Name: Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer hoe je metabole labelen met 4-thiouracil toepast om nieuw gesynthetiseerd mRNA in Saccharomyces cerevisiae te kwantificeren. Deze methode meet nauwkeurig RNA polymerase II activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Laszlo Tora voor zijn steun en V. Fisher, K. Schumacher en F. El Saafin voor hun discussies. T.B. werd gesteund door een Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) en de Fondation ARC. Dit werk werd gesteund door fondsen van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Deze studie werd ook ondersteund door ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door de Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. cel kweken en Rapamycin uitputting van een Subunit SAGA
<ol><li>Voor elke S. cerevisiae stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).</li>
	<li>S. cerevisiae cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm) groeien.</li>
	<li>Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) en Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van YPD medium en laten groeien tot de OD600 rond 0,8 is.</li>
	<li>Parallel, enten een één kolonie van S. pombe cellen uit een verse plaat op 50 mL van Ja medium (0,5% gistextract; 250 mg/L adenine, histidine, uracil, leucine en lysine; 3% glucose) en groeien de cellen 's nachts bij 32 ° C, met constante agitatie (150 rpm).</li>
	<li>Meten van de OD600 van de S. pombe overnachting cultuur en verdunnen van de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 500 mL ja voedingsbodem en laten groeien tot de OD600 ongeveer is 0,8.</li>
	<li>Voor elke S. cerevisiae anker-away stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).</li>
	<li>Groeien de cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm).</li>
	<li>De volgende ochtend, meten van de OD600, Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van YPD medium en laten groeien tot de OD600≈ 0.8.</li>
	<li>Voeg 100 µL van rapamycin aan de cultuur van een stamoplossing van 1 mg/mL (laatste rapamycin concentratie 1 µg/ml) en laat de cellen Incubeer bij 30 ° C met constante agitatie voor de tijd die nodig is voor de proteïne van belang worden voorwaardelijk uitgeput van de nucleus ( 30 min is meestal voldoende). Voor het besturingselement, gebruiken een soortgelijke gist-cultuur, maar in plaats van toe te voegen rapamycin, voeg de gelijkwaardige hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
</ol>2. 4tU labelen met S. pombe als een Spike (Counting)
<ol><li>
Bereid een verse oplossing van 2 M 4-thiouracil. Zodra voorbereid, houd het op kamertemperatuur en weg van licht.
	<ol>
<li>Nauwkeurig wegen 64.1 mg 4-thiouracil voor elke cultuur S. cerevisiae en los het dan op in 250 µL van dimethylformamide (DMF) of 250 µL van DMSO.</li>
		<li>Voor de cultuur van de S. pombe moet worden gebruikt als spike, weeg 320.5 mg 4-thiouracil en los het in 1250 µL van DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De 4-thiouracil-oplossing toevoegen aan S. cerevisiae en S. pombe culturen voor een eindconcentratie van 5 mM en uit te broeden ze voor 6 min met constante agitatie bij 30 ° C en 32 ° C, respectievelijk.</li>
	<li>Verwijder na 6 min, een kleine hoeveelheid van elke cultuur voor het tellen van de cel. Met behulp van een automatische cel teller of een kamer Neubauer cellen tellen.</li>
	<li>Verzamelen van de cellen door middel van centrifugeren (2.500 x g) gedurende 5 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, wassen van de cellen met ijskoude 1 x PBS en centrifuge opnieuw (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).</li>
	<li>Bereken het totale aantal cellen in elk van de monsters S. cerevisiae en S. pombe .</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 5 mL ijskoud 1 x PBS en S. cerevisiae meng met S. pombe cellen met een 3:1 verhouding.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), verwijderen de PBS, flash-freeze de cellen in vloeibare N2en bewaren van het monster bij-80 ° C tot verder gebruik.</li>
</ol>3. RNA extractie en DNase behandeling
<ol><li>Ontdooi de cellen op het ijs voor ongeveer 20-30 min.</li>
	<li>Ga verder met de RNA extractie met behulp van een gist-RNA extractie kit (Tabel of Materials) met een paar aanpassingen.</li>
