Name: Caenorhabditis Zeef: Een Low-tech Instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Leer een efficiënte methode om Caenorhabditis elegans te sorteren op lichaamsgrootte met een zelfgemaakt zeefinstrument. Deze techniek bespaart tijd en kosten bij moleculair biologische assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank Heather Currey voor haar eerste bijdrage aan de studie ontwerp, en Dr. Swarup Mitra voor zijn kritische beoordeling van het manuscript. Ook bedank wij Dr. Michael B. Harris voor opmerkingen, verbeteringen en bijstand bij het opstellen van de demonstratie van deze methodologie. De stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door het Bureau van de NIH onderzoek infrastructuur programma's (P40 OD010440). Het onderzoek in deze publicatie gerapporteerd werd gesteund door de National Institute Of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award nummers UL1GM118991, TL4GM118992 of RL5GM118990 en door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder grant nummer 5P20GM103395-15. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. UA is een AA/EO werkgever en onderwijsinstelling en verbiedt onwettige discriminatie tegen een individu: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis zeef constructie en het gebruik
<ol><li>
Opbouw protocol
	<ol>
<li>Verwerven 2 deksels van 50 mL conische buisjes (figuur 1A).</li>
		<li>Verwijderen van het centrum-gebied binnen de binnenste lip van de deksels (wanneer bekeken vanaf de onderkant, figuur 1B) met behulp van een bunsenbrander en een sonde van ruwijzer of een soldeerbout of stapte boor bits. Opmerking: Gebruik van warmte te snijden van de plastic deksel is beter dan een mes omdat er minder risico van verwonding.</li>
		<li>Schoon en zand van gesneden randen en top van het oppervlak met een gebogen bestand of een rotary tool (bijvoorbeeldDremel) slijpen. Zie Figuur 1 c.</li>
		<li>Knip de cirkel van de monofilamenten Maas aan de juiste diameter (Figuur 1 d). Voor dit, het traceren van een deksel op een monofilament nylon mesh vel en snijd net binnen de getekende lijn.</li>
		<li>Snijd de groeven/schuine strepen in de oppervlaktelaag van de deksels ter verbetering van de hechting van de twee deksels wanneer lijm wordt toegepast op de plastic (figuur 1E).</li>
		<li>Reinig de deksels met ethanol en laat ze drogen.</li>
		<li>Cyanoacrylaat lijm toepassen op de bovenkant van beide deksels, houden aan de buitenrand. Opmerking: een beetje lijm gaat een lange weg.</li>
		<li>Leg de monofilamenten mesh, volgens tabel 1, op één gelijmd deksel (figuur 1F). Plaats het tweede deksel ondersteboven op de top van de Maas; beide deksels moet samen hun toppen. Druk op stevig samen (figuur 1G). Zorg ervoor dat de strik strak. Opmerking: als een veiligheidsmaatregel, gebruik pincet te plaatsen van de Maas op de deksels.</li>
		<li>Zodra de eerste laag van de lijm is opgedroogd, een ring van Cyanoacrylaat lijm rond de buitenste kloof tussen de deksels van toepassing. Wees gul als dit integriteit voegt en een peeling uit elkaar of lekkende voorkomt.</li>
		<li>Label het filter met de maaswijdte van de porie van de Maas monofilament. Opmerking: Hier, gebruiken we twee maaswijdten porie — 20 µm en 50 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocol gebruiken
	<ol>
<li>Vooraf natte zeef.<ol>
<li>Pipetteer een zoutoplossing, zoals M9 [5 g NaCl, 6 nb2HPO4g, 3 g van KH2PO4, 1 L ultrazuiver H2O en 1 mL van MgSO4 (1 M)]17, dwars door de zeef tot een druppel vormen , condenseert en druipt uit het midden van de onderzijde van de filter (figuur 2A). Desgewenst een pluisvrije doekje (bijvoorbeeldKimwipe) van toepassing op de bodem naar vorm of verspreiden van een druppel vocht op de Maas.</li>
			<li>Plaats de zeef boven een conische tube van 50 mL. Label de buis als 'Afval tube' (figuur 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wassen van een bevolking van C. elegans uit een agarplaat.<ol>
<li>Wassen van de plaat met de M9 buffer en plaatst u het medium worm-bevattende aan de bovenzijde van de monofilamenten Maas 1 mL tegelijkertijd (figuur 2C). Zorg ervoor om te werken in het midden van de Maas. Wassen alle wormen van de plaat. Opmerking: 3 mL M9 voor een 60 mm plaat is meestal voldoende.</li>
