Name: Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer immobilisatie-metaalaffiniteitschromatografie voor het zuiveren en reconstitueren van polyhistidine-gemarkeerde non-heme ijzerbindende dioxygenasen in het onderwijslaboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze publicatie is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder Grant nr.  CHE 1708237.

1. voorbereiding voor zuivering
<ol><li>Voorbereiding van de cel-vrij ruwe extract<ol>
<li>Het verkrijgen van een ~ 9-10 g cel pellet van E. coli (BL21) die de polyhistidine gelabeld metalloprotein25 in een conische tube van 50 mL overexpressie.</li>
		<li>Voeg 5 mL per gram kamer temp lysis/bind buffer (50 mM fosfaat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool bij pH 8) op ~ 9-10 g van cel pellet voor een totaalvolume ~ 45-50 mL. Periodiek vortex ter bevordering van ontbinding. Als de pellet was bevroren, ontdooien in een bad met lauw water.</li>
		<li>Met behulp van ijs-waterbad, chill de celsuspensie tot ~ 3 ° C in voorbereiding voor lysis van de cel. Opmerking: Op dit punt, lysis van de cel door ultrasoonapparaat, kraal frezen of een andere methode is mogelijk. Kraal frezen blijkt hier want het is snel en relatief goedkoop, en geen gehoorbescherming vereist.</li>
		<li>Monteren van een 50 mL kraal frezen kamer volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Vul de kraal molen zaal helft vol gekoeld 0.1 mm glaskralen die zijn opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>Vul de rest van de kamer met de gekoelde celsuspensie en 4 ° C lysis/bind buffer volledig te vullen de kamer gebruiken.</li>
		<li>Gebruik een kleine spatel om de schacht van de kraal molen draaien en meng de celsuspensie met de kralen.</li>
		<li>Verwijder eventuele grote bubbels met een pipet en schroef vervolgens het deksel op.</li>
		<li>Droog uit de zaal van lekkages.</li>
		<li>Ongeveer 1 kop ijs aan de duidelijke, plastic jas toevoegen, omkeren van de gevulde 50 mL-zaal in het ijs gevuld jas en schroef gesloten.</li>
		<li>Beveilig de ijs-jacketed kamer op de motor.</li>
		<li>De kraal molen voor 15 seconden bij 15.800 rpm motor op draaien, dan toestaan om uit te rusten gedurende 45 seconden. Herhaal dit 8 keer.</li>
		<li>Wanneer de 8 cycli voltooid zijn, decanteren in de volledige lysis celsuspensie in een 50 mL klasse a of grotere buis beoordeeld voor hoge snelheid centrifugeren (25.000 x g of hoger). Plaats een paar evenwichtige buizen in centrifuge en spin op 25.000 x g voor 40-45 minuten bij 4° C tot pellet cel puin en glazen kralen. Opmerking: Als 50 mL klasse a of grotere buizen beoordeeld voor hoge snelheid centrifugeren niet beschikbaar zijn, verwijdert u de glasparels door centrifugeren op 1000-2000 x g gedurende 2-3 minuten in een conische buis van 50 mL opleveren van een kleinere hoeveelheid celsuspensie (~ 25 mL) die kan worden gedecanteerd in een kleinere volum e buis beoordeeld voor hoge snelheid centrifugeren.</li>
		<li>Bij centrifugeren voltooid is, Decanteer de heldere, gele, cel-vrij, ruwe extracten in een schone 50 mL conische buis. Wees voorzichtig niet te dragen elke cel puin.</li>
		<li>Het verzamelen van een kleine steekproef van de cel-vrij grove extracten voor latere analyse van de zuivering door SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de IMAC-kolom<ol>
<li>Het verkrijgen van een kolom van de 1.5 x 20 cm uitgerust met een lager bed ondersteuning hars deeltjes, een Luer lock uitlaat en een hogere cap die ook een Luer lock montage bevat te behouden. Passen de Luer-lock uitlaat met een afsluiter voor transportbesturing.</li>
		<li>Werken bij de benchtop, mount veilig de kolom op een ring staan.</li>
		<li>Verkrijgen van een 50% drijfmest van nikkel-gebonden nitriloacetic zuur (Ni-NTA) hars in 20% ethanol die is opgeslagen bij 4 ° C.</li>
		<li>Zachtjes swirl de fles om gelijkmatig resuspendeer de hars.</li>
		<li>Werken bij kamertemperatuur en op de benchtop, gebruik een geijkte pipet te trekken van de drijfmest, die 1 mL opleveren zal 2 mL vestigden zich hars geschikt van 50-60 mg polyhistidine bindende eiwitten gelabeld, en de drijfmest overbrengen in de kolom.</li>
		<li>Openen van de afsluiter en laat het overtollige opslagoplossing voor afvoer door de zwaartekracht van de hars.</li>
		<li>Sluit de afsluiter veilig</li>
		<li>Voeg met behulp van een pipet van Pasteur, zorgvuldig gekoeld lysis/bind buffer (50 mM fosfaat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool bij pH 8) en aan de kolom van hars – ten minste 30 mL. Wees voorzichtig niet te verstoren de hars oppervlak. Voer de buffer van de muren van de kolom te voorkomen van spatten.</li>
		<li>De hars equilibreer doordat de lysis/bind-buffer langzaam drain uit de kolom door de zwaartekracht in een bekerglas van de collectie.</li>
		<li>Wanneer de buffer lysis/bind meestal uitgedropen heeft, sluit de afsluiter om te stoppen met de stroom van de buffer wanneer ~ 5 mL lysisbuffermengsel boven de hars blijft en laat de kolom, rechtop, totdat u om door te gaan of voor maximaal 1 week gemonteerd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de zuivering van de Target Polyhistidine-gelabeld door IMAC
<ol><li>Bereiden was buffer (50 mM fosfaat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool pH 8) en elutie buffer (50 mM fosfaat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, 10% glycerol pH 8). Chill bij 4° C.</li>
	<li>De Ni-NTA kolom voorbereiden door de toevoeging van de cel-vrij grove extracten door openen van de afsluiter en waardoor resterende lysis/bindende buffer voor de afvoer door de zwaartekracht door middel van de Ni-NTA hars. Wanneer alle de buffer is afgevoerd en het oppervlak van de hars is blootgesteld, sluit de afsluiter.</li>
