Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Deze methode kan hebben antwoord op belangrijke vragen in de alvleesklier eilandje veld over pancreas eilandje lijn differentiatie, rijping, en de regeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt het verzamelen van enkele pancreas eilandje cellen voor de generatie van hoge kwaliteit eencellige RNA sequencing gegevens. De toepassing van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van diabetes en de andere pancreas endocriene gerelateerde ziekten door de transcriptomische analyse van pancreas endocriene enkele cellen op de pathologische omstandigheden.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het inbrengen van de naald in het smalle galkanaal van de alvleesklier voor de perfusie lastig kan zijn. Voor embryonale dag 17,5 embryo's. Na het openen van de buikholte, gebruik elleboog pincet om het viscerale weefsel over te dragen aan een zes centimeter zwarte bodem schotel met koude PBS.

Gebruik tangen om de alvleesklier los te maken van het viscerale weefsel. En plaats het alvleesklierweefsel in een 20 milliliter flesje met vijf milliliter koude collagenase oplossing. Voor post natalale dag nul tot 15 muizen, zorgvuldig ontleden alle lobben van de alvleesklier voor het plaatsen van het weefsel in de collagenase.

Voor postnatale dag 18 tot 60 muizen, eerst verwijderen van de xiphoid en extract van de darm aan de rechterkant van de buikholte. Duw de linker en rechter mediale lobben van de lever aan elke kant om de galblaas en de gemeenschappelijke galwegen bloot te stellen. En klem de twaalfvingerige darm met een paar kleine vatklemmen op de bovenste en onderste posities om de plaats waar de galbuis de twaalfvingerige darm binnenkomt te flankeren.

Laad vervolgens een 5 milliliter spuit uitgerust met een 30-meter naald met koude collagenase oplossing. En gebruik de microscoop om de naaldpunt in de galblaas te steken. Zorgvuldig en soepel manipuleren van de naald door de gemeenschappelijke galbuis.

En druk de zuiger om de alvleesklier te doorsnee met een tot vijf milliliter van de collagenase oplossing volgens de grootte van de muis. Wanneer alle oplossing is geperfundeerd, gebruik tangen om de alvleesklier onmiddellijk over te brengen naar een 20 milliliter flacon met vijf milliliter verse koude collagenase oplossing. Wanneer alle alvleesklierweefsel is verzameld, plaats de flacon in een 37 graden Celsius waterbad gedurende drie minuten, gevolgd door drie tot vijf minuten van zachte schudden.

Vervolgens filter het verteerde product door een 0,25 millimeter nylon zeef in een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis. En gebruik een 20 milliliter spuit met ijskoude PBS om de zeef grondig te wassen. Voor postnatale dag 18 tot 60 pancreata, centrifugeren het gefilterde monster en resuspend het weefsel in 30 milliliter koude PBS.

Decanteer vervolgens de weefselsuspensie in een zwarte bodemschotel van zes centimeter en gebruik een pipet van 200 microliter en een ontledende microscoop om de eilandjes te plukken voor overdracht in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met een klein volume koude PBS. Voor embryonale dag 17,5 postnatale dag 15 pancreata, centrifugeren het gefilterde pancreasweefsel en resuspend de pellet in trypsin-EDTA oplossing voor een vier minuten incubatie in een 37 graden Celsius waterbad. Probeer aan het einde van de incubatie de pellet voorzichtig een minuut te beoordelen met een pipet van 200 microliter, gevolgd door de toevoeging van 0,5 keer het volume koud foetaal runderserum met een zachte vortexing om de spijsvertering te stoppen.

Verzamel vervolgens de vertering door centrifugatie en resuspend de cellen in 200 microliters van FACS buffer in een 5 milliliter FACS buis voor het sorteren door stroom cytometrie. Voor eencellige picking en lysis, aliquot vers bereide cel lyse buffer in acht strip PCR buizen, en de overdracht van een enkele cel in elk. Vortex de monsters om de cellen lyse voor het vrijkomen van het RNA, gevolgd door centrifugatie gedurende 30 seconden op vier graden Celsius, en onmiddellijke opslag op ijs.

