Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

Deze methode kan helpen bij het uitvoeren van diagnostiek op de patiënt, van patiënten met tekenen van virale infecties. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd zonder laboratoriumapparatuur en elektriciteit, en dus kan worden uitgevoerd op een ziekenhuisafdeling. Het demonstreren van de bloedafnameprocedure, zal worden gedaan door Medisch Doctor Anders Fomsgaard, en Wetenschapper Morten Rasmussen, beide van mijn laboratorium.

Begin met het voorbereiden van de bloedafnamebuisjes. Gebruik een naald van 25 gauge en een inch, gekoppeld aan een spuit van 3ML, om 1.6ML van een commerciële lysisbuffer in een vacuümbuis van 4ML EDTA te injecteren. Het is van cruciaal belang om het vacuüm in de bloedafnamebuis te behouden voor de bloedafname.

Gebruik dus altijd een naald om de lysisbuffer in de bloedafnamebuis te injecteren. Hersuspendeer vervolgens volledig een volume van 960 microliter van magnetische glazen deeltjes, of MGP's, en breng over naar een gelabelde buis van 1.8ML. Pipet vervolgens 4ML wasbuffer een in een buis van 4.5ML, gelabeld WB-1.1.5ML wasbuffer twee in een buis van 3.6ML, gelabeld WB-2, en 3ML wasbuffer drie in een buis van 4.5ML, gelabeld WB-3.

Voeg tenslotte 100 microliter elutiebuffer toe aan een buis van 1.8ML, gelabeld EB, en laat de buizen op kamertemperatuur staan tot gebruik. Om intraveneus volbloed van de patiënt te verzamelen, gebruik een vlindernaald met een buisje met kleine boring en een van de eerder voorbereide vacuümbuizen voor bloedafname die lysisbuffer bevat. Laat de arm van de patiënt in een neerwaartse positie rusten.

Steek de vlindernaald in de ader van de patiënt en bevestig de vacuümbuis voor bloedafname aan de buis met kleine boring. Na de bloedafname, meng de inhoud van de buis door de buis vijf tot tien keer om te draaien. Desinfecteer de buitenkant van de buis met 70% ethanol.

Bewaar vervolgens de buizen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voor virusinactivatie. Om nucleïnezuren uit het verzamelde bloed te zuiveren, meng opnieuw de inhoud van de buis door de vacuümbuis vijf tot tien keer met de hand om te draaien. Giet de bereide aliquot van MGP's direct in de bloedafnamebuis.

Plaats vervolgens een nieuw deksel van een ongebruikte bloedafnamebuis op de buis met de monster. Plaats een vinger op het deksel om ervoor te zorgen dat de buis goed gesloten is, en meng de inhoud van de buis door de buis vijf tot tien keer om te draaien. Plaats de buis in de magnetische houder en houd een vinger op het deksel om ervoor te zorgen dat de buis goed gesloten is.

Draai vervolgens de magnetische houder met de buis een paar keer om om de MGP's te verspreiden voordat ze zich aan de kant van de buis met de magneet verzamelen. Verwijder het deksel van de buis en gooi de inhoud van de buis in een opvangbuis van 50ML, met behulp van een wegwerppipet. Giet de bereide aliquot van WB-1 direct in de bloedafnamebuis en sluit het deksel van de buis.

Meng de inhoud met de hand vijf tot tien keer. Verzamel vervolgens de kralen aan de kant van de buis met behulp van de magneet en verwijder de vloeistof zoals eerder. Hersuspendeer de kralen in de bereide aliquot van WB-2, gooi vervolgens de oplossing weg en herhaal de procedure met een bereide aliquot van WB-3.

Verwijder tenslotte de buis uit de magnetische houder en giet de bereide aliquot van EB direct in de bloedafnamebuis. Plaats het deksel op de buis en hersuspendeer de MGP's door vijf tot tien keer met een vinger te tikken. Gebruik tenslotte een wegwerppipet van 1.5ML om één druppel van de hersuspendeerde MGP's over te brengen naar het downstream reactiemengsel voor nucleïnezuurversterking.

Zorg ervoor dat de MGP's volledig worden hersuspendeerd voordat u slechts één druppel in de PCR-reactie overbrengt. Om het concept te demonstreren, werd negatief volbloed verrijkt met 10-voudige verdunning van de Ebola-virusstandaard, bereid uit de recente uitbraak in zuidelijk Guinea, of drie verschillende concentraties van Epstein Barr-virus. De geëxtraheerde nucleïnezuren werden geanalyseerd door in-house virusspecifiek R2 qPCR of qPCR.

Hoe lager de kruisdrempel, of CT, hoe hoger het aantal virale genoomkopieën. Hier werd volbloed, verrijkt met verschillende concentraties van het Ebola-virus, gedetecteerd door een Ebola-virusspecifiek lamp. De uiteindelijke concentratie van het virus in het verrijkte volbloedmonster wordt weergegeven op de X-as, en de minuten tot positief wordt weergegeven op de Y-as.

Hier werd volbloed verrijkt met 10-voudige verdunning van een hepatitis C WHO gestandaardiseerd serummonster, met detectie door HCV-specifiek RT qPCR. Ten slotte toont deze afbeelding de resultaten van een Epstein Barr-virusspecifieke lamp-reactie op Epstein Barr-virus positief volbloed. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gespecificeerde lysisbindingbuffer te gebruiken.

Dit is een cruciale stap en een essentieel reagens voor de methode. Deze lysisbindingbuffer zal virus in het monster inactiveren. Door deze techniek te volgen, kunt u verschillende moleculaire detectiemethoden uitvoeren zoals lamp en PCR, en dus een differentiële diagnose stellen.