	<li>Met behulp van een pipet van Pasteur, zorgvuldig Pipetteer extraheert de cel vrij ruwe op de hars, verzorgen niet te verstoren van het oppervlak. Voer de grove extracten van de muren van de kolom te voorkomen van spatten. Het volume van de grove extracten toegepast is afhankelijk van het niveau van expressie van het polyhistidine-gelabeld eiwit; zorgen dat het totale volume van grove extracten bevat 50-60 mg of minder van het target-eiwit per mL Ni-NTA hars (zie stap 1.2.4).</li>
	<li>Wanneer alle van de grove extracten zijn overgedragen naar de kolom, de afsluiter open, zodat de kolom kan worden afgevoerd door de zwaartekracht. Deze stroom via is opgebouwd uit eiwitten die niet aan de hars – verzamelen 100 μl voor latere analyse van de zuivering door SDS-PAGE binden deed. 26
</li>
	<li>De viscositeit van de cel-vrij grove extracten kan vertragen de stroom van de zwaartekracht van de kolom aanzienlijk. Het vergroten van de snelheid van stroom, een eenvoudige "hand-pomp" van toepassing:<ol>
<li>Neem een spuit van 10 mL Luer-lock en sluit deze aan op de hoed van de kolom met behulp van een korte lengte van kunststof buizen en fittingen van de Luer-lock tussen het GLB van de kolom en de spuit. Trek de zuiger van de spuit, en vervolgens strak passen het GLB kolom bovenaan de kolom.</li>
		<li>Zachtjes comprimeren de plunjer van de injectiespuit met handmatig het beoordelen van de stroomsnelheid door het verzamelen van de elutievloeistof in een gegradueerde cilinder; tarieven voor 1-2 mL per minuut zijn compatibel met de hars en deze opstelling. Zachtjes compressie van de zuiger van de spuit te verhogen omdat dit de stroomsnelheid vertraagt.</li>
		<li>Om te voorkomen dat de introductie van lucht in de hars, verwijder de dop van de kolom en aangesloten handpomp wanneer de meniscus van de toegepaste vloeistof 5-10 mm boven het bed van de hars bereikt, en toestaan dat het resterende volume voor de afvoer door de zwaartekracht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de cel vrij grove extracten drainage hebt en het hars oppervlak opnieuw wordt blootgesteld, kunt een pipet van Pasteur Voeg voorzichtig ~ 30 mL gekoeld was buffer naar de kolom – verzorgen niet te verstoren van het oppervlak van de hars. Voer de buffer van de muren van de kolom te voorkomen van spatten.</li>
	<li>Open de afsluiter en het was buffer voor de afvoer door de kolom toestaan. Dit proces is het verwijderen van zwak afhankelijke eiwitten uit de hars. Gooi het eluent.</li>
	<li>Terwijl de buffer wassen is drainage, bereiden zestien, label, microcentrifuge buizen voor het verzamelen van 1 mL breuken.</li>
	<li>Wanneer de buffer wassen heeft afgevoerd en het oppervlak van de hars is blootgesteld opnieuw, sluit de afsluiter. Gebruik een pipet van Pasteur te voorzichtig ~ 30 mL gekoeld elutie buffer toegevoegd aan de kolom – verzorgen niet te verstoren van het oppervlak van de hars. Voer de buffer van de muren van de kolom te voorkomen van spatten.</li>
	<li>Open de afsluiter langzaam en de elutie buffer elueer de polyhistidine gelabeld proteïne van de kolom toestaan. 1 mL van eluens in elk van de gemarkeerde microcentrifuge-buizen, 1 t/m 16 verzamelen.</li>
	<li>Test de breuken voor eiwit met behulp van een bepaling van de colorimetrische eiwitten zoals de analyse van Bradford of UV-zichtbaar spectroscopie volgens de specifieke methoden door de reagens en/of instrument fabrikanten27,28. Zoals hier wordt getoond, is de colorimetrische bepaling met behulp van Coomassie blue verkleind tot een 100 μl volume om te offeren alleen een klein volume van elke fractie.</li>
	<li>Mix 3 μL van elke fractie met 100 µL van een colorimetrische eiwit assay reagens en handmatig het observeren van de vorming van elke kleur aan de aanwezigheid van eiwit in de Fractie; detectie met een spectrometer is niet nodig.</li>
	<li>Als eiwit wordt gevonden in fractie 16, totdat eluerende 1 mL breuken en assay voor eiwit periodiek, de eluted breuken bevatten niet langer een aanzienlijke hoeveelheid eiwit.</li>
	<li>Combineer eiwithoudende breuken in een schone conische buis, en trekken van een steekproef van 100 μl voor latere analyse door SDS-PAGE26.</li>
	<li>Doorgaan met reconstitutie van het metaalion cofactor of bevriezen de proteïne in 3 mL aliquots bij-80 ° C. Zorgen dat 10% glycerol is opgenomen in de elutie buffer is een cryoprotectant te stabiliseren van de pure eiwit tijdens bevriezing.</li>
	<li>Wanneer de elutie van de Ni-NTA kolom is voltooid, dat wil zeggen alle het eiwit is van de kolom en verzameld in breuken, doorgeven van een ander 25 mL elutie buffer door de kolom en slaat u de kolom bij 4 ° C in de ~ 5 mL elutie buffer voor korte termijn opslag , of lysis/bind buffer met 20% ethanol voor langere opslag.</li>
</ol>3. de reconstitutie van Target eiwit met Fe2 +
<ol><li>Toevoeging van Fe2 + Opmerking: Een niet-Heem-ijzer (II) bindend enzym, zoals de dioxygenase levodopa in dit voorbeeld vereist een Fe2 + ion voor activiteit; echter de ijzer (II) oxideert gemakkelijk aan ijzer (III), die niet actief is, en een fractie van de proteïne zuivert zonder enige ijzer helemaal.<ol>
<li>Om te beginnen met de reconstructie van het metaal, 3 mL van het gezuiverde enzym geschorst in elutie buffer te verkrijgen. Indien bevroren, ontdooien snel met behulp van een bad met lauw water en eenmaal ontdooid, zet het eiwit op ijs.</li>