			<li>Om te minimaliseren van het aantal wormen verloren in pipetteren, een glazen pipet van Pasteur Hiermee kunt de wormen uit de plaat en op het gaas center (Herhaal zo nodig).</li>
			<li>Spoel het filter met de M9 buffer vanaf de bovenkant. Nogmaals, zorg ervoor om te opereren in het midden van de Maas en spoel alle wormen in dat gebied. Wassen zoveel keer als nodig is om ervoor te zorgen dat alle bacteriën en kleinere wormen zijn gepasseerd via de Maas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Oogst de grootte-matched dieren uit de zeef.<ol>
<li>Bevestig een nieuwe conische tube van 50 mL aan de bovenkant van de zeef met de volwassen wormen uit stap 1.2.2.3 geconfronteerd met de binnenkant van de nieuwe collectie-buis (figuur 2D).</li>
			<li>Verwijder de eerste buis (afval buis) en snel flip-over de zeef en nieuwe buis om te voorkomen dat de druppel migreren (afbeelding 2E). Opmerking: Als steriliteit niet vereist is, gebruik een pluisvrije doekje (bvKimwipe) om wick vloeistof vanaf onderkant van het net vóór het wegknippen.</li>
			<li>Spoel de gaas met M9 in de nieuwe tube van 50 mL van de nieuwe bovenzijde (figuur 2F). Opnieuw, werken in het centrum van mesh en onderhouden van een druppel aan de onderzijde van de Maas.</li>
			<li>Toestaan dat de wormen te regelen of laat ze zachtjes naar beneden (bijvoorbeeld< 16 x g) voor ongeveer 1 minuut (Figuur 2 g).</li>
			<li>De bufferoplossing uit de pellet van wormen, ideaal gecombineerd tot > 0,5 mL, of verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder de pellet te verstoren.</li>
			<li>Pipetteer met behulp van een glazen pipet van Pasteur op een bord NGM wormen en laat ze drogen. Ruimte meerdere druppels uit op een nieuwe plaat zodat ze sneller (Figuur 2 H drogen).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinig de zeef.<ol>
<li>Spoel de zeef voorzichtig en grondig met ethanol en omgekeerde-osmose water. Laat het drogen.</li>
			<li>Bewaar het in een schone container voor onbepaalde tijd toekomstig gebruik.</li>
			<li>Gooi het wanneer de Maas een "sag" uitstraling ontwikkelt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bevestiging van Caenorhabditis zeef sorteermethode
<ol><li>Algemeen onderhoud
	<ol>
<li>Voor alle experimenten, cultuur wormen op een standaard Nematode groei Media17 (1 L voor NGM bestaat uit 2,5 g pepton, 17 g agar, 3 g NaCl, 975 mL tweemaal gedestilleerd water, 1 mL 5 mg/mL cholesterol, 1 mL van de 1 M CaCl2 1 mL van de 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4en 0,5 mL 100 mg/mL streptomycine) bij 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentele behandeling administratie
	<ol>
<li>Vergelijk de drie behandelgroepen: pick, fluorodeoxyuridine (FUDR), en Caenorhabditis zeef.<ol>
<li>Voor de FUDR behandelde groep, 100 mg/mL FUDR toevoegen aan de NGM media om een eindconcentratie van 100 μM om te voorkomen dat de productie van nakomelingen en overbrengen in de wormen om de andere dag een verse NGM plaat om te voorkomen dat voedsel uitputting.</li>
			<li>Voor de pick-groep, selecteer en breng de wormen handmatig met behulp van een platina entoog.</li>
			<li>Voor de Caenorhabditis zeef behandelde groep, voert u stap 1.2 en Pipetteer de wormen op een bord NGM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caenorhabditis Zeef percentage opbrengst
	<ol>
<li>Om te meten hoe effectief de zeef is bij het sorteren van C. elegans, leeftijd-synchrone N2 dieren groeien tot dag 1 van volwassenheid bij 25 ° C (dat wil zeggen, 48 uur na het leggen van eieren) en breng hen door het plukken van hen aan verse NGM platen (totaal N = 50 of N = 100 dieren per tre atment groep).</li>
		<li>Na 24u van herstel, de bevolking naar nieuwe NGM platen overbrengen met de Caenorhabditis zeef na het bovenstaande protocol (zie stap 1.2) en het aantal met succes overgebrachte dieren.</li>