	<li>Per elk monster, giet u 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen in een buis van de 1.5-mL schroefdop die bij de kit geleverd. Houd in gedachten dat per elke buis, RNA van maximaal 109 cellen efficiënt kan worden geëxtraheerd. Daarom bereid het aantal buisjes nodig voor elk monster. Bijvoorbeeld, een cultuur van S. cerevisiae van 100 mL (OD600≈ 0.8) kan ertoe leiden dat ongeveer 2 x 10,9 tot en met 3 x 109 cellen, aanloop naar een totaal van 2,7 x 109 tot en met 4 x 109 cellen in totaal (na de piek-in met een derde van de S. pombe cellen). In dit geval zou maximaal 3-4 reactie buizen per elk monster/conditie/mutant/repliceren nodig.</li>
	<li>Per elke 1 x 109 cellen, 480 µL van de lysis-buffermengsel voorzien van de kit, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, v/v/v) toevoegen.</li>
	<li>Meng de cellen met behulp van een vortex-mixer en hen overbrengen in de buizen met de ijskoude Zirkonia kralen.</li>
	<li>Geschikt voor de buizen op een vortex-mixer adapter, draai de vortex op maximale snelheid en verslaan voor 10 min Lyse de gistcellen (in een kamer bij 4 ° C). Als alternatief, voer lysis van de cellen in een automatische kraal-beater.</li>
	<li>Centrifugeer buizen bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zorgvuldig verzamelen de bovenste fase (RNA-bevattende) voor een tube van de falcon vers 15 mL. Het volume per elke buis hersteld is meestal rond 500-600 µL.</li>
	<li>Toevoegen aan de 15 mL tubes met de gedeeltelijk gezuiverde RNA, de bindende buffer voorzien van de kit en meng grondig. Per elke 100 µL van RNA oplossing, Voeg 350 µL van bindende buffer (dat wil zeggen, wanneer het volume van de waterfase oplossing 600 µL, 2.1 mL van de buffer bindend is moeten worden toegevoegd).</li>
	<li>Aan het voorgaande mengsel, het toevoegen van de 100% ethanol en meng. Per elke 100 µL van RNA oplossing, voeg 235 µL van 100% ethanol (dat wil zeggen, wanneer het volume van de waterfase oplossing is 600 µL, 1.41 mL ethanol toevoegen).</li>
	<li>Breng maximaal 700 µL van het mengsel uit stap 3.9 een filterpatroon geassembleerd in een collectie buis, beide voorzien van de kit.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g. Als het centrifugeren duur niet genoeg voor het totale volume was aan het filter passeren, herhaalt u het centrifugeren voor 30 s.</li>
	<li>Negeren de doorstroming en hergebruiken van de dezelfde collectie buis. Voeg een andere 700 µL van RNA-bindende buffer-ethanol oplossing aan de filter en centrifuge weer bij 16.000 x g voor 1 min.</li>
	<li>Negeren de doorstroming en herhaal stap 3.11 en 3.12 totdat de RNA-oplossing is voltooid.</li>
	<li>Was het filter 2 x met 700 µL oplossing 1 te wassen. Verzamel oplossing via centrifugeren in de wasmachine bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en houd altijd de collectie buis.</li>
	<li>Was het filter 2 x met 500 µL oplossing 2 te wassen. Verzamel oplossing via centrifugeren in de wasmachine bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en houd altijd de collectie buis.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen nogmaals bij 16.000 x g gedurende 1 minuut volledig drogen het filter.</li>
	<li>Het filterelement overbrengen in de laatste collectie buis (RNA-geschikte buis) en elueer RNA met 50 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O (voorverwarmd tot 100 ° C).</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g.</li>
	<li>Elueer RNA weer (aan de dezelfde buis) met 50 µL voorverwarmde DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O. ervoor dat al het volume heeft doorgegeven door het filter; anders, Centrifugeer gedurende langere periodes.</li>
	<li>Als meerdere buizen voor één enkel monster worden gebruikt, bundelen ze allemaal in één buis.</li>
	<li>Kwantificeren en controleer de zuiverheid van het monster met behulp van de juiste apparatuur. Opmerking: Terwijl 4tU alleen in nieuw samengestelde RNA opgenomen is, is er een kans van secundaire besmetting met DNA. Om die reden, het is altijd aan te raden voor de behandeling van de monsters met DNase ik. Gebruik daarvoor de reagentia voorzien van de RNA-extractie kit (Tabel of Materials) na de aanbevelingen van de fabrikant.</li>
</ol>4. thiol-specifieke Biotinylation van nieuw samengestelde RNA
<ol><li>Aanpassen van de concentratie van het RNA verkregen met punt 3 van het protocol tot 2 mg/mL. Aliquoot 200 µg totaal RNA, het gedurende 10 minuten bij 60 ° C verwarmen en koelen het onmiddellijk op het ijs gedurende 2 minuten.</li>
	<li>
Toevoegen aan het RNA afgepipetteerde deel, de reagentia die hieronder vermeld in de volgende volgorde: 600 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O, 100 µL van biotinylation buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] en 10 mM EDTA, DEPC-op dezelfde manier afgehandeld, RNase-vrije H2O), en 200 µL van Biotine-HPDP uit een voorraad van 1 mg/mL Biotine-HPDP in DMSO of DMF.