		<li>Met behulp van de hoeveelheid eiwit in de buis, bereken de hoeveelheid natrium ascorbaat (198.1 g/mol) nodig om de uiteindelijke concentratie 12.5 mM in het monster. Ook, berekent het bedrag van dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) nodig om de uiteindelijke concentratie 12.5 mM in het monster.</li>
		<li>Voeg de solide natrium ascorbaat en DTT en voorzichtig, maar grondig, meng te ontbinden volledig. Wees voorzichtig niet te veroorzaken eiwit neerslag met overdreven agressieve mengen. Voeg een kleine hoeveelheid ijzer (II) sulfaat, heptahydraat (MW 278.01 g/mol) aan het eiwit monster.</li>
		<li>Om het verkrijgen van een klein genoeg hoeveelheid de zout, kraan van ijzer een paar 1 mm korrels FeSO4•7H2O solide uit op een stuk papier te wegen, vouw het papier over de submodule en pletten met de platte kant van een metalen spatel.</li>
		<li>Een korrel van de resulterende poeder toevoegen aan de buis van eiwit.</li>
		<li>Vortex te mengen en een roze roze kleur verschijnt in de buis.</li>
		<li>Incubeer de roze oplossing van eiwit, afgetopt, voor 10-30 minuten op het ijs. De roze kleur zal langzaam verdwijnen na verloop van tijd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel filtratie<ol>
<li>Gebruik een gel filtratie kolom vol met 10 mL van sferische polyacrylamidegel met een molecuulgewicht uitsluiting limiet van ongeveer 6.000 en een gehydrateerd deeltje groottewaaier van 90 – 180 µm in een kolom van 1,5 x 12 cm, die is ook uitgerust met een reservoir van 10 mL. Controleer de kolom is uitgerust met een lagere en bovenste bed ondersteunt in de vorm van 30 um poreuze polyethyleen-schijven behouden de hars in de kolom te voorkomen dat het hars bed wordt uitgevoerd droog. Monteer de gel filtratie kolom een ring staan.</li>
		<li>Als een voorverpakte gel filtratie kolom gebruiken, verwijder de dop en giet af de overtollige buffer boven de bovenste bed steun.</li>
		<li>Om de kolom equilibreer, beginnen met het vullen van het reservoir met buffer compatibel met latere assay en opslag, bijvoorbeeld 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glycerol op pH 8,0.</li>
		<li>Als een voorverpakte gel filtratie kolom gebruiken, uitgelijnd uit het onderste puntje van gel filtratie kolom om te beginnen de stroom van buffer en bloot de Luer slip montage. Past een afsluiter naar het Luer slip einde van de kolom, maar open te laten en laat de kolom te druppelen door de zwaartekracht.</li>
		<li>Wanneer de buffer heeft afgetapt uit de kolom en de bovenste bed steun wordt blootgesteld, sluit de afsluiter en de ~ 3 mL van de Fe (II) gereconstitueerd metalloenzyme aan de kolom toevoegen door de oplossing op de drager van de blootgestelde bovenste bed pipetteren.</li>
		<li>Open de afsluiter en het gehele 3,0 mL monster aan de kolom invoeren door de zwaartekracht. Gooi deze eerste 3 mL van eluens. Een roze kleur die tijdens het verwerken van de oplossing vormt, zal gevangen worden boven aan de kolom.</li>
		<li>De kolom is gestopt met druipende en de steun van het bovenste bed is blootgesteld, Voeg 4 mL van de gel-filtratie-buffer (b.v., 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glycerol op pH 8,0) naar de kolom. Open de afsluiter en het eluent verzamelen in microcentrifuge buizen over acht 0,5 mL breuken.</li>
		<li>Test de breuken voor eiwit met behulp van een eiwit colorimetrische bepaling of UV-Vis27,28 , zoals eerder beschreven.</li>
		<li>Eiwithoudende breuken combineren.</li>
		<li>Het trekken van een steekproef van SDS-pagina analyse26.</li>
		<li>Ga verder met de test of opslag van het monster.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1188-1321">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li>
<li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwitzer%2C+RL+%22Experimental+Biochemistry%22">Experimental Biochemistry</a>. , Macmillan. (1999).</li>
<li>Boyer, R. <a target="_blank" href="https://www.pearson.com/us/higher-education/program/Boyer-Modern-Experimental-Biochemistry-3rd-Edition/PGM122783.html">Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition</a>. , (2001).</li>
<li>le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ale+Maire%2C+M+%22Laboratory+Guide+to+Biochemistry%2C+Enzymology%2C+and+Protein+Physical+Chemistry%3A+A+Study+of+Aspartate+Transcarbamylase%22">Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase</a>. , Springer Science & Business Media. (2012).</li>
<li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBettelheim%2C+FA+%22Laboratory+Experiments+for+General%2C+Organic%2C+and+Biochemistry%22">Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2013).</li>
<li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed065p901">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).</li>
<li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed068p430">Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).</li>
<li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+mutation+to+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students%3A+An+illustration+of+protein+expression+and+purification%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li>
<li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li>
<li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li>
<li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKay%2C+BK+%22Phage+Display+of+Peptides+and+Proteins%3A+A+Laboratory+Manual%22">Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual</a>. , Elsevier. (1996).</li>
<li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21591176">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li>
<li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li>
