glycanen Raphanus sativus Cultivars met behulp van PNGase H+ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een snelle methode voor N-glycaan-analyse in Raphanus sativus met PNGase H+. Deze techniek vereenvoudigt enzymatische vrijgave zonder bufferwisselingen, ideaal voor plantenglycoscience-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natural Science Foundation van China (verlenen nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 J.V. en L.L., verlenen G.Y. nummer 31470435), en de 100 buitenlandse talenten Plan (subsidie getal JSB2014012 J.V.).

1. sample collectie
<ol><li>Koop verschillende cultivars van verse radijs (Raphanus sativus L.).</li>
</ol>2. isolatie van de eiwit van radijs
<ol><li>Meng ongeveer 100 g verse radijs met een keuken blender gedurende 10 minuten.</li>
	<li>De drijfmest overbrengen in een tube van 50 mL centrifuge en centrifuge bij 14.000 × g bij 4 ° C gedurende 20 min te verwijderen van de onoplosbare materiaal.</li>
	<li>Breng het supernatant zorgvuldig in een nieuwe centrifuge-tube van 50 mL en voeg een gelijk volume van 2 M Trichloorazijnzuur (TCA) oplossing. Opmerking: Het toevoegen van TCA neerslaat oplosbaar (glyco) eiwitten.</li>
	<li>Centrifugeer bij 14.000 × g bij 4 ° C gedurende 30 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de Ingehuld (glyco) eiwitten.</li>
	<li>Het wassen van de pellet met 20 mL gedeïoniseerd water en centrifuge bij 14.000 × g bij 4 ° C voor 5 min om oplosbare oligosacchariden en polysacchariden te verwijderen.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5. vier keer.</li>
	<li>Resuspendeer de pellets in 1 mL gedeïoniseerd water en overdracht aan een centrifugebuis verse 1,5 mL.</li>
</ol>3. bereiding van N- glycanen
<ol><li>Mix-50 µL van eiwit oplossing uit stap 2.7. (gelijk aan 5 g verse radijs) met 0,2 mU van recombinante PNGase H+ in 10 mM azijnzuur.</li>
	<li>Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 12 h. Na de incubatie, centrifugeer bij 14.000 × g gedurende 5 min om de extra eiwit en enzym te verwijderen.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een centrifugebuis verse 1,5 mL.</li>
</ol>4. zuivering van N- glycanen
<ol><li>Voorbereiden van de solid-phase extraction (SPE) kolom te verrijken van de N- glycanen en verwijderen van zouten en andere verontreinigingen uit het reactiemengsel, verhoging van de selectiviteit van de fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) labeling agent voor N- glycan bewerking.<ol>
<li>Voeg 3 mL gedeïoniseerd water te wassen van de kolom.</li>
		<li>Voeg 3 mL 80% acetonitril oplossing trifluorazijnzuur (TFA, 0,1% v/v) te activeren met de SPE-kolom.</li>
		<li>Voeg 3 mL gedeïoniseerd water tot de SPE-kolom equilibreer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng het monster uit stap 3.3 op de kolom en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Voeg 1,5 mL gedeïoniseerd water voor het wassen van de kolom en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Elueer de vrijgegeven N- glycanen uit de kolom met behulp van 1,5 mL van een waterige oplossing van 20% acetonitril, met 0,1% TFA (v/v) in een centrifugebuis 2 mL.</li>
	<li>Verwijder het oplosmiddel door centrifugaal verdamping bij kamertemperatuur. Verdampen totdat het monster volledig droog is.</li>
</ol>5. fluorescentie bewerking van N- glycanen
<ol><li>Bereiden 1 mL 2-AB oplossing, bestaande uit 35 mM 2-AB en 0,1 M natrium cyanoborohydride in dimethyl sulfoxide/azijnzuur zuuroplossing (7:3, v/v).</li>
	<li>Voeg toe 5 µL van 2-AB oplossing voor de gedroogde monsters (stap 4.5.) afgeleid van zes verschillende radijs. Vortex elk monster tot volledig opgelost.</li>
	<li>Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij 65 ° C.</li>
	<li>Laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur voor 5 min, en voeg 5 µL van gedeïoniseerd water en 40 µL van acetonitril. Centrifugeer de buizen bij 14.000 x g gedurende 3 minuten.</li>
