Een volumetrische methode voor de kwantificering van cerebrale Vasospasm in een lymfkliertest Model van subarachnoïdale bloeding
28 juli 2018
Het doel van dit artikel is het presenteren van een methode waarmee een 3-dimensionale reconstructie van de cerebrovasculaire boom in muizen nadat micro berekende tomografie en bepaling van de hoeveelheden van hele schip segmenten die kunnen worden gebruikt voor het kwantificeren van cerebrale vasospasm in lymfkliertest modellen van subarachnoïdale bloeding.
Het algemene doel van deze procedure is om cerebrale vasale spasmen bij muizen te kwantificeren na inductie van subarachnoïdale bloeding. Dit wordt bereikt door het dier te onderwerpen aan transcardiale perfusie en endovasculair casting, met behulp van een radiopaque castingmiddel. De volgende stap is om dwarsdoorsnedebeeldgegevens te verkrijgen, door de hersenen te onderwerpen aan microcomputertomografie.
Vervolgens worden beeld- en gegevens verwerkt. Miro-software wordt gebruikt om de intracraniële vaatboom virtueel te reconstrueren en om volumes van gedefinieerde vaatsegmenten te berekenen, die een objectieve maatstaf vormen om vaatspasmen te kwantificeren. Subarachnoïdale bloeding wordt bij muizen geïnduceerd door endovasculaire filamenperforatie onder anesthesie met Isoflurane.
De linker externe halsslagader wordt chirurgisch voorbereid. Vervolgens wordt een filament in de externe halsslagader ingebracht en intracraniaal gevorderd via de interne halsslagader, die wordt geperforeerd bij de carotidstroom, waardoor de subarachnoïdale bloeding wordt geïnduceerd. Een stijging van de intracraniële druk wordt gezien als een indicator van succesvolle endovasculaire perforatie.
Om vasale spasmen te analyseren, induceert u anesthesie. Ga pas verder nadat er een voldoende anesthesieniveau is bereikt, wat wordt bevestigd door de afwezigheid van reacties op pijnstimuli. Voer een transcardiale perfusie uit met behulp van de volgende oplossingen.
Een fysiologische zout oplossing die de fysiologische concentraties natrium, kalium, calcium en magnesium bevat bij een pH van zeven punt vier. En daarna, een 4% PFA-oplossing. Start de infusie met oplossing nummer één gedurende twee minuten en ga verder met oplossing nummer twee gedurende vier minuten.
Infundeer de oplossingen op een temperatuur van 37 graden Celsius en gebruik een drukgestuurde pomp met een variabele perfusiesnelheid om met een constante druk van 70 millimeter kwik te perfunderen. Vermijd drukverlies bij het schakelen van oplossing één naar oplossing twee. Na perfusie met beide oplossingen, zet de perfusie gedurende 20 minuten voort bij kamertemperatuur met een radiopaque castingmiddel met een constante snelheid van twee milliliter per minuut.
Houd het monster gedurende de nacht op vier graden Celsius voor het uitharden van het radiopaque castingmateriaal. Verwijder de hersenen en bewaar het monster op vier graden Celsius in een 4% PFA-oplossing tot micro-setisiny. Plaats de hersenen in het midden van een plastic buis met een stomp anatomisch forceps.
Kies een buis met een iets grotere diameter dan het monster, om ervoor te zorgen dat het object zich tijdens de beeldvorming niet verplaatst. Gebruik gaas om de buis te sluiten. Bevestig de plastic buis via de micro stepping motor van het computergestuurde controlepositioneringssysteem in de röntgencabine, waarin het object rond zijn horizontale as wordt geroteerd.
Lign het monster in het gezichtsveld onder röntgenradiografie. Om de maximale vergroting te bereiken, plaats het object zo dicht mogelijk bij de röntgenbron en maximaliseer de afstand tot de detector zoveel mogelijk. Gebruik een step and shoot beeldvormingsprotocol met de volgende scanparameters.
Stel de belichtingstijd in op één seconde voor elke projectie en gebruik een buisspanning van 80 kilovolt om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren. Stel het aantal projecties in op 1.000 voor één rotatie. Voor reconstructie van ruwe gegevens, gebruik het gefilterde terugprojectiealgoritme, wat de Shepp-Logan filter impliceert met een matrix van 1.024 kubieke voxels.
Importeer DICOM-gegevens in een Miro-software met behulp van de functie importeren. Visualiseer het vaatbed met de functie vol-run. Kies de visualisatiedrempel zodat de grote cerebrale slagaders in scherpe contouren worden weergegeven.