	<ol>
<li>In sommige situaties neiging de Biotine-HPDP-oplossing te precipiteren, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage oplosbaarheid in water. In deze situatie, Verhoog het volume van DMSO/DMF tot 40% van het volume van de reactie (aan het RNA-monster, toevoegen 400 µL van DEPC-behandelde H2O, 100 µL biotinylation buffer en 400 µL van biotine-HPDP uit een voorraad van 0,5 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer het monster bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht voor 3 h, met zachte agitatie.</li>
	<li>Na incubatie, toevoegen van een ongeveer gelijke volume van chloroform om de buizen en krachtig mengen.</li>
	<li>Draai het monster bij 13.000 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C. Deze stap kan het verwijderen van overtollige Biotine dat deed niet biotinylate de RNA. Als alternatief, voer deze stap met behulp van fase-lock buizen (zware). Daarvoor, spin down de fase-lock buizen voor 1 min bij 13.000 x g, voeg het mengsel van RNA en een gelijke hoeveelheid van chloroform, meng ze krachtig en centrifugeer ze bij 13.000 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.</li>
	<li>Breng zorgvuldig de bovenste fase in nieuwe 2 mL buizen.</li>
	<li>Voeg een tiende van het volume van 5 M NaCl en meng van het monster.</li>
	<li>Voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol toe, meng het monster en draai het bij 13.000 x g gedurende ten minste 30 minuten, bij 4 ° C.</li>
	<li>Voeg voorzichtig het supernatant verwijderen en voeg 1 mL ijskoud 75% ethanol.</li>
	<li>Draaien op 13.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C.</li>
	<li>Zorgvuldig Verwijder supernatant, quick-spin de buis, en de resterende ethanol-oplossing. Zorg ervoor dat de RNA-pellet niet droogt.</li>
	<li>Opschorten van de RNA in 100 µL DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O.</li>
</ol>5. reiniging van nieuw samengestelde breuk van totale en labelloze RNA met streptavidine beklede magnetische kralen
<ol><li>Verhit de biotinyleerd RNA gedurende 10 minuten bij 65 ° C en vervolgens koelen de monsters op ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 100 µL van daar beklede magnetische kralen aan de biotinyleerd RNA (bij een eindvolume van 200 µL). Specifiek, is het aanbevolen om het gebruik van de kralen die is aangegeven in de Tabel van materialen, sinds, na gesprekken met andere laboratoria, deze leek het meer consistent en betrouwbaar.</li>
	<li>Incubeer het monster met lichte schudden voor 90 min, bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de kolommen de kit (Tabel van materialen) in de magnetische standaard voorzien.</li>
	<li>Voeg 900 µL van kamertemperatuur wassen buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, en 0,1% Tween 20, DEPC-op dezelfde manier afgehandeld, RNase-vrije H2O) naar de kolommen (vooraf uitvoeren en equilibreer).</li>
	<li>Kralen/RNA mengsel (200 µL) toepassen op de kolommen.</li>
	<li>Verzamel de doorstroming in 1.5-mL buizen en opnieuw toepassen op dezelfde magnetische kolom. Indien nodig, houden deze doorstroomtest zoals het vertegenwoordigt de labelloze RNA-Fractie.</li>
	<li>Was de kolommen 5 x met toenemende volumes buffer te wassen (600, 700, 800, 900 en 1000 µL).</li>
	<li>Elueer de nieuw samengestelde RNA met 200 µL van 0,1 M DTT.</li>
	<li>Een tweede elutie, 3 min later, met een gelijk volume van 0,1 M DTT uitvoeren.</li>
	<li>Na eluerende RNA, toevoegen van 0.1 volumes van 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 volumes ijskoude 100% ethanol en 2 µL van 20 mg/mL glycogeen (RNA-grade) en laat de RNA overhaaste overnachting, bij-20 ° C.</li>
	<li>Herstellen van het RNA door centrifugeren (13.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C) en resuspendeer het in 15 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H20. Het aandeel van de label-naar-totaal RNA naar ongeveer 2-4% (meestal meer richting de onderkant), waardoor ongeveer 2,0 µg nieuw samengestelde RNA verwachting. Deze hoeveelheid is genoeg te doen verschillende experimenten van de qPCR, evenals voor microarray/sequencing analyses.</li>
</ol>6. RT-qPCR validatie van de verschillende fracties
<ol><li>Synthetiseren cDNA van 2 µg totaal RNA of 10 µL van gelabelde RNA met willekeurige hexamers en de reverse-transcriptase van keuze, volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).</li>
	<li>CDNA versterken door real-time qPCR met behulp van een standaard protocol (Tabel van materialen). Opmerking: Alle monsters moeten in drievoud met een minimum van twee biologische replicatieonderzoeken worden uitgevoerd. Corrigeer alle ruwe waarden voor de uitdrukking van S. pombe tubuline.</li>
</ol>7. de Microarray kruising
<ol><li>RNA monsters op de spaanders van de voorkeur microarray volgens de instructies van de fabrikant te vermengen (Zie Tabel van materialenvoor dit specifieke protocol). Kort, bereiden biotinyleerd cRNA doelstellingen van 150 ng van RNA met behulp van de Premier RNA amplificatie Kit (Tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. 4 mg versnipperde cRNAs voor 16 h bij 45 ° C en 60 rpm op spaanders microarray te vermengen.</li>
	<li>Wassen, vlekken en scan de chips met behulp van het opgegeven station en de scanner (Tabel van materialen). Pak de onbewerkte gegevens (CEL intensiteit bestanden) van de gescande beelden met behulp van de opdrachtenconsole (AGCC, versie 4.1.2).</li>
	<li>De bestanden van de CEL met expressie Console softwareversie 1.4.1 om te berekenen sonde signaal intensiteit, met behulp van de statistische gegevens gebaseerde algoritmen MAS 5.0 met standaardinstellingen en wereldwijde geschaalde uitbreiding als normalisatie methode verder te verwerken. Opmerking: De intensiteit van de bijgesneden gemiddelde doel van elke chip was willekeurig ingesteld op 100. Het uitvoeren van alle experimenten met behulp van ten minste twee onafhankelijke biologische wordt gerepliceerd. Normaliseren van onbewerkte gegevens aan de S. pombe signaal en vouw veranderingen in totale en nieuw samengestelde RNA te berekenen.</li>
</ol>8. de data-analyse met behulp van een bestaande R-pijpleiding
<ol><li>Berekenen van synthese en verval tarieven met behulp van een pijplijn en R/Bioconductor pakket openbaar toegankelijk is, als eerder beschreven8,10.</li>
</ol>

<ol><li>Gardini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Run-On+Sequencing+%28GRO-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).</li>
<li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li>
