Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium

Deze methode stelt bachelorstudenten in staat om ijzerbindende metallo-enzymen snel te zuiveren en vervolgens dat eiwit te gebruiken om belangrijke vragen over structuur en functie te beantwoorden, allemaal binnen de grenzen van het onderwijslaboratorium. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze toepasbaar is op niet-hem ijzerbindende enzymen. Het is toegankelijk voor bachelorstudenten en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in het onderwijslaboratorium.

Om deze procedure te beginnen, haal een kolom van 1,5 bij 20 centimeter die is uitgerust met een luer lock uitlaat, een bovenste dop die ook een luer lock fitting bevat, en een onderste bedondersteuning om harsdeeltjes vast te houden. Plaats de onderste luer lock fitting met een stopcock om de stroom te regelen. Verkrijg vervolgens een fles met een 50% slurry van nikkel-gebonden nitriloazijnzuurhars in 20% ethanol die eerder was opgeslagen bij vier graden Celsius.

Zwiep voorzichtig met de fles om de hars gelijkmatig op te schorsen. Werkend bij kamertemperatuur, gebruik een afgemeten pipette om twee millimeter van de slurry te trekken en deze over te brengen naar de kolom. Nadat de overtollige opslagoplossing uit de hars is gedraineerd, gebruik een Pasteur pipette om voorzichtig minstens 30 milliliter gekoelde lysis bind buffer toe te voegen, zorg ervoor dat het oppervlak van de hars niet wordt verstoord.

Laat de buffer langs de wanden van de kolom stromen om spatten te voorkomen. Equilibreer de hars door de buffer langzaam door de kolom te laten lopen door zwaartekracht in een verzamelbeker. Om te beginnen, bereid de nikkel-NTA kolom voor op de toevoeging van de celvrije ruwe extracten door de stopcock te openen en de resterende lysis bind buffer door de nikkel-NTA hars te laten lopen door zwaartekracht.

Wanneer de buffer volledig is gedraineerd en het harsoppervlak is blootgesteld, sluit de stopcock. Gebruik vervolgens een Pasteur pipette om voorzichtig de celvrije ruwe extracten op de hars te pipetten, zorg ervoor dat het oppervlak niet wordt verstoord. Laat de ruwe extracten langs de wand van de kolom lopen om spatten te voorkomen.

Nadat alle ruwe extracten naar de kolom zijn overgebracht, open de stopcock zodat de kolom door zwaartekracht kan draineren. Verzamel 100 microliter van de flow-through voor latere analyse. Gebruik een korte lengte van plastic buis om een 10 milliliter luer lock spuit te verbinden met de dop van de kolom.

Trek de zuiger van de spuit uit en vul vervolgens de kolomdop strak op de bovenkant van de kolom. Druk voorzichtig op de zuiger terwijl je het eluent in een afgemeten cilinder verzamelt om de stroomsnelheid handmatig te beoordelen. Snelheden tussen een en twee milliliter per minuut zijn compatibel met de hars en de experimentele opstelling.

Verhoog voorzichtig de compressie van de zuiger van de spuit naarmate de stroomsnelheid langzamer wordt. Wanneer de meniscus van de toegepaste vloeistof vijf tot tien milliliter boven het harsbed bereikt, verwijder de kolomdop en de bijbehorende handpomp om te voorkomen dat lucht in de hars wordt geïntroduceerd. Laat het resterende volume door zwaartekracht draineren.

Nadat de ruwe extracten zijn afgevoerd en het harsoppervlak weer is blootgesteld, gebruik een Pasteur pipette om voorzichtig ongeveer 30 milliliter gekoelde wasbuffer toe te voegen aan de kolom, zorg ervoor dat het oppervlak van de hars niet wordt verstoord. Open de stopcock en laat de wasbuffer door de kolom lopen. Terwijl de kolom afloopt, label 16 microcentrifugebuisjes voor het verzamelen van fracties.

Wanneer de buffer volledig is afgevoerd en het harsoppervlak weer is blootgesteld, sluit de stopcock. Voeg met behulp van een Pasteur pipette voorzichtig ongeveer 30 milliliter gekoelde elutie buffer toe aan de kolom, zorg ervoor dat het oppervlak van de hars niet wordt verstoord. Open vervolgens langzaam de stopcock om het elutie buffer toe te laten lopen en het polyhistidine-getagde eiwit uit de kolom te elueren.

Verzamel één milliliter eluent in elk van de gemarkeerde microcentrifugebuisjes. Na het testen op eiwit, combineer de eiwitbevattende fracties in een schone conische buis. Ga verder met een reconstitutie van de metaalionen cofactor, of bevries het eiwit in drie milliliter aliquots bij minus 80 graden Celsius.

Om te beginnen met de reconstitutie van het metaal, zet een drie milliliter aliquot van het gezuiverde enzym, gesuspendeerd in elutie buffer, op ijs. Gebruik het volume eiwit in de buis om de hoeveelheid natriumascorbinezuur en dithiothreitol te berekenen die nodig is zodat de uiteindelijke concentratie van elk 12,5 millimolair is in het monster. Voeg het vaste natriumascorbinezuur en dithiothreitol toe, en meng voorzichtig maar grondig om volledig op te lossen.

Schept een paar één milliliter granula van vast ijzersulfaatheptahydraat uit op een stuk weegpapier. Vouw het papier over de korrel en verpletter het met de platte kant van een metalen spatel. Voeg een korrel van het resulterende poeder toe aan de buis met de eiwitoplossing.

Vortex om te mengen, resulterend in een roze-roze kleur. Dek de buis af en incubeer de roze oplossing op ijs gedurende 10 tot 30 minuten. De roze kleur zal na verloop van tijd vervagen.

Voor gelfiltratie, gebruik een gelfiltratie kolom gevuld met 10 milliliter sferische polyacrylamide gel in een 1,5-bij-12 centimeter kolom, die ook is uitgerust met een 10 milliliter reservoir. Equilibreer vervolgens de kolom zoals beschreven in het tekstprotocol. Wanneer de buffer uit de kolom is gedraineerd en de bovenste bedondersteuning is blootgesteld, sluit de stopcock.

Pipet de drie milliliter oplossing van ijzer twee gereconstitueerde metallo-enzym op de blootgestelde bovenste bedondersteuning. Open de stopcock en laat de volledige drie milliliter monster door zwaartekracht de kolom binnenlopen. Gooi de eerste drie milliliter eluent weg.

Elke roze kleur die zich vormt tijdens het hanteren van de oplossing zal bovenaan de kolom worden vastgehouden. Wanneer de kolom is gestopt met druppelen en de boven