	<li>48 µL van het supernatant overboeken naar een 300 µL high-herstel HPLC flacon. Bewaar de derivatized N- glycan monsters bij-20 ° C voor maximaal een maand.</li>
</ol>6. HILIC-UPLC profilering van N- glycanen
<ol><li>Analyseer de monsters met behulp van een standaard UPLC systeem verbonden met een detectorset online fluorescentie bij de excitatie/emissie golflengten van 330 nm/420 nm, respectievelijk.</li>
	<li>Gebruik een hydrofobe interactie vloeistofchromatografie (HILIC)-UPLC glycan kolom op een kolomtemperatuur van 60 ° C voor de analyse.</li>
	<li>Oplosmiddel A bereid door verdunning van 50 mL stockoplossing (1 M ammonium formate oplossing, pH 4,5) met 950 mL vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LCMS)-rang van water. De stockoplossing als volgt voorbereiden:<ol>
<li>43 mL mierenzuur toevoegen aan 700 mL LCMS-grade H2O.</li>
		<li>Breng de pH op 4.5 door dropwise toevoeging van waterige ammoniakoplossing (25% m/m).</li>
		<li>Het oplosmiddel overbrengen in een maatcylinder en vul tot 1000 mL met LCMS-grade H2O. winkel bij 4-6 ° C voor maximaal 3 maanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LCMS-grade acetonitril gebruiken als oplosmiddel B.</li>
	<li>N- glycanen scheidt u met de volgende kleurovergang elutie:<ol>
<li>Begin met het toevoegen van 95% oplosmiddel b in oplosmiddelen A. Set het debiet op 0,5 mL/min van 0 naar 44,5 min.</li>
		<li>Vanaf 0 min 6 min, geleidelijk verminderen de hoeveelheid oplosmiddel B met een lineaire gradiënt to78%.</li>
		<li>Van 6 min naar 44,5 min, geleidelijk de hoeveelheid oplosmiddel B met een lineaire gradiënt 55,9% te verlagen.</li>
		<li>Van 44,5 min aan 46.5 min, snel verminderen de hoeveelheid oplosmiddel B met een lineaire gradiënt van 55,9% tot 0% en houden op 0% gedurende 2 minuten en starten wassen van de kolom. Beperken het debiet aan 0,25 mL/min van 44,5 tot 55 min.</li>
		<li>Was de kolom verder doordat oplosmiddel B tot 95% van 48.5 min naar 50,5 min en houd op 95% voor 4.5 min.</li>
		<li>Equilibreer opnieuw van 50,5 aan 57 min de kolom aan de startende voorwaarden van 95% oplosmiddel B op 0,5 mL/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteren 45 µL van het monster in de UPLC-systeem.</li>
	<li>Elueer de N- glycanen door UPLC met retentietijden tussen 15 en 40 min.</li>
	<li>Verzamelen van elke waargenomen UPLC piek breuk met behulp van 2 mL centrifuge buizen en drogen van de monsters door centrifugaal verdamping.</li>
	<li>Injecteren van ongeveer 1 pmol van 2-AB label dextran standaard (2−20 glucose eenheden) kalibreren de plant -N- glycan profilering, en hun elutie tijden in gestandaardiseerde glucose eenheden toewijzen.</li>
</ol>7. MALDI-TOF MS analyse
<ol><li>Los van de monsters van stap 6.8 in 5 µL van LCMS-rang van water. Meng 1 µL van de monsteroplossing en 1 µL van 6-aza-2-thiothymine (ATT) oplossing (0,3% w/v in waterige acetonitril 70% v/v) en Pipetteer het mengsel op de MALDI-TOF monster vervoerder.</li>
	<li>Analyseer de monsters met behulp van een MALDI-TOF massa spectrometer instrument in positieve ion modus door te drukken op de knop Start .</li>
	<li>Het analyseren van de massaspectra met behulp van de meegeleverde MALDI-TOF-MS-analysesoftware.</li>
	<li>Het interpreteren van de spectra met behulp van een opensource glycan interpretatie software19. Stelt de zoekparameters voor 2-AB labelen, [M + nb]+, en de nauwkeurigheid parameter aan 2.0 Da.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol dat wij hier hebben ingediend kan de vergelijking van de N- glycan profielen van verschillende cultivars van radijs. Een belangrijk voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande protocollen is dat geen wijzigingen van de buffer tussen de enzymatische vrijlating van N- glycanen en de reactie van de bewerking met 2-AB vereist zijn. De meest kritische stap van deze procedure is de zuivering van N- glycanen met behulp van de kolom van de SPE, als het niet verwijderen van zouten ...