		<li>De opbrengst van percentage worden berekend als de verhouding van het aantal dieren overgedragen in vergelijking met het beginnummer aan het begin van de overdracht vermenigvuldigd met 100 (%).</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan testen Opmerking: Score healthspan parameters van de motiliteit klasse, de faryngaal pomp tarief, en zowel de voorste en de achterste zachte touch antwoord op dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid voor leeftijd-gesynchroniseerde N2 dieren onderhouden bij 25 ° C.<ol>
<li>Motility bijhouden<ol>
<li>Toewijzen van beweeglijkheid scores gebaseerd op een klasse gebaseerde systeem (klassen A, B en C) de methoden van Herndon et al. na 18. vergelijken van de effecten van de drie experimentele groepen met behulp van een ordinale logistieke statistieken model in statistische analysesoftware. Opmerking: Klasse A individuen gaan spontaan in een normale, sinusvormige patroon. Klasse B individuen verplaatsen in sterk niet-sinusvormige bewegingen en vereisen porren ter bevordering van de beweging. Klasse C individuen verplaatsen hun hoofd en/of staart in reactie op te porren, maar zijn niet in staat om over de agar te bewegen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Faryngaal pomp tarief<ol>
<li>Tellen van het verkeer van de grinder van van het dier terminal faryngaal lamp visueel onder een stereomicroscoop op een 600 X laatste vergroting voor 1 min.</li>
			<li>Een statistische analyse met een one-way ANOVA met α = 0,05 en Bonferroni na tests met α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Drukpunt<ol>
<li>Een zachte touch antwoord opnemen en vergelijk tussen de drie behandelgroepen. Uitvoeren van de tests op basis van de methoden die worden beschreven door Calixto et al. 19.</li>
			<li>Record de anterior en posterior touch antwoord door zachtjes strelen een wimper pick loodrecht op de staart of het hoofd (elk 5 x, afwisselend kop en staart) van de dieren.</li>
			<li>Score van elke beweging in de tegenovergestelde richting van de lijn vanaf 1 punt op een schaal van 0 tot en met 5 voor zowel de voorste als de achterste reactie.</li>
			<li>Statistische analyse met een one-way ANOVA met α = 0,05 en Bonferroni na tests met α = 0,05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Vruchtbaarheid test
	<ol>
<li>Om te bepalen van het gebruik van Caenorhabditis zeef van invloed op de voortplanting, leeftijd-synchrone N2 dieren groeien tot dag 2 van volwassenheid bij 25 ° C.</li>
		<li>60 h na ei leggen, dieren aan nieuwe NGM platen met een platina pick of de Caenorhabditis zeef en geeft ze 4 uur om te herstellen (droge de gezeefde platen voor 20 – 30 min).</li>
		<li>Na herstel, individueel plaat de dieren via een wimper NGM platen uitkiest, geef ze 24 h om eieren te leggen, en het verwijderen van de dieren. Toestaan dat de nakomelingen op elke plaat te ontwikkelen onder normale omstandigheden bij 25 ° C voor een andere 24 h. Opmerking: Een wimper pick is een menselijke wimper beveiligd aan het einde van een pipet van Pasteur met nagellak en gesteriliseerd met ethanol.</li>
		<li>Het aantal levensvatbare F1 generatie individuen. Uitvoeren van een statistische analyse met behulp van een T-toets met α = 0,05. Opmerking: Levensvatbare nakomelingen worden beschouwd als eieren die met succes uitkomen en beginnen hun ontwikkeling door middel van de regelmatige larvale cycli.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescerende verslaggever stress reactie testen
	<ol>
<li>Uitvoeren van drie veelgebruikte fluorescerende verslaggever testen om te ontdekken van potentiële markeringen van stress: een translocatie van de DAF-16::GFP in de kernen van cellen in een stam [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; een hsp-16.2 expressie [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; en een graszode-3 expressie [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]-22.</li>
		<li>Voor elke assay, cultuur leeftijd-synchrone dieren uit de drie behandelgroepen bij 20 ° C en ze op dag 3 van volwassenheid behandelen: gebruik een negatieve controle (transfer op een dagelijkse basis, een groep dieren handmatig met een platina pick), een positieve controle (op een dagelijkse basis overdracht van een groep dieren handmatig met een platina pick plus een gevestigde stressor), en de Caenorhabditis zeef (de dieren passeren door een zeef en laten herstellen voor 30 min op NGM net voor imaging).</li>
