Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen
7 augustus 2018
Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van door muggen overgedragen ziekten te beantwoorden, zoals of een muggensoort een competente vector is voor een bepaald virus. Het grote voordeel van deze methode is dat een grote hoeveelheid muggen tegelijkertijd kan worden geanalyseerd, zonder het gebruik van laboratoriumdieren zoals muizen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het fijne motorische vaardigheden vereist die alleen via oefening kunnen worden verworven.
Visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal, omdat de belangrijkste stappen moeilijk te leren zijn; ze vereisen ervaring met het hanteren van muggen en virussen, en ook fijne motorische vaardigheden. Om te beginnen, verdunt u de virusvoorraad. Meng vervolgens afgelopen menselijk bloed met fructose, gefiltreerd runder serum en de virusvoorraad.
Vries 140 microliter bloedmaaltijdmix in voor verdere analyse via TCID50. Plaats vervolgens twee druppels van 50 microliter van de bloedmaaltijdmix in een plastic buisje en laat de muggen gedurende twee uur voeden. Na het verdoven van de muggen, telt u de volledig gevulde individuen en brengt u ze over naar een nieuw buisje met een katoenen kussen gedrenkt in fructose.
Bewaar vervolgens de muggen gedurende 14 of 21 dagen bij 27 graden Celsius en 80% vochtigheid. Vul de met fructose verzadigde katoenen kussens om de 72 uur aan met 1,5 milliliter fructose. Zaai eerst 20.000 Vero-cellen per putje in een 96-wellplaat met aangevuld groeimedium.
Plaats om het speekselapparaat voor te bereiden een vierkante glazen plaat in een hoek van 30 graden op de werkbank. Plak vervolgens dubbelzijdig plakband op de bovenkant van de glazen plaat. Rol vervolgens modelklei tot het een diameter van 0,5 centimeter heeft en bevestig het horizontaal op één centimeter afstand van het dubbelzijdige plakband aan de plaat.
Snij de uiteinden van het vereiste aantal 10-microliter filtertips af en vul elke tip met 10 microliter PBS. Plaats vervolgens de tips op de modelklei en zet ze vast met zachte druk. Immobiliseer vervolgens de muggen door hun poten en vleugels te verwijderen.
Bevestig de muggen aan het plakband boven de filtertips. Plaats voorzichtig de proboscis van elke mug in een filtertip. Verwijder na 30 minuten de filtertips en gooi de klei en het plakband weg.
Breng het verzamelde speeksel over in reactiebuisjes die 10 microliter PBS bevatten. Meng het speeksel en PBS voorzichtig en breng het mengsel over in de putjes van een 96-wellplaat. Incubeer de plaat gedurende zeven dagen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Controleer de cellen met behulp van een lichtmicroscoop op het voorkomen van cytopathische effecten. Zodra een putje positief is voor cytopathische effecten, gebruikt u een pipet om 140 microliter supernatant te oogsten. Breng vervolgens het supernatant over in een reactiebuisje.
Meng vervolgens 140 microliter van het supernatant met 560 microliter AVL-buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg tenslotte 560 microliter ethanol toe en draai het monster om om te mengen. Met dit protocol werden verschillende soorten muggen getest op Zika-virusinfectie en -overdracht onder verschillende klimatologische omstandigheden.
Onder incubatiecondities van 27 graden Celsius vertoonden alle Aedes-soorten Zika-virus-positieve speeksel. Omgekeerd bevatten geen van de speekselmonsters van de Culex-taxa bewijs van het virus. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden uitgevoerd voor 50 muggen in één uur als deze goed wordt uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u experimenten met gedwongen speekselafscheiding uitvoert. Vergeet niet dat werken met geïnfecteerde muggen erg gevaarlijk kan zijn, dus speciale veiligheidsmaatregelen voor de omgang met muggen onder BSA-3-omstandigheden moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van elk experiment.
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor het analyseren van de vector competentie van muggen, specifiek Aedes albopictus en verschillende Culex taxa, voor Zika virus transmissie. De gedwongen speekseltechniek maakt de gelijktijdige analyse van meerdere muggen mogelijk zonder het gebruik van laboratoriumdieren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Vector biologie
- Virologie
- Door muggen overgedragen ziekten
Achtergrond
- Begrip van vector competentie is cruciaal voor het beheersen van door muggen overgedragen virussen.
- Gedwongen speekselafscheiding is een nieuwe methode voor het beoordelen van het transmissiepotentieel van muggen.
- Vorige methoden vereisten vaak laboratoriumdieren, wat deze techniek probeert te elimineren.
- Fijne motorische vaardigheden zijn essentieel voor deze methode, wat oefening en ervaring vereist.
Doel van het onderzoek
- Om de vector competentie van verschillende muggensoorten voor het Zika virus te evalueren.
- Om een methode te demonstreren die een hoogdoorvoeranalyse van muggenspeeksel mogelijk maakt.
- Om een visuele gids te bieden voor onderzoekers die nieuw zijn in de techniek.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een bloedmaaltijdmix voor muggenvoeding.
- Gedwongen speekselafscheidingstechniek om speeksel van muggen te verzamelen.
- Celcultuur methoden om de aanwezigheid van Zika virus te beoordelen.
- Incubatie en analyse van monsters voor cytopatische effecten.
Belangrijkste resultaten
- Aedes soorten vertoonden positief speeksel voor Zika virus onder gecontroleerde omstandigheden.
- Culex taxa vertoonden geen bewijs van Zika virus in hun speeksel.
- De methode maakt het mogelijk om tot 50 muggen in één uur te testen eenmaal beheerst.
- Visuele demonstraties helpen aanzienlijk bij het leren van de techniek.
Conclusies
- Gedwongen speekselafscheiding is een effectieve methode voor het bestuderen van door muggen overgedragen virus transmissie.
- Training en oefening zijn essentieel voor een succesvolle implementatie van de techniek.
- Veiligheidsmaatregelen moeten worden nageleefd bij het hanteren van geïnfecteerde muggen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