Het is belangrijk om dezelfde visualisatiedrempel te gebruiken voor alle datasets die tot de experimentele serie behoren. Ontleed virtueel de basale cerebrale slagaders van de Cirkel van Willis, met een functievolume toegevoegd door de vaten met de cur-zon te omringen. Ontleed vervolgens het te analyseren vaatsegment virtueel.
Draai daarom het driedimensionale model van het vaatbed om alle kleine takken nauwkeurig te scheiden van de hoofdslagader. Het is essentieel voor de verdere analyse om alle vaten te verwijderen, behalve het te analyseren vaatsegment. Pas de functie auto-skelet toe met een drempel ingesteld op de visualisatiedrempel, die een centrale lijn genereert, gebaseerd op een ruimtelijk grafiek.
Pas vervolgens de functie ruimtelijk grafiek toe op lijnenset, om een lijnenset te creëren. Verdeel de lijnenset in zijn enkele subsegmenten door de enkele subsegmenten handmatig te kiezen met de cursor en op splitsen te klikken. Deze stap is cruciaal om de volumes van de enkele subsegmenten te berekenen.
Gebruik de functie lijnenset naar ruimtelijk grafiek om opnieuw een ruimtelijk grafiek te creëren. Gebruik de functie ruimtelijk grafiek statistieken om lengte, volume en diameter van elk subsegment te bepalen. Gebruik voor kleurcodering, die het verloop van de vaatdiameter weergeeft, de functies ruimtelijk grafiek weergave.
Stel de segmentkleuring in op dikte, wat correleert met de vaatdiameter. Het is belangrijk om dezelfde kleurenkaart te kiezen voor alle datasets die tot de experimentele serie behoren. Tel de lengtes van de subsegmenten om te bepalen welke subsegmenten in de verdere analyse moeten worden opgenomen.
In de huidige studie hebben we een vaatsegment geëvalueerd dat bestaat uit één millimeter van de interne halsslagader, proximaal van de carotidstroom, en twee punt vijf millimeter van de cerebrale slagader distaal van de carotidstroom. Tel vervolgens de volumes om het vaatvolume van het gedefinieerde vaatsegment te bepalen. Om de nauwkeurigheid van de virtuele reconstructie van het vaatbed te beoordelen, hebben we de diametergebaseerde vergelijking uitgevoerd tussen vaatdiameters bepaald onder microscoop en uit de 3D virtuele reconstructies op twee anatomisch gedefinieerde punten in tien hersenmonsters.
Voor microscopische bepaling van vaatdiameters werd een hoge resolutie camera, software kalibratietool, micrometer schalen gebruikt, er waren geen significante verschillen tussen de diameters bepaald onder microsco
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor 3D-reconstructie van de cerebrovasculaire boom bij muizen met behulp van micro-computertomografie om cerebrale vasospasmen na een subarachnoïdale bloeding te kwantificeren. De techniek combineert transcardiale perfusie, endovasculaire casting en geavanceerde beeldbewerking om vaatvolumes te meten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Cerebrovasculair onderzoek
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Cerebraal vasospasme is een kritieke complicatie na een subarachnoïdale bloeding.
- Inzicht in de vasculaire responsen is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- 3D-reconstructie kan inzicht bieden in vasculaire veranderingen en de ernst van het vasospasme kwantificeren.
- Huidige methoden kunnen tekortschieten in de precisie bij het meten van vaatveranderingen na het letsel.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare techniek vast te stellen voor het kwantificeren van cerebrale vasospasmen bij muizen.
- Om het begrip van cerebrovasculaire veranderingen na een subarachnoïdale bloeding te verbeteren.
- Om een objectieve beoordeling van de vasculaire morfologie en functie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- De studie maakte gebruik van micro-computertomografie voor de beeldvorming van het cerebrale vaatstelsel.
- De muizen werden onderworpen aan endovasculaire casting na het opwekken van een subarachnoïdale bloeding.
- De belangrijkste stappen omvatten transcardiale perfusie met fysiologische oplossingen en radiopake castingmiddelen.
- De beelden en gegevens werden verwerkt met Miro-software om vaatstructuren te visualiseren en te analyseren.
- Nauwkeurige metingen van vaatdiameters werden vergeleken tussen microscopische en virtuele reconstructies.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakte een nauwkeurige 3D-reconstructie van de intracraniale vasculaire boom mogelijk.
- Er was geen significant verschil in de metingen van de vatdiameter tussen microscopische en virtuele methoden, wat duidt op een hoge nauwkeurigheid.
- Analyse van vaatsegmenten leverde objectieve metrieken op voor het beoordelen van de ernst van het vasospasme.