		<li>In het DAF-16::GFP assay schok warmte de dieren van de positieve controle bij 37 ° C gedurende 30 minuten vóór20imaging. Voor de hsp-16.2 assay schok warmte de dieren van de positieve controle voor 90 min, 20 h vóór21imaging. Voor de graszode-3 assay, omgaan met de positieve controledieren met 100 mM paraquat voor 4 uur vóór22imaging.</li>
		<li>Oogst de wormen onmiddellijk met een wimper pick en monteren ze tot een dekglaasje aan met 1 μL van een 36% poloxamer 407 oppervlakteactieve stof oplossing voor het immobiliseren van de wormen.</li>
		<li>Sandwich van de gemonteerde wormen met een dekglaasje aan. Monteer de twee coverslips naar een standaard glasplaatje microscopie en image de wormen met behulp van een 8 X vergroting op een omgekeerde fluorescente microscoop (voor een algemene vergroting van 80 X) en een constante blootstelling met een FITC-filter.</li>
		<li>U wilt het opsporen van eventuele verschillen tussen de drie groepen in de bepaling van de DAF-16::GFP, categoriseren de dieren die op basis van de locatie van de DAF-16::GFP verslaggever (nucleaire als de verslaggever translocated aan kernen, cytosolische als de verslaggever in cytosol en tussenliggende als gelegen de verslaggever gelegen in de kernen zowel cytosol).</li>
		<li>Vergelijk de resultaten met behulp van een statistisch model van ordinale logistiek in statistische analysesoftware. Voor de hsp-16.2 en de graszode-3 expressie testen, gebruik een one-way ANOVA met α = 0,05 en de Tukey post hoc tests met α = 0,05 te vergelijken de totale fluorescentie van de hoofd regio.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_hermcellfate/hermcellfate.html">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_amchnosensation/amchnosensation.html">Assaying mechanosensation.</a> WormBook. , (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+Mitochondrial+Superoxide+Dismutase+sod-2+Extends+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (2), e1000361(2009).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), e85964(2014).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li>
<li>Argon, Y., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+fertilization-defective+mutants+with+abnormal+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm.</a> Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).</li>
<li>Lee, S. J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+longevity+response+to+temperature+by+thermosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+Development%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Temperature+Differentially+Modulates+C.+elegans+Longevity+through+a+Thermosensitive+TRP+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel.</a> Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).</li>
<li>Michaelson, L. C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-2540.2000.0745d.x">C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5.</a> Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Henderson, S. T., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+integrates+developmental+and+environmental+inputs+to+mediate+aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).</li>
<li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li>
<li>Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li>
<li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li>
<li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+neuron+aging%3A+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173(2016).</li>
<li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001(2016).</li>
<li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li>
<li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li>
<li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van eventuele commerciële of financiële relaties kan worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.