<li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+writing-intensive%2C+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%3A+A+Bimonthly+Publication+of+the+International+Union+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li>
<li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization%3A+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Known+structure%2C+unknown+function%3A+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li>
<li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/metalloenzymes-use-of-recombinant-protein-expression-and-affinity-tags-to-aid-identification-of-native-metal-ion-cofactors-2161-1009.1000132.php?aid=11177">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li>
<li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/3527600906.mcb.200400107/abstract">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li>
<li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470048672.wecb327/abstract">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li>
<li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="https://Link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-485-2:257">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e45">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li>
<li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2%2C3-dioxygenase%2C+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li>
<li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+overexpression%2C+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2%2C3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li>
<li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li>
<li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis%3A+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li>
<li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016748389390013H">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li>
<li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2%2C3-Dihydroxyphenylpropionate+1%2C2-Dioxygenase+%28MhpB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li>
<li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246%2C+His-199%2C+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2%2C3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li>
<li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC%2C+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li>
<li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Terwijl de toevoeging van polyhistidine tags om recombinant eiwitten en hun zuivering door IMAC vrijwel alomtegenwoordig in de biochemische literatuur3,4,5, toepassingen van IMAC op enzym zuivering is geworden in de biochemie laboratorium onderwijs blijven schaars, en gepubliceerde methoden vind niet altijd de resource beperkingen van het onderwijs laboratorium20. Bovendien, het gebruik van de IMAC in het laboratorium van het onderwijs is vooral effectief wanneer gekoppeld aan experimenten die beoordelen activiteit en zuiverheid, IMAC zuivering van een enzym een ideale educatieve activiteit maken. Oog op de uitbreiding van de toepassing van IMAC op de zuivering van enzymen, met inbegrip van metalloenzymes, in het onderwijs-laboratorium, zijn betrouwbare en goedkope methoden nodig. In dit protocol, tonen we benchtop IMAC met behulp van gemakkelijk beschikbaar en goedkope laboratorium benodigdheden, terwijl de beperkingen bij de toepassing van IMAC metaaleiwitten22, ook door de wederopvoering van de afhankelijke ijzer(II) aan te pakken metalloenzyme, levodopa dioxygenase, post zuivering. Met de reagentia en materialen beschreven, schatten we de kosten van verbruiksartikelen voor acht groepen van studenten tussen de $500-600 per semester uitvoeren van dit protocol, met inbegrip van de stappen van de analyse in Figuur 1 en Figuur 2.
Vanwege het gemak waarmee Fe2 + van aminozuur liganden24 en de facile oxidatie van Fe2 + door O2 Fe3 +, reconstructie van de non-Heem distantiëren kan, is aminozuur-in chelaatvorm ijzer(II) in een recombinant metalloenzyme een typisch onderdeel van de zuivering van het enzym. Als klassieke chromatografie wordt gebruikt, is het mogelijk om te voorkomen dat het totale verlies van ijzer in sommige gevallen32, maar steeds vaker de ijzer (II) wordt toegevoegd terug in het bijzijn van de reductiemiddelen33,34,35, 36 vaak onder een anaërobe atomosphere37,38,39, en in sommige gevallen het overtollige ijzer is niet verwijderd33,34,36, complicerende elke daaropvolgende assay. Opeenvolgende stappen van klassieke chromatografie en een anaërobe sfeer zijn niet realistisch voor de undergraduate laboratorium, dat de ontwikkeling van dit protocol wordt gevraagd.
Terwijl de handmatige voorbereiding van de Ni-NTA-kolom en de verwerking van de monsters grotendeels door de zwaartekracht neemt extra tijd en moeite in vergelijking met voorverpakte kolommen en geautomatiseerde chromatografie instrumentatie, toestaan de handmatige stappen voor hands-on leren door de student die leiden tot meer begrip van de wetenschap achter het proces. De toevoeging van een ijzer (II)-zout onder de voorwaarden die hier geschetst is bijzonder gevoelig voor teveel dithiothreitol. Als een student per ongeluk een overmaat van dithiothreitol voegt, is een evenement van de neerslag waarschijnlijk. We vonden het nuttig zijn om het vereisen van studenten voor het uitvoeren van berekeningen van reagens hoeveelheden voor aankomst in lab, zodat laboratorium tijd zo doeltreffend mogelijk kan worden gebruikt op de Bank. De gehele benchtop IMAC zuivering - van lysis van de cel aan eiwit elutie - kan worden bereikt in een periode van 4 uur laboratorium, gevolgd door reconstitutie en test in een latere lab-periode.