<li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+elongating+transcript+sequencing+%28NET-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Native elongating transcript sequencing (NET-seq).</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).</li>
<li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li>
<li>Kenzelmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).</li>
<li>Radle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis%2C+processing+and+decay+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+genome-wide+RNA+synthesis+and+decay+rates+with+Dynamic+Transcriptome+Analysis+%28DTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA).</a> Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+eukaryotic+mRNA+degradation+reveals+Xrn1-dependent+buffering+of+transcript+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels.</a> Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+dynamic+transcriptome+analysis+%28cDTA%29+reveals+mutual+feedback+between+mRNA+synthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation.</a> Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Eser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+metabolism+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome.</a> Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).</li>
<li>Baptista, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29932906">SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).</li>
<li>Bonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SAGA+coactivator+complex+acts+on+the+whole+transcribed+genome+and+is+required+for+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription.</a> Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).</li>
<li>Warfield, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+Nearly+All+Yeast+RNA+Polymerase+II-Transcribed+Genes+Is+Dependent+on+Transcription+Factor+TFIID%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID.</a> Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).</li>
<li>Huisinga, K. L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+housekeeping+role+for+TFIID+and+a+highly+regulated+stress-related+role+for+SAGA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+roles+for+the+TFIID+and+SAGA+complexes+in+global+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription.</a> Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).</li>
<li>Lenstra, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+and+topology+of+chromatin+interaction+pathways+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast.</a> Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).</li>
<li>Plaschka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Mediator+core+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex.</a> Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).</li>
<li>Helenius, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+TFIIH+kinase+subunit+Mat1+for+RNA+Pol+II+C-terminal+domain+Ser5+phosphorylation%2C+transcription+and+mRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover.</a> Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Covalent+Inactivation+of+TFIIH-Kinase+Reveals+an+Elongation+Checkpoint+and+Results+in+Widespread+mRNA+Stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization.</a> Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).</li>
<li>Haimovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+is+circular%3A+factors+for+mRNA+degradation+also+foster+mRNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis.</a> Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+RNA+kinetics+using+RATE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq.</a> RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spt5+Plays+Vital+Roles+in+the+Control+of+Sense+and+Antisense+Transcription+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation.</a> Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+RNA+polymerase+II-Paf1C-TFIIS+transcription+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex.</a> Nature Communications. 8, 15741(2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).</li>
<li>Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+NET-seq+analysis+defines+nascent+RNA+profiles+and+associated+RNA+processing+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide.</a> Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).</li>
<li>Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+comprehensive+representation+of+uniqueness+for+next-generation+sequencing+by+minimum+unique+length+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses.</a> PloS One. 8 (1), 53822(2013).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+novel+UPF1+target+transcripts+by+direct+determination+of+whole+transcriptome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability.</a> RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo.+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li>
<li>Palozola, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+transcription+and+waves+of+gene+reactivation+during+mitotic+exit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit.</a> Science. 358 (6359), 119-122 (2017).</li>
<li>Ardehali, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+Repressive+Complex+2+Methylates+Elongin+A+to+Regulate+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription.</a> Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).</li>
<li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+surveillance+by+selective+termination+of+noncoding+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis.</a> Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Duffy, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li>
<li>Rutkowski, A. J., Dolken, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27832537">High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).</li>
<li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li>
<li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li>
<li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Terwijl genoom-brede tools om te analyseren van wijzigingen in de transcriptie nog steeds verbeteren zijn, kan de enige analyse van transcriptome door middel van de kwantificering van de stationaire toestand niveaus van RNA niet nauwkeurig overeen wijzigingen in RNA polymerase II activiteit. Inderdaad, mRNA niveaus worden geregeld, niet alleen door RNA-synthese, maar ook door hun rijping en afbraak. Voor het meten van mRNA-synthese rekken van mRNA afbraak, zijn verschillende protocollen ontwikkeld in de afgelopen jaren v...