We geïntroduceerd hierin, het ontwerp en gebruik van een toegankelijke, effectieve Caenorhabditis zeef als een instrument voor het sorteren en het onderhouden van C. elegans. Dit hulpmiddel heeft verschillende voordelen aan het handmatig plukken van individuele dieren, het wassen van populaties, chemische behandelingen (bijvoorbeeldFUDR) of duurder methoden van laagniveau dieren. Ten eerste, de Caenorhabditis zeef efficiënt en snel (minder dan 20 min) sorteert nakomelingen van grote ge...

De nematode worm, Caenorhabditis elegans, is een premier model-organisme. Naast het eenvoudig en gecontroleerde karakter van hun teelt in het laboratorium, hun gehele genoom is gesequenceerd1 en het ontwikkelings lot van elke cel2is bekend. Als gevolg van deze functies is C. elegans een veel gebruikte modelorganisme voor genetische studies. Nochtans, samen met deze gunstige kenmerken komen sommige uitdagingen voor onderzoekers. Als gevolg van hun snelle generatietijd, C. elegans populaties kunnen snel opraken van voedsel en/of populaties met meerdere generaties worden gemengd en ontwikkelingsstadia presenteren in een keer. Zo vereisen experimenten uitgevoerd op solide nematode groei media (NGM) onderzoekers om fysiek naar dieren verse platen voordat de bacteriële voedselbron uitput en nieuwe larven ontwikkelen. Dit kan vervelend zijn als een frequente overbrengen van de dieren is nodig om te voorkomen dat de experimentele populaties van steeds vermengd met generaties nakomelingen. Enkele experimenten vereisen nog, beide grote aantallen dieren en langere tijd punten (bijvoorbeeld, DNA of RNA extractie in volwassenheid). Deze verbindingen de uitdagingen van nauwkeurig vasthouden van een gesynchroniseerde bevolking en de overdracht van grote aantallen dieren.
Huidige methoden van de overdracht van C. elegans gekweekte op NGM zijn plukken of wassen van de dieren uit plaat op plaat; chemisch behandeling van de dieren (bijvoorbeeldmet de DNA-replicatie remmer fluorodeoxyuridine of FUDR); of stroom cytometry gebruikt voor het sorteren van de dieren in de multi goed platen. Picken impliceert het gebruik van een handje, gemaakt met een dunne draad van platina of een wimper, handmatig overbrengen individu of meerdere dieren3,4. Deze methode is nauwkeurig maar vereist zowel de vaardigheid en de tijd en is een beperking voor studies waarbij grote aantallen dieren. Mei ook plukken worden fysiek schadelijk en stressvolle tot aan de dieren door individuen mogelijk te onderwerpen aan onnatuurlijk en inconsistent bedragen van verstoring en kracht. Wassen gaat spoelen van een cultuur-schotel met een bufferoplossing en overbrengen van de oplossing met de dieren via glazen pipet van Pasteur aan een nieuwe plaat van de cultuur. Deze methode is snel en efficiënt, maar is niet juist als meerdere generaties en ontwikkelingsstadia van dieren worden overgebracht in bulk. Chemische behandelingen, zoals FUDR, kunnen worden ontbonden in de kweken media om te voorkomen dat de productie van nakomelingen door het blokkeren van een DNA-replicatie, en dus de gameet-productie en ei-ontwikkeling. Tijdje effectief, deze methode moet worden toegepast na developmental rijping over niet verstoren de normale ontwikkelings processen, en dit betekent dat er nog steeds sprake is van een eis tot overdracht van de dieren vóór haar administratie3. Deze methode beïnvloedt ook meerdere mobiele signalering van trajecten, wat resulteert in merkbare gevolgen voor de dieren, naarmate zij ouder worden (b.v., een verlenging van de levensduur of een gewijzigde proteostasis) afhankelijk van de stam van C. elegans gebruikt5, 6,7,,8,,9,10. Stroom cytometry methoden automatisch sorteren en individuele C. elegans van één Multi goed bord overbrengen in een andere11. Hoewel deze methode zeer effectief en efficiënt is, is stroom cytometry apparatuur onbetaalbaar duur en ontoegankelijk voor veel onderzoekers. Een alternatief voor het overbrengen van de dieren is het gebruik van mutant modellen die zijn temperatuur gevoelig, zoals fer-15 en fem-1, die steriel met temperatuur aanpassing12geworden. Terwijl met behulp van mutant dieren nuttig in sommige situaties is, deze specifieke stammen groeien langzamer dan wild-type dieren en ze rekenen op een gewijzigde genoom, arme vertegenwoordigers voor veroudering of gezonde wormen bijeenkomen. Bovendien, de afhankelijkheid van een verschuiving van de temperatuur ertoe steriliteit resulteert ook in het ontbreken van een statische omgeving en temperatuurveranderingen gemakkelijk is aangetoond dat de invloed van gen expressies13,14, 15. onderzoeksgroepen technieken met een beschrijving van het gebruik van een Maas wilt filteren C. elegans grootte16eerder hebt gepubliceerd. Maar waren we niet in staat om vorige werk testen op eventuele wijzigingen in de algemene gezondheidsresultaten dat geassocieerd met het gebruik van deze filters worden kunnen te vinden.
Er is dus behoefte aan een binnen de Gemeenschap van C. elegans onderzoek een betaalbare, efficiënte, snelle en nauwkeurige methode voor het overbrengen van grote aantallen dieren tussen cultuur platen. We hebben een verbeterde, toegankelijke stuk van apparatuur (genoemd de Caenorhabditis zeef) en een bijbehorende protocol voor de fabricage en de werking die voldoet aan de behoeften van de onderzoekgemeenschap C. elegans ontwikkeld. Hierin delen we het ontwerp van de Caenorhabditis zeef en methoden voor het gebruik ervan, en we laten zien dat het gebruik ervan heeft geen gevolgen voor de gezondheid van de gemeenschappelijk of eventuele stress markeringen in vergelijking met standaard manuele picking en een behandeling met de veelgebruikte, beperking van de vruchtbaarheid chemische FUDR.