De eerste verslagen van de reiniging van een polyhistidine gelabeld eiwit uit extracten van een organisme van de host met behulp van chelatie voor de histidine-tag door een geïmmobiliseerdet metaal ingevoerd de literatuur in 19881,2. Sinds die tijd, de toevoeging van polyhistidine tags om recombinant eiwitten en de zuivering van hun afvalwater door geïmmobiliseerdet metal affiniteitchromatografie (IMAC) geworden vrijwel alomtegenwoordig in de biochemische literatuur3,4, 5. IMAC zuivering methoden kunnen worden geïmplementeerd op de benchtop, met behulp van geautomatiseerde chromatografie en in spin-kolom indelingen. Hoewel affiniteit zuivering methoden, met name IMAC, veel in het onderzoekslaboratorium gebruikt worden, zijn ze minder vaak in het undergraduate onderwijs-laboratorium. De meest gebruikte laboratorium schoolboeken voor het laboratorium voor Biochemie doen niet routinematig leren deze methoden, in plaats daarvan kiezen voor meer traditionele ion-exchange of kleurstof-bindende chromatografie6,7,8 , 9. bijvoorbeeld, de zuivering van lactaat dehydrogenase door Anderson10 affiniteit gebruikt door kleurstof-bindende en de zuivering van koemelk α-lactalbumine7,11 van Boyer gebruikt een nikkel-nitriloacetic zure matrix, maar geen recombinante poly-histidine-tag, in plaats daarvan vertrouwen op intrinsieke affiniteit van het eiwit voor de hars. Sommige moderne undergraduate laboratorium handboeken en publicaties voeren geïmmobiliseerdet metalen affiniteitchromatografie op poly-histidine gelabeld eiwit doelen zoals groen of rood-fluorescerende eiwitten12,13, 14,,15, antilichamen16en geselecteerde enzymen17,18,19,20, zelfs sommige van de onbekende functie21. Aantoonbaar, de zuivering van het enzym is in het laboratorium van het onderwijs, de voorkeur verdient omdat het doelwit kan worden vehiculumcontrolegroep activiteit in latere sessies, verrijking van de ervaring van "echte wetenschap" van de kant van de student; inderdaad, dit soort laboratorium ervaringen zijn gepubliceerd en gunstige resultaten op student leren gemeld17,18,20,21. En nog, toepassingen van IMAC op enzym zuivering in de biochemie onderwijs laboratorium blijven schaars, en de gepubliceerde methoden kunnen zelfs veronderstellen toegang tot chromatografie instrumentatie die is meestal niet beschikbaar voor gebruik in de klas-laboratorium 20. er zijn ook beperkingen bij de toepassing van IMAC op metaaleiwitten, met name die welke redox-sensitive divalente metalen die essentieel voor de activiteit22 zijnbinden. Vaak is het metaal-ion verloren of geoxideerd tijdens het zuiveringsproces ongehinderd een inactief enzym ongeschikt voor de undergraduate laboratorium oplevert.
Een volledige eenderde van enzymen binden een metaalion23, en ondanks een bijna universele behoefte ijzer in alle vormen van leven23, ijzer is aantoonbaar onder de meest problematische metaalionen in enzymologie. Niet-Heem Fe2 + bindende enzymen zijn bijzonder gevoelig voor verlies en/of oxidatie van het metaal tijdens IMAC; vermoedelijk te wijten aan het ontbreken van een specifieke organische ligand zoals heem en het gemak met welke Fe2 + van aminozuur liganden24 distantiëren kan. Bovendien is de oxidatie zuurstof afhankelijk van Fe2 + Fe3 + spontane in waterige oplossing, als gevolg van de negatieve vrije energie verandering en de relatieve stabiliteit van Fe3 +. Vaak, worden deze uitdagingen overwonnen door gebruik van anaerobe sfeer en/of niet-IMAC chromatografische methoden22. In dit artikel zullen we laten zien dat het gebruik van benchtop IMAC te zuiveren van de Fe2 + afhankelijke metalloenzyme levodopa dioxygenase met behulp van eenvoudige, goedkope chromatografie leveringen, gevolgd door de reconstructie van de actieve site Fe2 +, en enzymatische onderzoek. Deze methoden zijn standaard in ons eigen laboratorium undergraduate biochemie van groepen van 6-12 studenten en kunnen worden gebruikt voor het uitbreiden van het repertoire van enzym onderzoeken op undergraduate-niveau.

