Caenorhabditis Zeef: Een Low-tech Instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen
4 juli 2018
Het huidige protocol bevat een methode voor het sorteren en het schoonmaken van leeftijd-matched populaties van Caenorhabditis elegans. Het gebruikt een eenvoudig, goedkoop, en efficiënt instrument is op maat te verkrijgen een grote experimentele populatie van nematoden voor onderzoek.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de moleculaire biologie, met betrekking tot analyses die specifieke ontwikkelingsstadia van C.elegans vereisen. Bijvoorbeeld analyses van gen- en eiwitexpressieniveaus. Het voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om nauwkeurig en efficiënt grote aantallen C.elegans te selecteren op basis van lichaamsgrootte, wat het gebruik van analyses mogelijk maakt die normaal gesproken tijd- en kostenintensief zouden zijn.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ze de boogvormige draai-stap niet kunnen uitvoeren of omdat ze de oplossingsstroom niet in het midden van het gaas houden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de was- en omdraai-stappen moeilijk te leren zijn. Sommigen kunnen moeite hebben met het interpreteren en visualiseren van specifieke bewegingen in tekst.
Om te beginnen, verwerft u twee 50 mL conische buizen met deksels en gebruikt u een trapvormige boor om het midden van de binnenlip van de deksels te verwijderen. Gebruik indien nodig een vijl, schuurpapier of een rotatiegereedschap om de randen en bovenkanten van de deksels schoon te maken en te schuren. Snijd vervolgens een schijf van nylon monofilament geweven gaas, iets kleiner dan de diameter van het deksel.
Textureer de bovenoppervlakken van de deksels en reinig ze met ethanol. Laat de deksels drogen en breng vervolgens cyanoacrylaatlijm aan op de bovenoppervlakken van beide deksels. Leg vervolgens de monofilament gaas schijf op een gelijmd deksel.
Keer het tweede deksel om en druk de deksels stevig op elkaar. Nadat de eerste laag lijm is opgedroogd, brengt u een royale ring van cyanoacrylaatlijm aan rond de buitenste opening tussen de deksels. Label vervolgens het filter met de bijbehorende gaas poriegrootte.
Plaats eerst het zeefje over een gelabelde 50 mL conische buis. Pipet vervolgens zoutoplossing door het midden van het zeefje totdat een druppel zich vormt, samenvloeit en van het midden van het filter druppelt. Gebruik M9-buffer om een populatie van C.elegans van een augerplaat te wassen en gebruik vervolgens een glazen pasteurpipet om de buffer met de wormen over te brengen naar de bovenkant van het monofilament gaas.
Werkend in het midden van het gaas, spoelt u het filter af met M9-buffer, herhaalt u deze spoel-stap zo nodig om alle bacteriën en kleinere wormen door het gaas te laten passeren. Bevestig vervolgens een nieuwe 50 mL conische buis aan de bovenkant van het zeefje, de eerder verzamelde wormen die groter zijn dan de poriën in het gaas zullen naar de binnenkant van de nieuwe buis zijn gericht. Verwijder de afvalbuis en draai snel het zeefje om.
Spoil vervolgens het gaas met M9-buffer in de nieuwe opvangbuis. Laat de verzamelde wormen ongeveer een minuut bezinken en zuig vervolgens voorzichtig de bufferoplossing weg van de pellet wormen. Maak met een glazen pasteurpipet druppels wormen op een NGM-plaat en laat ze drogen.
Spoil ten slotte het zeefje met omgekeerd osmosewater en ethanol. Nadat het zeefje is opgedroogd, bewaar het in een schone container voor toekomstig gebruik. Gooi het zeefje weg wanneer het een doorhangende uitstraling krijgt.
In dit protocol werd een zeef geconstrueerd om leeftijdsgematchte populaties van C.elegans te sorteren en schoon te maken. Dieren in de zeefbehandelingsgroep vertoonden gedurende de volwassenheid een normaal en spontaan bewegingspatroon. Bovendien vertoonden de pick- en zeefgroepen geen significante verschillen in faryngeale pompsnelheid.
Dieren in de zeefgroep reageerden ook normaal op anterieure of posterieure mechanische stimuli in vergelijking met alle behandelingsgroepen op alle testdagen. Ten slotte werd de vruchtbaarheid van de behandelingsgroepen vergeleken; het gebruik van de zeef had geen significant effect op het aantal nakomelingen in vergelijking met de pick-behandelingsgroep. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan tien minuten worden uitgevoerd.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat u in het midden van het gaasgebied moet werken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een Caenorhabditis zeef kunt assembleren en op de juiste manier kunt gebruiken om wormen te sorteren op lichaamsgrootte.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methodologie voor het sorteren en schoonmaken van populaties Caenorhabditis elegans met een gelijke leeftijd met behulp van een speciaal vervaardigd hulpmiddel. Het stelt onderzoekers in staat om efficiënt en kostenbesparend een grote experimentele populatie te verkrijgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Moleculaire biologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Specifieke ontwikkelingsstadia van C.elegans zijn cruciaal voor diverse assays.