<table><tbody><tr><td>Veiligheidsbril</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Beschermende hittebestendige handschoen</td><td>Grainger</td><td>Artikelnr. 3AT17 Mfr. Modelnr. 3AT17 Cataloguspaginanr. 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buis</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisch nylon gaas</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 en NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Tang</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel-gereedschap met cirkelvijl</td><td>Lowe's</td><td>Artikelnr. 525945 Modelnr. 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicaliën (NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plaat chemicaliën (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, Cholesterol, Streptomycine)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone), Lab express (agar), Sigma (rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydraat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis zeef: een low-tech instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een reeds lang gevestigde model-organisme gebruikt in een heel scala van fundamenteel en biomedisch onderzoek. Binnen de nematode onderzoeksgemeenschap is er een behoefte aan een betaalbare en effectieve manier om grote, leeftijd-matched populaties van C. elegans. Hier presenteren we een methode voor het mechanisch sorteren en reiniging van C. elegans. Ons doel is om een rendabel, efficiënt, snel en eenvoudig proces om te verkrijgen van dieren van uniforme afmetingen en levensfasen voor hun gebruik in experimenten. Deze tool, zeef Caenorhabditis hanteert een custom-built deksel die draden op gemeenschappelijke conische lab buizen en sorteert C. elegans gebaseerd op lichaamsgrootte. We laten ook zien dat de Caenorhabditis zeef effectief dieren van één cultuur plaat brengt naar een ander toe te staan voor een snelle sorteren, synchroniseren, en het schoonmaken zonder de beïnvloedende markers van gezondheid, met inbegrip van de motiliteit en stress-afleidbare gen de verslaggevers. Deze toegankelijk en innovatieve tool is een snelle, efficiënte en niet-stressvolle optie voor het handhaven van C. elegans populaties.