Cellen reageren op signalen van endogene en exogene, via de dynamische wijziging van hun gen expressie programma. In de afgelopen jaren kunt een enorme ontwikkeling van genoom-brede methodologieën de nauwkeurige en uitgebreide beschrijving van transcriptome wijzigingen in verschillende omstandigheden. In de meeste studies van de transcriptomic, microarray kruising of high-throughput sequencing worden gebruikt om RNA niveaus van een totale breuk van de stationaire toestand RNA te kwantificeren. Transcriptionele wijzigingen onder een specifieke perturbation kunnen een breed scala van mogelijke uitkomsten, met specifiek gen expressie veranderingen of een groot spectrum van genen up - of werden weergegeven. Genexpressie is het resultaat van een verfijnd evenwicht — of stationaire toestand — tussen RNA synthese van RNA polymerase en andere processen op het gebied van RNA niveaus. RNA polymerase II transcriptie, met inbegrip van haar drie verschillende fasen (initiatie, rek, en beëindiging), is zeer en ingewikkeld gekoppeld mRNA verwerking, cytoplasmatische export, vertaling en afbraak.
Verscheidene recente studies aangetoond dat mRNAs synthese en verval gekoppelde mechanismen en toonde dat transcriptionele effecten bij mutatie of onder prikkels worden over het hoofd gezien kunnen wanneer de totale steady-state RNA te kwantificeren. Ten eerste hangt de detectie van transcriptionele veranderingen door de analyses van de stationaire toestand niveaus van mRNA altijd mRNAs half-life. Zodra de verstoring wordt ingevoerd, zal de steady-state niveaus van mRNAs met lange halfwaardetijd veel minder dan die van mRNAs met korte halfwaardetijd worden beïnvloed. De detecteerbaarheid van de veranderingen in RNA-synthese is daarom sterk bevooroordeeld ten gunste van kortstondige afschriften, terwijl de analyse van langduriger mRNA soorten mislukken te onthullen van dynamische veranderingen in de transcriptie tarief. Ten tweede, verschillende rapporten is gebleken dat zowel in gist en zoogdieren, mondiale veranderingen in de transcriptie worden over het hoofd gezien kunnen bij het analyseren van de niveaus van de stationaire toestand van mRNA. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de mechanismen die link mRNA-synthese en degradatie resulterend in mRNA bufferen. Dit leidde tot de ontwikkeling van nieuwe protocollen te kwantificeren van mRNA-synthese rekken van degradatie, door de analyse van nieuwe getranscribeerde mRNA. In de afgelopen jaren zijn diverse alternatieven ingediend, met inbegrip van mondiale run-on sequencing (GRO-seq)1en inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)2,3. Hier, presenteren we een protocol oorspronkelijk is ontwikkeld in zoogdiercellen4,5,6 en vervolgens aangepast aan gist7,8,9,10, 11, die is gebaseerd op RNA labelen met een thiolated nucleoside of base analoog, 4-thiouridine (4sU) of 4-thiouracil (4tU), respectievelijk.
Deze methode specifiek zuivert nieuw getranscribeerde RNA van cellen in welke RNA zijn pols-aangeduid met 4sU met vrijwel geen inmenging in de homeostase van de cel. Zodra de cellen worden blootgesteld aan 4sU, is het molecuul dus snel uptaken, phosphorylated aan 4sU-trifosfaat, en opgenomen in de RNAs wordt getranscribeerd. Als puls-label, is het mogelijk om uit te pakken van totale cellulaire RNA (overeenkomend met de steady-state niveaus van RNA) en vervolgens de 4sU-geëtiketteerden RNA breuk thiol-specifiek is gewijzigd, wat leidt tot de vorming van een Zwavelbrug tussen Biotine en de nieuw Getranscribeerd RNA4,5. 4sU kunnen echter alleen uptaken door de uiting van een nucleoside-vervoerder, zoals de menselijke equilibrative nucleoside vervoerder (hENT1), voorkomen van het directe gebruik ervan in de ontluikende of kernsplijting gist cellen. Terwijl men kon hENT1 S. pombe of S. cerevisiaeexpress, kan een eenvoudiger aanpak worden bereikt met behulp van de gewijzigde basis 4tU, aangezien de gistcellen kunnen duren van 4tU, zonder de behoefte aan expressie van een nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. In feite, het metabolisme van 4tU de activiteit van het enzym uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) vereist. In verschillende organismen, met inbegrip van gist maar niet zoogdieren, is UPRT essentieel voor een pyrimidine berging traject, uracil aan uridine monofosfaat recycling.