- De studie benadrukte het belang van gestandaardiseerde beeldvormingsdrempels voor consistentie tussen datasets.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een nieuwe, nauwkeurige methode voor het beoordelen van cerebrale vasospasmen in muismodellen.
- Het verbetert de mogelijkheden voor het kwantificeren van vasculaire veranderingen na een hemorragisch letsel.
- De bevindingen hebben belangrijke implicaties voor het begrijpen van cerebrovasculaire dynamiek en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het kwantificeren van cerebrale vasospasmen in preklinische modellen blijft een kritieke uitdaging bij de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen beroertes, waarbij objectieve vasculaire metrieken nodig zijn om mechanistische hypothesen te valideren en go/no-go-beslissingen te ondersteunen. Deze volumetrische methode biedt een reproduceerbare, op beeldvorming gebaseerde uitlezing die het voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie verhoogt door verder te gaan dan diametermetingen op één punt naar een geïntegreerde analyse van vaatsegmenten. De toepassing ervan in muizische SAH-modellen maakt een gestandaardiseerde beoordeling van vasculaire pathologie mogelijk, wat de translationele continuïteit ondersteunt van de ontdekkingsfase tot de preklinische evaluatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door objectieve volumetrische metrieken van cerebraal vasospasme te bieden als pathofysiologisch eindpunt.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door nauwkeurige 3D-reconstructie van de cerebrovasculaire boom, waardoor de afhankelijkheid van indirecte metingen of metingen op een enkel punt wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door vasculaire veranderingen over volledige vaatsegmenten te kwantificeren, wat de correlatie met functionele uitkomsten in ziekterelevante systemen verbetert.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten van het vatvolume die een betrouwbare vergelijking tussen experimentele condities in vasospasme-modellen mogelijk maken.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbare workflow waarin transcardiale perfusie, endovasculaire casting en micro-CT-beeldvorming worden gecombineerd voor een consistente vasculaire fenotypering.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform in verschillende studies door vaste visualisatiedrempels en segmentatieprotocollen te handhaven voor longitudinale of comparatieve analyses.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt vasculaire kwantificatie in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door een ziekterelevante systeem te bieden dat de klinische pathologie van vasospasmen weerspiegelt.
- Mechanistische Risicoreductie: Maakt een objectieve beoordeling van de ernst van het vasospasme mogelijk, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over de voortgang in preklinische pipelines ondersteunt.
- Predictieve Betrouwbaarheid: Volumetrische evaluatie vertoont een grotere sensitiviteit voor vasospastische veranderingen dan metrieken die enkel op diameter zijn gebaseerd, waardoor de voorspellende waarde van preklinische bevindingen wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase, assay-gereedheid bij screening en validatie van vasculaire fenotypes in translationeel onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door vasospasme te kwantificeren als een meetbare biologische respons op een subarachnoïdale bloeding.
- Screening: Levert assay-ready, kwantitatieve vasculaire resultaten met een hoge reproduceerbaarheid, wat betrouwbare vergelijkingen tussen verbindingen of genotypen mogelijk maakt.
- Analytics: Biedt volumetrische metingen, lengte- en diametergegevens op basis van ruimtelijke grafiekstatistieken, waardoor multidimensionale read-outs beschikbaar zijn voor de vergelijking van condities.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij de preklinische continuïteit door ziekterelevante vasculaire metrieken te leveren die kunnen bijdragen aan effectiviteitsbeoordelingen die zijn afgestemd op biomarkers.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd platform voor vasculaire kwantificering dat toepasbaar is op meerdere cerebrovasculaire letselmodellen buiten SAH.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door objectieve, volumetrische kwantificering van cerebrale vasospasmen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via vaste imaging-drempelwaarden, perfusieprotocollen en semi-geautomatiseerde 3D-reconstructieworkflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in vasospasme-modellering te verminderen, waardoor het biologische risico in een laat stadium wordt verlaagd.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van robuuste preklinische vasculaire fenotypegegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, perfusietechnieken en de bediening van micro-CT voor succesvolle vasculaire casting en beeldvorming.
- Is afhankelijk van toegang tot microcomputertomografiesystemen en 3D-visualisatiesoftware (bijv. Miro) voor beeldverwerving en analyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van visualisatiedrempels en segmentatieprotocollen om consistentie tussen experimentele groepen te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende vaatsegmenten of modelsystemen, gevalideerd door op diameter gebaseerde nauwkeurigheidscontroles.
- Wordt beperkt door het ex vivo karakter van de assay, die de eindpunt-vasculaire morfologie vastlegt, maar niet de real-time dynamische progressie van vasospasmen.