<table><tbody><tr><td>consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 0.1mm glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101</td><td>1 pond per stuk</td></tr><tr><td>50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterieel</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, monobasic</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA Resin&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&nbsp;</td></tr><tr><td>Stopcock Valve, one way, female to male luer</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>pack of 50</td></tr><tr><td>BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td><td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Fiserbrand universal pipet pump</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipets</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting columns</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>box of 30</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 gels</td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>case of 500</td></tr><tr><td>Cuvette Caps Square Disposable</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Equipment:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 50mL chamber&nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 chamber</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&ndash;120/220&ndash;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td></tr><tr><td>UV-1800 with UV-Probe Software</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>version 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

benchtop geïmmobiliseerd metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een polyhistidine gecodeerde metalloenzyme voor de undergraduate laboratorium

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop geïmmobiliseerd chromatografie (IMAC), van de metalen affiniteit van polyhistidine gelabeld eiwitten is gemakkelijk onder de knie door studenten en is uitgegroeid tot de meest gebruikte eiwit zuivering methode in de moderne literatuur. Maar, de toepassing van de chromatografie van de affiniteit op metalen bindende proteïnen, vooral die met redox gevoelige metalen zoals ijzer, is vaak beperkt tot laboratoria met toegang tot een handschoenenkastje - apparatuur die niet routinematig beschikbaar in de undergraduate laboratorium. In dit artikel tonen we onze benchtop methoden voor isolatie, IMAC-zuivering en metaal-ion reconstitutie van een poly-histidine gelabeld, redox-actieve, niet-Heem-ijzer bindende extradiol dioxygenase en de bepaling van de dioxygenase met gevarieerde substraat concentraties en verzadigen van zuurstof. Deze methoden zijn uitgevoerd door studenten en geïmplementeerd in het undergraduate onderwijs en onderzoek laboratorium met de instrumentatie die is toegankelijk en betaalbaar bij voornamelijk undergraduate instellingen.

Deze representatieve resultaten werden verzameld door de studenten als zij dit protocol uitgevoerd tijdens twee cursus laboratorium perioden van BCM 341: Experimental biochemie aan Muhlenberg College. Figuur 1 toont de resultaten van de reiniging van een 20 kDa poly-histidine tagged metalloenzyme, levodopa dioxygenase, zoals uitgevoerd door twee studenten gedurende een periode van 4 uur klas laboratorium en geanalyseerd door SDS-PAGE door hetzelfde studenten gedurende een periode van latere laboratorium. De poly-histidine gelabeld eiwit is effectief gezuiverde (Figuur 1, lane 2). Een immunoblot van de gel met behulp van antilichamen tegen de poly-histidine tag geeft aan dat een kleine hoeveelheid van de poly-histidine gelabeld doel proteïne is verloren in de doorstroming (gegevens niet worden weergegeven), waarschijnlijk omdat de groter zijn dan 100 mg hoeveelheid doel eiwit in de lysate overschreden de bindingscapaciteit van de hars.
Figuur 2 toont gegevens over de activiteit van de student-verzameld op de enzymatische reactie van de poly-histidine tagged metalloenzyme target, levodopa dioxygenase, na reconstitutie met ijzer (II) en latere gel-filtratie als bedoeld in het protocol hierin. De vijf tweede dode tijd voordat gegevens verzameld begint is typerend voor studenten die deze techniek voor de eerste keer uitvoeren. De robuuste activiteit van de metalloenzyme werd ontdekt met behulp van een gepubliceerde assay, en leverde steady-state kinetische parameters overeenstemming met gepubliceerde resultaten29. Steady-state kinetische parameters werden vastgesteld door het aanbrengen van de vooruitgang curven30 afgebeeld in Figuur 2; niet-lineaire kleinste kwadraten montage van eerste tarieven verzameld over een reeks van substraat concentraties is echter ook mogelijk31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figuur 1. SDS-pagina26 analyse van de poly-histidine gelabeld eiwit vóór, tijdens en na de zuivering. Lanes 1 - moleculair gewicht markeringen, 2-gezuiverd eiwit (20 kDa) post Ni-NTA, 3-Ni-NTA stroom door, 4 - cel vrij grove extracten voorafgaand aan de zuivering, 5 - cel-puin pellet post lysis. Monsters werden opgesteld op basis van 5 x monster/laden buffer en gescheiden op voorgegoten 4-20% polyacrylamide gels met behulp van een systeem van de Elektroforese van het gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figuur 2. Steady state assay van het ijzer (II) gereconstitueerd metalloenzyme (d.w.z., levodopa dioxygenase, 10µM) met substraat (levodopa-5 µM (rood), 25 µM (groen), 50 µM (blauw)) in buffer (50 mM fosfaat, 200 mM NaCl, pH 8). Sporen verbeelden productvorming op 414nm. Absorptie gegevens werden voortdurend verkregen met behulp van 1 mL methacrylaat cuvettes in een split-beam scanning UV-zichtbaar spectrometer29. Ruwe gegevens geschikt zijn om een model van de Michaelis-Menten steady-state onderlinge aanpassing (KM 30,8 µM ± 14.4, kkatschijnbare 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een protocol voor de benchtop geïmmobiliseerd metal affinity chromatografie zuivering en verdere reconstructie van een polyhistidine gelabeld, non-Heem ijzer bindende dioxygenase geschikt voor het undergraduate onderwijs-laboratorium.

Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Deze methode stelt bachelorstudenten in staat om ijzerbindende metallo-enzymen snel te zuiveren en vervolgens dat eiwit te gebruiken om belangrijke vragen over structuur en functie te beantwoorden, allemaal binnen de grenzen van het onderwijslaboratorium. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze toepasbaar is op niet-hem ijzerbindende enzymen. Het is toegankelijk voor bachelorstudenten en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in het onderwijslaboratorium.Om deze procedure te beginnen, haal een kolom van 1,5 bij 20 centimeter die is uitgerust met een luer lock uitlaat, een bovenste dop die ook een luer lock fitting bevat, en een onderste bedondersteuning om harsdeeltjes vast te houden. Plaats de onderste luer lock fitting met een stopcock om de stroom te regelen. Verkrijg vervolgens een fles met een 50% slurry van nikkel-gebonden nitriloazijnzuurhars in 20% ethanol die eerder was opgeslagen bij vier graden Celsius.Zwiep voorzichtig met de fles om de hars gelijkmatig op te schorsen. Werkend bij kamertemperatuur, gebruik een afgemeten pipette om twee millimeter van de slurry te trekken en deze over te brengen naar de kolom. Nadat de overtollige opslagoplossing uit de hars is gedraineerd, gebruik een Pasteur pipette om voorzichtig minstens 30 milliliter gekoelde lysis bind buffer toe te voegen, zorg ervoor dat het oppervlak van de hars niet wordt verstoord.Laat de buffer langs de wanden van de kolom stromen om spatten te voorkomen. Equilibreer de hars door de buffer langzaam door de kolom te laten lopen door zwaartekracht in een verzamelbeker. Om te beginnen, bereid de nikkel-NTA kolom voor op de toevoeging van de celvrije ruwe extracten door de stopcock te openen en de resterende lysis bind buffer door de nikkel-NTA hars te laten lopen door zwaartekracht.Wanneer de buffer volledig is gedraineerd en het harsoppervlak is blootgesteld, sluit de stopcock. Gebruik vervolgens een Pasteur pipette om voorzichtig de celvrije ruwe extracten op de hars te pipetten, zorg ervoor dat het oppervlak niet wordt verstoord. Laat de ruwe extracten langs de wand van de kolom lopen om spatten te voorkomen.Nadat alle ruwe extracten naar de kolom zijn overgebracht, open de stopcock zodat de kolom door zwaartekracht kan draineren. Verzamel 100 microliter van de flow-through voor latere analyse. Gebruik een korte lengte van plastic buis om een 10 milliliter luer lock spuit te verbinden met de dop van de kolom.Trek de zuiger van de spuit uit en vul vervolgens de kolomdop strak op de bovenkant van de kolom. Druk voorzichtig op de zuiger terwijl je het eluent in een afgemeten cilinder verzamelt om de stroomsnelheid handmatig te beoordelen. Snelheden tussen een en twee milliliter per minuut zijn compatibel met de hars en de experimentele opstelling.Verhoog voorzichtig de compressie van de zuiger van de spuit naarmate de stroomsnelheid langzamer wordt. Wanneer de meniscus van de toegepaste vloeistof vijf tot tien milliliter boven het harsbed bereikt, verwijder de kolomdop en de bijbehorende handpomp om te voorkomen dat lucht in de hars wordt geïntroduceerd. Laat het resterende volume door zwaartekracht draineren.Nadat de ruwe extracten zijn afgevoerd en het harsoppervlak weer is blootgesteld, gebruik een Pasteur pipette om voorzichtig ongeveer 30 milliliter gekoelde wasbuffer toe te voegen aan de kolom, zorg ervoor dat het oppervlak van de hars niet wordt verstoord. Open de stopcock en laat de wasbuffer door de kolom lopen. Terwijl de kolom afloopt, label 16 microcentrifugebuisjes voor het verzamelen van fracties.Wanneer de buffer volledig is afgevoerd en het harsoppervlak weer is blootgesteld, sluit de stopcock. Voeg met behulp van een Pasteur pipette voorzichtig ongeveer 30 milliliter gekoelde elutie buffer toe aan de kolom, zorg ervoor dat het oppervlak van de hars niet wordt verstoord. Open vervolgens langzaam de stopcock om het elutie buffer toe te laten lopen en het polyhistidine-getagde eiwit uit de kolom te elueren.Verzamel één milliliter eluent in elk van de gemarkeerde microcentrifugebuisjes. Na het testen op eiwit, combineer de eiwitbevattende fracties in een schone conische buis. Ga verder met een reconstitutie van de metaalionen cofactor, of bevries het eiwit in drie milliliter aliquots bij minus 80 graden Celsius.Om te beginnen met de reconstitutie van het metaal, zet een drie milliliter aliquot van het gezuiverde enzym, gesuspendeerd in elutie buffer, op ijs. Gebruik het volume eiwit in de buis om de hoeveelheid natriumascorbinezuur en dithiothreitol te berekenen die nodig is zodat de uiteindelijke concentratie van elk 12,5 millimolair is in het monster. Voeg het vaste natriumascorbinezuur en dithiothreitol toe, en meng voorzichtig maar grondig om volledig op te lossen.Schept een paar één milliliter granula van vast ijzersulfaatheptahydraat uit op een stuk weegpapier. Vouw het papier over de korrel en verpletter het met de platte kant van een metalen spatel. Voeg een korrel van het resulterende poeder toe aan de buis met de eiwitoplossing.Vortex om te mengen, resulterend in een roze-roze kleur. Dek de buis af en incubeer de roze oplossing op ijs gedurende 10 tot 30 minuten. De roze kleur zal na verloop van tijd vervagen.Voor gelfiltratie, gebruik een gelfiltratie kolom gevuld met 10 milliliter sferische polyacrylamide gel in een 1,5-bij-12 centimeter kolom, die ook is uitgerust met een 10 milliliter reservoir. Equilibreer vervolgens de kolom zoals beschreven in het tekstprotocol. Wanneer de buffer uit de kolom is gedraineerd en de bovenste bedondersteuning is blootgesteld, sluit de stopcock.Pipet de drie milliliter oplossing van ijzer twee gereconstitueerde metallo-enzym op de blootgestelde bovenste bedondersteuning. Open de stopcock en laat de volledige drie milliliter monster door zwaartekracht de kolom binnenlopen. Gooi de eerste drie milliliter eluent weg.Elke roze kleur die zich vormt tijdens het hanteren van de oplossing zal bovenaan de kolom worden vastgehouden. Wanneer de kolom is gestopt met druppelen en de boven

