CRISPR gids RNA klonen voor zoogdieren systemen

Deze methode maakt het mogelijk voor het gemak van het creëren van gids RNA expressie plasmiden voor CRISPR-gefaciliteerde experimenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat klonen kan worden uitgevoerd in een enkele stap en gekoppelde gids RNAs kan worden gemaakt met behulp van single-guide RNA expressie plasmiden. Om met dit protocol te beginnen, verdun de lyophilized primers in 1X TE-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar.

Aliquot een gelijke hoeveelheid voorwaartse en omgekeerde primers in PCR stripdopbuizen. Vortex om te mengen. Draai vervolgens gedurende 15 seconden de 100-ly g-mengsels van de geleide RNA oligonucleotide naar beneden.

Broed de reactie vijf minuten bij kamertemperatuur uit voordat u de ligatie instelt. Voeg tussen één en vijf microgram van de geselecteerde PSB700-geleidingsexpressvector toe aan BSNB1 met behulp van 0,5 microliter BSNB1 per één microgram vector. Voeg gedestilleerd water toe tot het totale volume 40 microliters is en voer de spijsvertering gedurende een uur uit bij 55 graden Celsius.

Voer de spijsverteringsproducten uit op een 1,5% laag smeltende agarosegel. Knip de verteerde vectorbackboneband uit die overeenkomt met een fragment van ongeveer 9 kilobasissen in grootte. Breng deze gelschijfje over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Met behulp van een commerciële gel-zuivering kit, extract het DNA uit de agarose gel volgens de instructies van de fabrikant. Verdun vervolgens het DNA in 10-15 microliter te TE-buffer om een geconcentreerde elute te verkrijgen. Wanneer klaar om ligatie uit te voeren voeg 15 microliter van gedestilleerd water aan een flacon toe.

Voeg 1 microliter van de eerder geannealed gids RNA oligonucleotiden, een microliter van de BSNB1 verteerd PSB700 gids expressie vector en 2 microliters van 10XT4 DNA ligase reactie buffer. Meng deze oplossing vervolgens door te vortexen. Voeg een microliter van DNA ligase en vortex weer.

Draai de oplossing 100 keer G naar beneden gedurende 15 seconden. Incubeer de reacties bij kamertemperatuur 's nachts om ervoor te zorgen dat een geen insert negatieve controlereactie die een BSNB1 verteerde vector alleen zonder een geannealed gids RNA oligote insert heeft. Om te beginnen, verwijder E.coli uit de opslag bij min 80 graden Celsius en ontdooi het op ijs gedurende 5 tot 10 minuten.

Voeg 0,5 microliter van het bereide reactiemengsel toe aan acht microliter van competente E.coli. Houd het mengsel 30 minuten op ijs. Verhit het mengsel 45 seconden op 42 graden Celsius.

Laat het mengsel vervolgens twee minuten op ijs rusten. Met behulp van een roterende shaker, herstellen van de cultuur in 250 microliters van SOC media met behulp van de voorwaarden hier vermeld voor NEB DH5a of NEB Stables. Daarna plaat 80 microliter van de cultuur op een geschikte antibioticaresistentie lysogeny bouillonplaat.

Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius voor NEB DH5a of bij 30 graden Celsius voor NEB Stables. Gebruik om te beginnen het speciale PCR-protocol van Phusion GC om het benodigde fragment te maken zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer dit PCR-product uit op een 1%agarose gel en controleer of één band wordt gezien op ongeveer 490 basisparen.

Met behulp van een gel extractie kit gesneden en extract dit PCR product. Dan aliquot een voorbereide 1X master mix in PCR buizen. Met behulp van een multi-channel pipet om een microliter van het PCR-product toe te voegen met een concentratie van 40 femtomoles per microliter.

Voeg in één microliter van de PSB700-vector een concentratie van 40 femtomoles per microliter toe. Neem een no insert controle met behulp van een microliter van water in plaats van de gids RNA oligonucleotiden. Verteren de vector en ligate de inserts in één reactie met behulp van het Golden Gate-protocol dat in het tekstprotocol wordt beschreven.

Na de eerste gouden poortreactie voeg een extra 0,5 microliter van het BSNB1 enzym toe aan elke reactie. Zet de reactie op 55 graden Celsius gedurende een uur voort. Wanneer de golden gate reactie is voltooid ga naar de eerder beschreven E.coli transformatie proces.

In deze studie worden rna-expressievectoren met één gids met succes gemaakt met behulp van twee methoden. In de eerste methode wordt de vectorbackbone voorgeïnteerd en geligat in een reeks korte oligonucleotiden. De tweede methode gebruikt gouden poort klonen om tegelijkertijd verteren en ligate in een enkele reactie.

Gekoppelde gids RNA uitdrukken vectoren, elk gedreven door zijn eigen onafhankelijke promotor worden met succes gemaakt door het klonen van een aangepaste PCR fragment. Succesvol klonen voor een van deze methoden zal resulteren in het verschijnen van aanzienlijk meer kolonies voor transformaties met de juiste insert DNA in vergelijking met de no insert control plate. Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om geen insert besturingselementen op te nemen in uw kloon stap.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals epigenome engineering worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals welke effecten chromatinehandtekeningen hebben op genexpressie.