Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in elk onderzoeksgebied waar fosforylatiesignalen van belang zijn, zoals in de kankeronderzoekssector om veranderingen in signaalnetwerken na therapeutische resistentie te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat duizenden fosfopeptiden op een relatief eenvoudige en goedkope manier kunnen worden geïdentificeerd om het fosfoproteoom globaal te beoordelen. Om tumorweefsel te oogsten, weegt u de tumor af en voegt u in een kweekbuisje twee milliliter ijskoud lysisbuffer toe voor elke 100 milligram weefsel.

Gebruik vervolgens een handbediende of tafelhomogenisator om het lysaat te homogeniseren. Om het monster te verdunnen en alcoholaat, verwarmt u de buis gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius, koelt u het monster vervolgens 15 minuten op ijs. Terwijl het nog op ijs is, sonificeert u het lysaat drie keer en verwarmt u het monster vervolgens gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius.

Plaats de sonicatiebuis in een schommelende emmerrotor en centrifugeert u het lysaat bij 3.500 g en 15 graden Celsius gedurende 15 minuten, verzamelt u vervolgens het supernatant en gooit u de pellet weg. Gebruik 100 millimolair tris om het lysaat te verteren, verdun het monster 12-voudig om de hoeveelheid guanidinium te verminderen. Voeg voor vijf milligram eiwit 10 microgram lysyl endopeptidase of lys-C toe en incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende vijf tot zes uur.

Bereid een milligram per milliliter TPCK-behandeld trypsine in één millimolair HCL met 20 millimolair calciumchloride en trypsine toe met een verhouding van één op 100 trypsine tot eiwit. Incubeer het monster gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens een extra aliquot trypsine toe aan de buis en incubeer het monster gedurende een nacht bij 37 graden Celsius.

Voeg het monster toe aan een 15 milliliter 10 kilodalton afsnijfilter. Centrifugeer het monster in een schommelende emmer of vaste hoekrotor bij 3.500 g en 15 graden Celsius tot het retentatevolume minder dan 250 microliter is. Verzamel vervolgens de doorstroming en gooit u het retentate weg.

Om het monster te verzuren, voegt u ongeveer 20 microliter 5%Trifluoroazijnzuur of TFA per milliliter lysaat toe. Meng de buis goed en gebruik een pH-strip om de pH te meten. Voeg indien nodig extra 5%TFA toe om de pH op 2,5 aan te passen.

Verbind vervolgens het kortere uiteinde van een C18-kolom met een vacuümmanifold. Nadat u de vacuüm tussen 17 en 34 kilopascals heeft ingesteld, gebruikt u drie milliliter 100% acetonitril en een glazen pipet om de kolom nat te maken. Equilibreert u de kolom door een glazen pipet te gebruiken en twee drie milliliter aliquots van 0,1% TFA toe te passen.

Laad vervolgens het verzuurde monster op de kolom. Gebruik drie drie milliliter volumes van 0,1 TFA om de kolom te wassen. Breng vervolgens twee milliliter 40%ACN 0,1%TFA aan om het monster te elueren en verzamel twee twee milliliter fracties in glazen kweekbuisjes.

Bedek de eluentbuisjes met parafilm en gebruik een 20 gauge naald om drie tot vijf gaten in de deksel te prikken voordat u de monsters overnacht lyofiliseert. Resuspendeer het lyofilisaat met 0,5 milliliter ijskoud immunoprecipitatie- of IP-bindingsbuffer in elke fractie. Breng het 0,5 milliliter resuspenderingsvolume van de tweede fractie over naar de buis met de eerste fractie en bewaar de pipettepunt.

Gebruik nog eens 0,5 milliliter IP-buffer om elke lyofilisatiebuis te spoelen voordat u de inhoud overbrengt naar de cryobuis, herhaal vervolgens de spoeling met twee milliliter IP-buffer. Nadat u een P200 met een afgesneden punt heeft gebruikt om de 0,5 milligram per milliliter voorraad van antilichaamkraaloplossing over te brengen naar de microfugebuis, voegt u 450 microliter ijskoud IP-bindingsbuffer toe om 50 microliter 4G10 antilichaamkraaloplossing en 25 microliter 27 B10.4 antilichaamkraaloplossing in een microfugebuis te wassen. Centrifugeer de buis bij 100 g en vier graden Celsius gedurende één minuut.

Na het afzuipen van de supernatant, voegt u een gelijk volume toe als de oorspronkelijke slurry van IP-bindingsbuffer om de kralen te resuspenderen. Voeg voorgewassen pY-kralen toe aan de resuspendeerde monsteroplossing in de schroefkap cryobuisjes en incubeer ze vervolgens gedurende een nacht op een eind-over-eind rotator bij vier graden Celsius. Na het spinnen van de kralen, bewaart u het supernatant dat zal worden gebruikt om pST-peptiden te verrijken.

Gebruik vervolgens 300 microliter IP-bindingsbuffer om de kralen te resuspenderen en breng ze over naar een twee milliliter microcentrifugebuis. Spin de monsters gedurende één minuut bij 100 g en vier graden Celsius. Was vervolgens de kralen drie keer met 500 microliter IP-bindingsbuffer.

Was de kralen vier keer met 450 microliter 25 millimolair ammoniumbicarbonaat pH 7,5. Dompel een gel-laadtip iets onder het kraaloppervlak en zuig het supernatant volledig af. Voeg vier keer het kraalvolume van 0,1% TFA toe aan de kralen.

Meng ze vervolgens goed en incubeer de buis gedurende 15 minuten in een thermomixer bij 1.000 rpm en 37 graden Celsius. Breng de resuspendering over naar een 0,2 micrometer spinfilter en centrifugeert u het filter gedurende één minuut bij 850 g. Na het overbrengen van de elutie naar een laag-eiwitbindende microcentrifugebuis, concentreert u het eluaat tot droogheid bij 40 graden Celsius met een hittetijd van 300 minuten gedurende een nacht.

Om de titaniumoxidekralen in de tips voor te bereiden, voegt u 200 microliter 100%ACN toe. Draai het dan om en klik op het smalle uiteinde om de vloeistof naar de dop te bewegen. Snijd de punt af met een scheermes en plaats hem over de laag-eiwitbind