benchtop-immobilized-metal-affinity-chromatography-reconstitution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate the nickel affinity chromatography technique to purify histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes from Clostridium difficile bacteria.

Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate

This video demonstrates a procedure for the production of recombinant antibodies against metallopeptidase. Recombinant plasmids carrying genes for the antibody, green fluorescent protein, and antibiotic resistance are transfected into epithelial cells with lipofectamine. The transfected cells are selected and cultivated to generate recombinant antibodies.

A Method to Produce Recombinant Antibodies Against Metallopeptidase

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Robuuste detectie reagentia zijn steeds noodzakelijker voor het ontwikkelen van nieuwe malaria diagnostische hulpmiddelen. Er werd een iridium(III) sonde ontworpen die een langdurig lumineus signaal uitzendt in aanwezigheid van een histidine-rijk malaria-eiwit biomerker. Detectie van het eiwit, hetzij in oplossing of geïmmobiliseerd op een magnetisch deeltje, biedt flexibiliteit in toepassing.

Iridium (III) Lichtgevende Probe voor detectie van de malaria Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de abundantie van metalloproteïnen direct uit biologische monsters te meten. Hier beschrijven we een reeks metalloproteïne-standaarden die worden gebruikt om de moleculaire massa en de hoeveelheid metaal geassocieerd met onbekende eiwitten te schatten.

Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

Dit protocol combineert de karakterisering van een eiwitsteekproef door capillaire gelelektroforese en een snel-bindende screening voor geladen liganden door affiniteit capillaire elektroforese. Het wordt aanbevolen voor eiwitten met een flexibele structuur, zoals intrinsiek ongeordende eiwitten, om te bepalen van eventuele verschillen in bindende voor verschillende conformeren.

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Hier beschrijven we protocollen voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS) waarbij de ubiquitine-ligases Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) en Cereblon (CRBN) betrokken zijn.  Biofysische methoden die hierin worden geïllustreerd, zijn onder meer oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC).

De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Leer immobilisatie-metaalaffiniteitschromatografie voor het zuiveren en reconstitueren van polyhistidine-gemarkeerde non-heme ijzerbindende dioxygenasen in het onderwijslaboratorium.

Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium (Video) | JoVE Journal

Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium

Meer video's verkennen