Een belangrijke vertekening in transcriptomic studies kan worden ingevoerd door de normalisatie tussen verschillende monsters geanalyseerd in parallel. Inderdaad, de vele afwijkende factoren kunnen invloed hebben op de vergelijkende analyse van de transcriptome van mutant en wild-type stammen: de efficiency van lysis van de cel, verschillen in de extractie en het herstel van RNA, en afwijkingen in de kalibratie van de scanner voor microarray analyse , onder anderen. Zoals hierboven besproken, kunnen dergelijke variaties vooral misleidend zijn als globale effecten op RNA polymerase II transcriptie worden verwacht. Een elegante betekenen voor het nauwkeurig vergelijken van mRNA synthese tarieven tussen de verschillende monsters werd ontworpen met behulp van de verte verwante kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe als een interne standaard. Daarvoor een vast aantal label S. pombe cellen wordt toegevoegd aan de S. cerevisiae monsters, wild-type of gemuteerde cellen, voorafgaand aan cellysis en RNA extractie10. Vervolgens worden zowel stationaire als nieuw samengestelde RNAs van S. pombe en S. cerevisiae gekwantificeerd door RT-qPCR of via het gebruik van spaanders microarray of high-throughput sequencing10. Het combineren van deze gegevens met kinetische modellering, kan absolute van mRNA-synthese en verval in de ontluikende gist worden gemeten.
In het kader van dit manuscript, zullen we laten zien hoe de analyse van nieuwe getranscribeerde RNA toegestaan te onthullen van een mondiale rol voor de coactivator complexen SAGA en TFIID in RNA polymerase II transcriptie in ontluikende14,15gist, 16. Bovenal afgelopen studies gekwantificeerd steady-state mRNA niveaus in S. cerevisiae en gesuggereerd dat SAGA speelt een overheersende functie op een beperkt aantal gist genen die sterk beïnvloed door mutaties in SAGA, maar relatief resistent tegen TFIID mutaties17,18,19. Verrassend, werden de SAGA enzymatische activiteiten getoond om op te treden op het hele getranscribeerde genoom, suggereren een bredere rol voor deze co activator in RNA polymerase II transcriptie. Verminderde RNA polymerase II recruitment meest uitgedrukte genen werd waargenomen op de inactivering van SAGA of TFIID, suggereren dat deze coactivators samen op de meeste genen werken. Vandaar, de kwantificering van nieuw getranscribeerde mRNA geopenbaard dat SAGA en TFIID nodig voor de transcriptie van bijna alle genen door RNA polymerase II14,15,16 zijn. De toepassing van compenserende mechanismen komt naar voren als een manier voor de cellen om te gaan met een algemene afname van de mRNA-synthese die door een gelijktijdige wereldwijde afname van de aantasting van het mRNA is gebufferd. SAGA toegevoegd aan de lijst van factoren die een globaal effect op RNA polymerase II transcriptie, zoals RNA Pol II subeenheden10, de bemiddelaar coactivator complexe20, de algemene transcriptie factor TFIIH21,22 , en indirect, elementen van de mRNA afbraak machines9,10,23. Dergelijke compenserende evenementen werden universeel waargenomen in SAGA mutanten, administratieve verwerking van de bescheiden en beperkte veranderingen in stationaire toestand mRNA niveaus ondanks een globale en ernstige daling in mRNA synthese14. Soortgelijke analyses werden ook uitgevoerd in een BRE1 schrapping stam, wat resulteert in een volledig verlies van Histon H2B ubiquitination. Interessant is dat kon een veel mildere maar consistent globaal effect op RNA polymerase II transcriptie worden opgespoord in de afwezigheid van Bre1, die aangeeft dat metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA in gist kan detecteren en kwantificeren van een breed scala van veranderingen in mRNA synthese tarieven.

<table><tbody><tr><td>4-Thiouracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Geautomatiseerde celteller</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure RNA-zuiveringskit, gist</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrofotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-vrij Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotine</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Thiolutin</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro;MACS Streptavidin kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor Reverse Transcriptase</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Gistgenoom 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mrna nieuw als een proxy voor rna polymerase ii activiteit

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global gebreken in RNA polymerase II transcriptie kunnen worden overzien door transcriptomic studies analyseren steady-state RNA. Inderdaad, de globale daling in mRNA-synthese is aangetoond te worden gecompenseerd door een gelijktijdige afname van de aantasting van het mRNA om te herstellen van de normale niveaus van de stationaire toestand. De genoom-brede kwantificering van mRNA-synthese, onafhankelijk van mRNA verval, is dus de beste directe reflectie van RNA polymerase II transcriptionele activiteit. Hier bespreken we een methode met behulp geen storing veroorzaakt metabole labeling van ontluikende RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In het bijzonder de cellen worden gekweekt voor 6 min met een uracil analoge 4-thiouracil en de gelabelde nieuw getranscribeerde RNAs worden gezuiverd en gekwantificeerd om te bepalen van de tarieven van de synthese van alle individuele mRNA. Bovendien, met behulp van label Schizosaccharomyces pombe cellen als interne standaard dit toelaat vergelijken van mRNA-synthese in verschillende S. cerevisiae stammen. Met behulp van dit protocol en de gegevens met een dynamisch kinetische model passend, kunnen de bijbehorende mRNA verval tarieven worden bepaald.