De Caenorhabditis zeef bestaat uit 2 schroefdoppen, beveiligen van een gebied met een geweven nylon monofilament maaswijdte kleiner zijn dan de diameter van het lichaam van de gewenste developmental leeftijd, gebruikt voor het onttrekken van levende populaties van organismen met behulp van een eenvoudige wassen techniek. Het hecht aan standaard conische buizen en gebruikt het scherm mesh mechanisch dieren sorteren door de diameter van het lichaam, waardoor de gewenste dieren in d...

Het huidige protocol bevat een methode voor het sorteren en het schoonmaken van leeftijd-matched populaties van Caenorhabditis elegans. Het gebruikt een eenvoudig, goedkoop, en efficiënt instrument is op maat te verkrijgen een grote experimentele populatie van nematoden voor onderzoek.

Caenorhabditis Zeef: Een Low-tech Instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de moleculaire biologie, met betrekking tot analyses die specifieke ontwikkelingsstadia van C.elegans vereisen. Bijvoorbeeld analyses van gen- en eiwitexpressieniveaus. Het voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om nauwkeurig en efficiënt grote aantallen C.elegans te selecteren op basis van lichaamsgrootte, wat het gebruik van analyses mogelijk maakt die normaal gesproken tijd- en kostenintensief zouden zijn.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ze de boogvormige draai-stap niet kunnen uitvoeren of omdat ze de oplossingsstroom niet in het midden van het gaas houden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de was- en omdraai-stappen moeilijk te leren zijn. Sommigen kunnen moeite hebben met het interpreteren en visualiseren van specifieke bewegingen in tekst.Om te beginnen, verwerft u twee 50 mL conische buizen met deksels en gebruikt u een trapvormige boor om het midden van de binnenlip van de deksels te verwijderen. Gebruik indien nodig een vijl, schuurpapier of een rotatiegereedschap om de randen en bovenkanten van de deksels schoon te m

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video beschrijft een methode om hele wormen te dissocieren in een eencellige suspensie die geschikt is voor FACS of immunoprecipitatie van intacte cellen.

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: Een methode om levende cellen te isoleren

Source: Morgan, E., et al. Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a protocol for isolating intestinal bacteria of interest from wild Caenorhabditis worms. The worms are first starved and washed to eliminate residual feeding bacteria from their surface and intestinal lumen while preserving the target microbes. After surface cleaning and multiple crawling steps, the worms are dissected to extract...

Selective Cleaning of Caenorhabditis Worms for Enrichment of Intestinal Microbiota

De wormsorter vergemakkelijkt genetische screens in Caenorhabditis elegans door het sorteren wormen volgens expressie van fluorescerende verslaggevers. Hier beschrijven we een nieuw gebruik: sorteren volgens kolonisatie door een GFP-expressie ziekteverwekker, en we gebruiken het om de slecht begrepen rol van pathogeen herkenning bij het initiëren van immuunreacties te onderzoeken.

Geautomatiseerde Scheiding van<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

Om Caenorhabditis elegans (C. elegans) te gebruiken in omics-onderzoek, is een methode nodig om grote populaties wormen te genereren waar een enkel monster kan worden gemeten op verschillende platforms voor vergelijkende analyses. Hier wordt een methode gepresenteerd om C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCPs) te culteren en de bevolkingsgroei te documenteren.

Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

Dit protocol schetst een methode voor het efficiënt extraheren van levende nematoden uit natuurlijke substraten in het veld.

Snelle isolatie van wilde nematoden door Baermann Funnel

Dit protocol kan worden gebruikt om grootschalige ecologische onderzoeken uit te voeren van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden . Het belangrijkste voordeel van deze methode is de efficiënte organisatie en analyse van ecologische en moleculaire gegevens die verband houden met de nematoden die uit de natuur zijn verzameld.

Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het isoleren van darmen van volwassen Caenorhabditis elegans nematodewormen met de hand voor input in genomica, proteomica, microbioom of andere testen.

Handdissectie van Caenorhabditis elegans Darmen

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelsoorten in de biologie, maar bijna al het onderzoek wordt uitgevoerd in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde microben. De hier beschreven methoden zullen helpen om ons begrip van de diversiteit van geassocieerde microben te verbeteren als basis voor toekomstig functioneel C. elegans-onderzoek .

Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Leer een efficiënte methode om Caenorhabditis elegans te sorteren op lichaamsgrootte met een zelfgemaakt zeefinstrument. Deze techniek bespaart tijd en kosten bij moleculair biologische assays.

Caenorhabditis Zeef: Een Low-tech Instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen

Meer video's verkennen