N- glycanen in planten hebben meer aandacht getrokken in de afgelopen jaren, zoals het vorige onderzoek heeft N- glycanen onderstreept als een potentiële bron van immunologische kruisreacties die allergische reacties1,2 veroorzaken kunnen . Eerder is aangetoond dat de N- glycanen op plant glycoproteïnen katalytische activiteit3,4, thermostabiliteit en opvouwbare5,6 of subcellular localisatie kan beïnvloeden en secretie7. Om de correlatie tussen de glycan structuren en hun respectieve functies, moet N- glycanen eerst worden vrijgelaten uit glycoproteïnen enzymatisch of chemisch. De klassieke chemische methode voor het vrijgeven van zowel N- en O- glycanen is β-eliminatie, waarin alkalische monster behandeling gaat gepaard met vermindering met natriumboorhydride opbrengst van een alditol8. Echter, deze procedure verzet zich tegen labelen met een fluorophore en veroorzaakt aanzienlijke verval van monosaccharide eenheden vanaf het reducerende einde van de glycan-structuur. Chemische deglycosylation op basis van ammoniak hydroxide/carbonaat behandeling is ook een veelgebruikte alternatieve methode9. Geen van deze methoden van chemische release degradeert intact eiwitten, waardoor massaspectrometrische analyse van labelloze glycan zwembaden zonder tussenkomst van peptide fragmenten in het dezelfde massa bereik. Een nadeel van deze methoden is echter het tempo van de verhoogde afbraak van alpha1, 3-fucosylated- N- glycanen, een gemeenschappelijke structuur van de koolhydraten gevonden in planten10. Als alternatief, enzymatische release methoden met behulp van peptide:N- glycanases (PNGases, EG 3.5.1.52) worden ook op grote schaal toegepast. Recombinant PNGase F (van Flavobacterium meningosepticum) is de meest voorkomende keuze en vergunningen van de vrijlating van alle soorten N- glycanen, behalve de structuren met een core alpha1, 3 fucose11,12. Daarom, PNGase A (geïsoleerd uit amandel zaden) wordt meestal gebruikt voor de analyse van plantaardige N- glycanen13. Echter dit enzym deglycosylates alleen proteolytically afkomstige glycopeptiden, en niet deglycosylate native glycoproteïnen14. Vandaar, een scriptingregel monster workup is vereist voordat verdere analyse, waardoor uitgebreide verlies van glycanen, met name die van lage overvloed15. Het algemene doel van de methode is een geoptimaliseerde workflow voor N- glycan release en fluorescentie labelen op een eenvoudige en robuuste wijze presenteren. De onderliggende reden is dat de PNGase H+, die onlangs werd ontdekt in Terriglobus roseus en recombinantly kunnen worden uitgedrukt in E. coli, N- glycanen rechtstreeks vanaf de steiger van de eiwitten in zure kan hydrolyseren voorwaarden16. Een belangrijk voordeel van het gebruik van PNGase H+ over alternatieve methoden is dat TL labeling reacties in de hetzelfde reactiebuis kunnen worden uitgevoerd zonder de reactie buffers17,18. De eenvoudige bereiding voorwaarden en hoge herstel van lage-overvloed oligosacchariden maken van deze methode een waardevol hulpmiddel bij de analyse van N- glycanen. Dit protocol is geschikt voor de analyse van N- glycanen van verschillende plantensoorten.