Bij het uitvoeren van metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA, verschillende aspecten moeten worden gecontroleerd: de tijd en de efficiëntie van de etikettering, de spike-in verhouding, het protocol van de extractie en de doeltreffendheid van de biotinylation (inclusief signal-to-noise verhouding), onder anderen. Deze voorwaarden zijn uitgebreid en methodisch aangetoond door anderen7,10,11</su...

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het RNA polymerase II activiteit weerspiegelt door het meten van nieuw gesynthetiseerde mRNA die niet worden beïnvloed door RNA afbraak. Dit protocol werd oorspronkelijk beschreven met behulp van microarray hybridisatie, maar kan gemakkelijk worden aangenomen om high-throughout sequencing van nieuw getranscribeerd mRNA. Het aantonen van deze procedure zal Tiago Baptista, een voormalige grad student van ons laboratorium.Na het inenten van de S.cerevisiae cellen, groeien ze 's nachts op 30 graden Celsius met constante agitatie bij 150 RPM. De volgende dag, meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Verdun de cultuur tot een OD600 van ongeveer 0,1 op 100 milliliter YPD-medium.Grow up de cellen tot de OD600 is ongeveer 0,8. Meet hierna de OD600 van de S.pombe overnight cultuur. Verdun deze cultuur tot een OD600 van ongeveer 0,1 op 500 milliliter YAS-medium en laat het opgroeien tot de OD600 ongeveer 0,8 is.Bereid eerst een nieuwe oplossing voor van twee kiesvierthiosacil. Houd de voorbereide oplossing op kamertemperatuur en beschermd tegen licht. Voeg de vier-thiouracil oplossing toe aan de S.cerevisiae en S.pombe culturen zodanig dat de uiteindelijke concentratie vijf millimolar is.Incubeer de S.cerevisiae en S.pombe culturen op 30 graden Celsius en 32 graden Celsius respectievelijk met constante agitatie gedurende zes minuten. Verwijder hierna een klein aliquot van elke cultuur en tel de cellen met behulp van een automatische celteller of een Neubauer-kamer. Centrifuge op 2, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen te verzamelen.Gooi de supernatant weg en was de cellen een keer ijskoud. Centrifuge opnieuw op 2, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Vervolgens, resuspend de cellen in vijf milliliter ijskoud een keer PBS.Meng de S.cerevisiae en S.pombe cellen met een verhouding van drie tegen een. Centrifugeren de gemengde monsters op 2, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de PBS en flash bevriezen van de cellen in vloeibare stikstof.Bewaar het monster op negatieve 80 graden Celsius tot het gebruiksklaar is. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, ontdooien de cellen op ijs voor ongeveer 20 tot 30 minuten. Gebruik een aangepaste gist RNA extractie kit om het RNA te extraheren zoals beschreven in het tekstprotocol.Breng hierna de filtercartridge over naar de laatste opvangbuis. Elute het RNA met 50 microliters van DEPC-behandeld RNase-vrij water dat werd voorverwarmd tot 100 graden Celsius. Centrifuge op 16.000 keer g voor een minuut.Gebruik vervolgens 50 microliter voorverwarmde DEPC-behandeld rnase-vrij water om het RNA weer aan dezelfde buis te ontwijken. Centrifuge op 16.000 keer g gedurende een minuut om ervoor te zorgen dat het volledige monstervolume door het filter is gegaan. Als dat niet het niet is, centrifuge opnieuw voor een langere periode van tijd.Wanneer u klaar bent, kwantificeert en controleert u de zuiverheid van het monster met behulp van de juiste apparatuur. Gebruik dePC-behandeld nuclease-vrij water om de concentratie van het eerder verworven RNA aan te passen aan twee milligram per milliliter. Aliquot 200 microgram van totale RNA en verwarm het bij 60 graden Celsius gedurende 10 minuten.Onmiddellijk chill het op ijs gedurende twee minuten. Voeg 600 microliter met DEPC-behandeld RNase-vrij water toe. Voeg 100 microliters biotinylation buffer toe en voeg vervolgens 200 microliter biotine HPDP toe.Als de biotine HPDP-oplossing uit de oplossing neerslaat, verhoogt u het volume dmso of DMF tot 40% van het reactievolume zoals beschreven in het tekstprotocol. Bescherm het monster tegen licht en broed het drie uur lang op kamertemperatuur met zachte agitatie. Voeg hierna een ongeveer gelijk volume chloroform aan de buizen toe en meng krachtig.Centrifuge op 13.