Voor omgekeerde transcriptie, incubeer de lysates gedurende drie minuten op 72 graden Celsius, gevolgd door een minuut op ijs. Vercentrifugeren de monsters kort gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius en voeg 5,7 microliter omgekeerde transcriptiemix toe aan elk monster om het totale volume op 10 microliter voor elk monster te brengen. Na zachte vortexing en centrifugatie, laad de monsters in een thermocycler en start het omgekeerde transcriptieprogramma.

Voor polymerase kettingreactie voorversterker, of PCR, voeg 15 microliters van PCR mix aan elk monster met de eerste streng reacties, gevolgd door zachte vortexing en centrifugatie. Laad vervolgens de monsters in de thermocycler en start het PCR-programma. Voor PCR-zuivering, voeg 25 microliter van geresuspended DNA-zuivering kralen aan elk monster, en meng goed door vortexing.

Draai vervolgens snel de monsters op kamertemperatuur om de vloeistof te verzamelen terwijl de afwikkeling van de kralen wordt vermeden. Na vijf minuten bij kamertemperatuur, plaats de monsters op een geschikte magnetische standaard, zorgvuldig verwijderen en weggooien van de supernatant wanneer de oplossing duidelijk is. Was de kralen met twee wasbeurten van 30 seconden in 200 microliter vers bereide 80% ethanol per wasbeurt.

En gooi de resterende ethanol na de tweede wasbeurt weg. Wanneer de kralen lucht hebben gedroogd, voeg 11 microliter nuclease-vrij water toe om het DNA-doel van de kralen te ontwijken, gevolgd door vortexen. Vercentrifugeren de monsters vervolgens snel, breng de monsters terug naar de magnetische standaard totdat de oplossing helder is en breng 10 microliter van elk monster over naar een nieuwe PCR-buis.

Met succes versterkte cDNA moet een volledige lengte van meer dan 500 basisparen hebben en worden verrijkt van 1,5 tot twee kilo basisparen. Bovendien is er meestal een 500 tot 600 base pair verrijking van cDNA waargenomen in insuline een RFP plus cellen, die de insulinetranscripten kan vertegenwoordigen. Echter, de cDNA fragmenten in de buurt van 100 basisparen zijn primer dimers, die meestal worden veroorzaakt door overmatige primers en die moeten worden verwijderd door het herhalen van de DNA-zuivering stap.

De cDNA-fragmenten tussen 100 en 500 basisparen vertegenwoordigen meestal gedegradeerde cDNA, die wordt veroorzaakt door slechte celstatus of regioproblemen, zoals RNase-verontreiniging en moeten worden uitgesloten. Na de zuivering van de cDNA-bibliotheken voor sequencing kan cDNA, variërend van 250 tot 450 basisparen, worden verkregen door de toevoeging van DNA-zuiveringskralen aan de eerste en tweede zuiveringsronde. Na DNA-kraalzuivering moet de sequencing-kwaliteitsscore hoger zijn dan 30 tijdens de sequencing-kwaliteitsevaluatie.

Om cellen van hoge kwaliteit voor downstream-analyses te verkrijgen, worden cellen met minder dan 0,5 miljoen in kaart gebrachte reads of met minder dan 4,000 gedetecteerde genen uitgesloten, waardoor de karakterisering van verschillende groepen cellen wordt vergemakkelijkt en genen worden geïdentificeerd die heterogeen in verschillende groepen worden uitgedrukt na hoofdcomponentanalyse en hiërarchische clustering. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de alvleesklier snel door te nemen voordat de collagenase spijsvertering om eilandje over de spijsvertering te voorkomen en om RNase vrije omgeving te behouden tijdens de eencellige procedures. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals eilandjebeeldvorming en cultuur worden uitgevoerd om de visualisatie van de eilandjesstructuur te vergemakkelijken en cellulaire reacties en drugsstimulatie te onderzoeken.

Na de ontwikkeling, deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van alvleesklieronderzoek om de mechanismen van eilandje lijn ontwikkeling en regeneratie te verkennen, evenals diabetes progressie bij zoogdieren.