- Assays kunnen betrekking hebben op gen- en eiwitexpressieniveaus.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en kostbaar zijn.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het begrijpen van de methodologie.
Doel van de studie
- Om een efficiënte methode te bieden voor het selecteren van C.elegans op basis van lichaamsgrootte.
- Om assays te vergemakkelijken die specifieke ontwikkelingsstadia vereisen.
- Om de toegankelijkheid voor onderzoekers die nieuw zijn met deze techniek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Op maat gemaakt instrument voor het sorteren van nematoden.
- Boogvormige omkeerstap voor effectieve wassing.
- Behoud van de vloeistofstroom in het centrum van het gaas.
- Visuele demonstraties ter ondersteuning van het leerproces.
Belangrijkste resultaten
- Nauwkeurige selectie van grote aantallen C.elegans is gerealiseerd.
- De methode vermindert de tijd en kosten voor moleculaire biologie-assays.
- Verbeterd begrip van specifieke bewegingen door middel van visuele hulpmiddelen.
- Verbeterde toegankelijkheid voor onderzoekers die niet bekend zijn met de methode.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het sorteren van C.elegans.
- Visuele hulpmiddelen zijn essentieel voor het effectief aanleren van de techniek.
- Deze methodologie kan een aanzienlijk voordeel bieden voor moleculair-biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Topposities
In biofarma R&D is het verkrijgen van gesynchroniseerde populaties van modelorganismen zoals C. elegans cruciaal voor reproduceerbare fenotypische screening en target-validatie-assays. De Caenorhabditis-zeef maakt snelle, kosteneffectieve sortering op basis van lichaamsgrootte mogelijk, waardoor de tijd- en resourcebelasting in vroege discovery-workflows wordt verminderd. Dit ondersteunt het voorspellend vertrouwen in de assay-gereedheid en portfolio-triage door uniforme biologische input te garanderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van leeftijd-gecorreleerde wormpopulaties voor consistente fenotypische resultaten.
- Operationele waarde: Biedt een kostenefficiënte, schaalbare methode om gesynchroniseerde cohorten te genereren zonder gespecialiseerde apparatuur.
- Voorspellende waarde: Vermindert biologische variabiliteit in assays, waardoor de betrouwbaarheid van gegevens voor target de-risking wordt verbeterd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door specifieke ontwikkelingsstadia te isoleren.
- Operationele waarde: Standardiseert de voorbereiding van wormen, waardoor de reproduceerbaarheid over assay-platen en screeningcampagnes wordt verbeterd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt high-throughput behoeften door snelle verwerking van grote wormpopulaties in minder dan tien minuten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Handhaaft de fenotypische getrouwheid van ontdekking tot preklinische validatie door het behoud van markers voor motiliteit, stressrespons en fecunditeit.
- Mechanistische Risicoreductie: Maakt een betrouwbare beoordeling van gen- en eiwitexpressieniveaus in gesynchroniseerde populaties mogelijk, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Faciliteert go/no-go-beslissingen door consistente input van modelsystemen te leveren voor effectiviteits- en toxiciteitsprofielering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De Caenorhabditis-zeef past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie, en ondersteunt specifiek de assay-gereedheid en screening-reproduceerbaarheid voor fenotypische screens op basis van C. elegans.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door uniforme wormpopulaties te leveren voor het verhelderen van signaalpaden en functionele screening.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via sortering op basis van grootte, waardoor een consistente wormgrootte en -fase wordt gewaarborgd voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Genereert kwantitatieve, op grootte gescheiden outputs waarmee teams condities over verschillende ontwikkelingsstadia heen kunnen vergelijken met minder ruis.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door belangrijke gezondheidsmarkers (motiliteit, stressrespons, fecunditeit) na de sortering te behouden, wat de validiteit van biomarkers ondersteunt.
- Bedrijfbrede Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar instrument met weinig onderhoud voor verschillende teams en projecten, wat standaardisatie in de omgang met modelorganismen bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door vermindering van mechanistische ambiguïteit in fenotypische assays.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor de preparatie van wormen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium via vroege risicoreductie.
- Impact op portfolio: Risicogecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van betrouwbare, stadiumspecifieke gegevens van modelsystemen.
Overwegingen voor implementatie
- Basis laboratoriumvaardigheden voor het assembleren van de zeef en het hanteren van oplossingen zijn vereist.
- Toegang tot conische buizen, nylon gaas, cyanoacrylaatlijm en standaard buffers (M9, zoutoplossing) is nodig.
- Cross-team training over de juiste werkwijze met het gaas en de fliptechniek is noodzakelijk om consistentie te waarborgen.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten de selectie van de maaswijdte voor de doelstadia van de wormen en compatibiliteit met diverse NGM- of vloeibare cultuursystemen.
- Praktische beperkingen omvatten het mogelijke doorhangen van het gaas na verloop van tijd, waardoor periodieke vervanging nodig is om de nauwkeurigheid van de sortering te behouden.