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng vervolgens de bovenste fase voorzichtig over in nieuwe twee milliliterbuizen. Voeg een hoeveelheid van vijf molaire natriumchloride toe die gelijk is aan ongeveer 1/10 van het monstervolume.Meng vervolgens het monster. Verwarm eerst het biotinylated RNA op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Dan chill de monsters op ijs gedurende vijf minuten.Voeg 100 microliters met streptavidin-gecoate magnetische kralen toe aan het biotinylated RNA. Incubeer bij kamertemperatuur met lichte schudden gedurende 90 minuten. Plaats de kolommen voorzien van de kit in de magnetische standaard.Voeg vervolgens 900 microliters van de wasbuffer op kamertemperatuur toe aan de kolommen. Breng het mengsel van 200 microliterkraal en RNA aan op de kolommen. Verzamel de flow-through in 1,5 milliliter buizen en breng het vervolgens opnieuw aan op dezelfde magnetische kolom.Houd deze flow-through indien nodig als het vertegenwoordigt de niet-gelabelde RNA-fractie. Om te beginnen met RT-qPCR validatie van de verschillende fracties, eerst synthetiseren cDNA zoals beschreven in de tekst. Versterk vervolgens de cDNA door real-time qPCR met behulp van een standaardprotocol.De gemeten niveaus van transcripties in fracties gezuiverd uit wild-type cellen gekweekt met en zonder vier-thiouracil bevestigde deze procedure specifiek zuivert gelabeld RNA. Analyse van de spt20 delta stam blijkt dat de hoeveelheid van de totale steady-state RNA is grotendeels ongewijzigd of is slechts licht verminderd voor de geteste genen. Vergelijkbare resultaten worden gezien voor stammen geschrapt voor bre1.Echter, analyse van nieuw getranscribeerd RNA in de spt20 delta stam blijkt een drie tot vijf keer daling van de mRNA synthese voor alle geteste genen. Ondertussen leidt het verlies van bre1 tot een discretere maar nog steeds zichtbare afname. Bij inducible uitputting van spt7, een structurele subunit van de saga complex, nieuw getranscribeerd mRNA niveaus worden verminderd tot een mate vergelijkbaar met de verwijdering stam.Wanneer de totale RNA-niveaus worden gemeten door genoombrede analyse, worden slechts een paar genen gezien om hun expressieniveaus te laten veranderen bij het verwijderen van spt20, hetzij door omhoog te reguleren of naar beneden te reguleren. Echter, analyse van de nieuw getranscribeerde RNA blijkt dat de niveaus van meer dan 4, 000 genen zijn aanzienlijk verminderd ten minste twee keer na verwijdering van spt20 die een wereldwijd positief effect van saga op RNA polymerase II transcriptie in ontluikende gisten suggereert. Hoewel deze methode inzicht kan geven in transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, werd het alleen toegepast met kleine variaties op Door dit protocol te gebruiken, konden we een globale afname van de mRNA-synthese detecteren die werd gecompenseerd door een wereldwijde afname van mRNA-afbraak.

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Totaal cellulair RNA verschaft een slechte template voor het bestuderen korte termijn veranderingen in RNA synthese en verval en de kinetiek van RNA processing. We beschrijven hier metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine gevolgd door thiol-specifieke biotinylering en zuivering van nieuw getranscribeerde RNA waardoor deze beperkingen te overwinnen.

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Het steady state niveau van specifieke mRNA's wordt bepaald door de snelheid van synthese en afbraak van het mRNA. Genoom-brede mRNA degradatie tarieven of de vervalsnelheid van specifieke mRNA's kan worden gemeten door het bepalen van mRNA halfwaardetijden. Dit protocol richt zich op het meten van mRNA vervalsnelheden in Saccharomyces cerevisiae.

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Het gebruik van gethioleerd uracil om gevoelig en specifiek zuivert nieuw Getranscribeerd RNA van de gist Saccharomyces cerevisiae.

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.

Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

RNA secundaire structuur is voornamelijk waargenomen in rijp RNA met structuurprobingmethoden. Co-transcriptionele structuurvolgsequencing (CoSTseq) verenigt nucleaire run-on, die is gebruikt om de positie van polymerase op beginnend RNA te bestuderen, met structuuronderzoek. CoSTseq maakt hiermee observatie mogelijk van de secundaire structuur van RNA in RNA onder actieve transcriptie.

Vergelijkende RNA-structuuranalyse van ontluikende en rijpe transcripten in Saccharomyces cerevisiae

Leer hoe je metabole labelen met 4-thiouracil toepast om nieuw gesynthetiseerd mRNA in Saccharomyces cerevisiae te kwantificeren. Deze methode meet nauwkeurig RNA polymerase II activiteit.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit (Video) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Meer video's verkennen