<table><tbody><tr><td>Chemicals:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloorazijnzuur&nbsp;</td><td>SCR, Shanghai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>IJsazijnzuur</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Algemeen-reagens</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Energy chemical</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamide</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydride</td><td>J&amp;K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB-gelabelde dextran ladder, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>Gereedschap/Materialen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keukenblender</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugele verdamper</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE-kolom</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE-kolom</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF-massaspectrometer</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-analyse:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC-vial met hoge opbrengst</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-systeem</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiedetector voor HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolomoven</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kolom</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC BEH glycan-kolom</td><td>2,1 &times; 150 mm, 1,7 &mu;m deeltjesgrootte</td></tr><tr><td>LCMS-grade Water</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS-grade Acetonitril</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak-oplossing</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van n- glycanen raphanus sativus cultivars met behulp van pngase h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In de afgelopen jaren hebben de koolhydraten wordt van planten veel aandacht, ontvangen aangezien zij een potentiële bron van cross-reactive, allergie stemmende immuunrespons. Bovendien, spelen koolhydraten structuren ook een cruciale rol in de stofwisseling van de plant. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor het opstellen en analyseren van N- glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus) met behulp van een N- glycanase specifiek voor de vrijlating van plantgerelateerde koolhydraten structuren. Om dit te bereiken, waren ruwe trichloorazijnzuur precipitaten van radijs homogenates behandeld met PNGase H+, en gelabeld met behulp van 2-aminobenzamide als een TL-tag. De gelabelde N- glycan monsters werden vervolgens geanalyseerd door ultra prestatie vloeistofchromatografie (UPLC) scheiding en laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-time van de vlucht (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor een gedetailleerde structurele evaluatie en te kwantificeren van de relatieve abundanties van de radijs-afgeleide N- glycan structuren. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor de analyse van N- glycanen uit verschillende andere plantensoorten en nuttig kan zijn voor de functie nader te onderzoeken en de gevolgen van de N- glycanen op de menselijke gezondheid.

Figuur 1 toont een schematisch overzicht van de beschreven protocol, met inbegrip van de isolatie van proteïnen (glyco-) van radijs, de voorbereiding van N- glycanen, de UPLC-analyse en de MALDI-TOF-MS-analyse van deze onderdelen. Figuur 2 toont representatieve UPLC chromatogrammen van derivatized N- glycanen van de geanalyseerde radijs cultivars. Figuur 3 toont de verkregen resulta...

Beschrijven we een eenvoudige en snelle methode voor de voorbereiding en analyse van N- glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus).

Analyse van N- glycanen Raphanus sativus Cultivars met behulp van PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van plantenglycoscience, zoals de vraag hoe N-glycanen van plantaardige oorsprong snel kunnen worden geanalyseerd en gekarakteriseerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen bufferwijzigingen nodig zijn tussen de enzymatische vrijzetting van N-glycanen en de derivatiseringsreacties met 2-aminobenzamide. De procedure wordt gedemonstreerd door mejuffrouw Ya-Min Du en mejuffrouw Shen-Li Zhen; twee promovendi van het Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center aan de Nanjing Agricultural University.Om te beginnen met het isoleren van de eiwitten, gebruikt u een keukenblender om ongeveer 100 gram verse radijs gedurende tien minuten te homogeniseren. Breng de resulterende slurry over naar een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer bij 14.000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten om het onoplosbare materiaal te verwijderen.Breng daarna het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg een gelijke hoeveelheid van een twee molar trichloorazijnzuuroplossing toe. Centrifugeer bij 14,000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten.Verwijde

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Dit artikel presenteert een verbeterde vorm van een nieuwe bottom-up glycomische techniek die is ontworpen om het gepoolde samenstellingsprofiel van glycanen in niet-gefractioneerde biofluiden te analyseren door de chemische afbraak van glycanen in hun samenstellende bindingsspecifieke monosacchariden voor detectie door GC-MS. Mogelijke toepassingen omvatten vroege detectie van kanker en andere glycan-beïnvloedende aandoeningen.

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Leer een snelle methode voor N-glycaan-analyse in Raphanus sativus met PNGase H+. Deze techniek vereenvoudigt enzymatische vrijgave zonder bufferwisselingen, ideaal voor plantenglycoscience-onderzoek.

Analyse van N- glycanen Raphanus sativus Cultivars met behulp van PNGase H⁺

Meer video's verkennen