Name: Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer de FLIPS-methode voor het versterken en sequencen van volledige HIV-1 provirussen uit enkele geïnfecteerde cellen. Deze techniek helpt onderzoekers de latent reservoir te begrijpen en replicatiecompetente virussen te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund de Delaney AIDS onderzoek onderneming (DARE) om te zoeken naar een remedie (1U19AI096109 en 1UM1AI126611-01); een amfAR Research Consortium op HIV uitroeiing (ARCHE) Collaboratief onderzoek subsidie van de Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australian Centre for HIV en Hepatitis Virologie onderzoek (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); en de Australische nationale gezondheids- en medische Onderzoeksraad (AAP1061681). Wij zouden graag willen bedanken Dr. Joey Lai, Genomics Facility Manager bij de Westmead Institute for Medical Research voor zijn opleiding in bibliotheek voorbereiding en het gebruik van zijn faciliteit en het Ramaciotti-centrum voor genomica (Universiteit van New South Wales, Sydney, Australië) voor het uitvoeren van sequencing. Wij erkennen met dankbaarheid de deelnemers die gedoneerd monsters voor deze studie.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De FLIPS assay is een efficiënte en hoog-productie methode voor frequentiebanden te versterken en sequencing honkslag, in de buurt van full-length HIV-1 proviruses. Meerdere factoren en kritische stappen in het protocol die invloed hebben op het aantal en de kwaliteit van de sequenties die verkregen zijn geïdentificeerd. Ten eerste, het aantal cellen en de HIV-1 infectie frequentie de celpopulatie invloed op het aantal proviruses versterkt. Bijvoorbeeld, in een eerdere publicatie, ongeveer de helft zoveel sequenties werden verkregen uit hetzelfde aantal naïef CD4+ T cellen ten opzichte van effector geheugen CD4+ T cellen. Dit komt doordat naïef cellen meestal een lagere frequentie van de infectie dan effector geheugen cellen2 hebben. Ten tweede is de lysis van de cel beter dan kolom gebaseerde extractiemethoden voor het verkrijgen van genomic DNA als er geen risico is van het verliezen van DNA in het extractieproces. Tot slot, net als bij een PCR-gebaseerde assay, voorkomen van besmetting is van cruciaal belang. Gescheiden schone gebieden moeten worden aangewezen voor het voorbereiden van meester mixen, behandeling van genomic DNA, positieve controles, DNA zuivering en kwantificering en voorbereiding van de bibliotheek toevoegen. Dit is vooral belangrijk voor single-kopie assays zoals degene die hier gepresenteerd.
Uitvoering van de FLIPS bepaling dient eerst een positieve controle zoals pNL4-3 plasmiden in plaats van deelnemer monsters uitgevoerd. Hierdoor kan voor elke probleemoplossing voorafgaand aan het gebruik van HIV-1 positieve cellen, zoals de sequenties die verkregen kunnen worden vergeleken met beschikbare referentie sequenties voor deze plasmiden. Bij het gebruik van HIV-1 positieve cellen, is het belangrijk om te overwegen het HIV-1-subtype (inleidingen ontworpen voor FLIPS specifiek voor subtype B zijn) en de frequentie van de besmetting van de bevolking van de cel als weinig tot geen proviruses worden versterkt. Primer sequenties kunnen worden gewijzigd/ontworpen aan andere subtypen. Bovendien, moet een putje met een positieve controle worden opgenomen in elke PCR uitgevoerd.
Salto heeft het overwinnen van de beperkingen van eerdere sequencing tests, met inbegrip van SPS. Door middel van frequentiebanden te versterken en de sequencing in de buurt van full-length HIV-1 proviruses, kunnen FLIPS bepalen de potentiële replicatie-bekwaamheid van HIV-1 proviruses. Dit was niet mogelijk met behulp van SPS, die gesequentieerd alleen sub-genomic regio's en daarom geselecteerd voor sequenties met intact primer bandplaatsen. Bovendien FLIPS overwint de beperkingen die zijn gekoppeld met behulp van meerdere versterking en sequencing primers, zoals was werkzaam bij vorige full-length sequencing testen-1,4. Door middel van twee rondes van PCR gericht op de regio van de HIV-1 LTR's gecombineerd met NGS, FLIPS vermindert het aantal en de complexiteit van inleidingen vereist. Salto is dus minder gevoelig voor de gevolgen van de primer incongruenties, namelijk de foutieve identificatie van defecte proviruses en een onvermogen om te vergroten wat proviruses binnen een populatie. Het protocol FLIPS is ook efficiënter en zorgt voor een hogere doorvoersnelheid van sequencing dan eerdere methoden.
Blijkbaar, FLIPS biedt voordelen ten opzichte van bestaande methoden die bepalend zijn voor de genetische samenstelling van HIV-1 proviruses. Het is echter belangrijk te erkennen van de beperkingen van FLIPS. Ten eerste, de FLIPS assay is niet ontwikkeld als een instrument voor het meten van de omvang van de latente reservoir voor HIV-1, zoals analyses om te bepalen of FLIPS versterkt elke HIV-1 provirus aanwezig in een celpopulatie nog niet zijn voltooid. Salto is in plaats daarvan handig voor het maken van relatieve vergelijking van de samenstelling van het reservoir tussen verschillende cel populaties2. Ten tweede, de replicatie-bekwaamheid van intact HIV-1 proviruses met zekerheid zonder in vivo analyses, zoals uitgevoerd door Ho et al. kan niet worden bepaald 4. ten derde FLIPS is niet ontworpen voor het bepalen van de plaats van de integratie van HIV-1 proviruses.
Kleine variaties op de FLIPS protocol kunnen het verhogen van de toepassing ervan. Wordt bijvoorbeeld gewijzigd in primer sequenties verschillende kunnen en meerdere HIV-1 subtypes worden versterkt en sequenced. Rangschikken van plasma van HIV-1 virionen is mogelijk door de toevoeging van cDNA synthese vóór genestelde PCR. Toekomstige gebruik van één molecuul sequencing methoden zal elimineren de noodzaak voor DOVO vergadering.
Genetische rangschikken van geïntegreerde HIV-1 proviruses toegenomen ons begrip van de latente HIV-1-reservoir. Salto is een belangrijk instrument voor toekomstige studies ophelderen van de samenstelling en verdeling van het latente reservoir. Echter, de toepassingvan FLIPS kan verder reiken dan het reservoir. Toekomstige studies kunnen gebruik maken van FLIPS te bepalen van specifieke doelen voor CRISPR-Cas technologie, helpen bij de identificatie van de codering en niet-coderende regio's waardoor het virus ontvankelijker voor latency omkering van agenten. Virale recombinatie kan beter worden begrepen door het kijken naar de sites van de kruising van de grote interne verwijderingen.

Genetische karakterisering van het latente reservoir van HIV-1, die personen op lange termijn antiretrovirale therapie (ART) of langer aanhoudt, is essentieel om te begrijpen dat de meerderheid van de geïntegreerde proviruses defect en replicatie-incompetente1 zijn , 2. tijdens het proces van omgekeerde transcriptie, fouten in de geïntegreerde proviraal volgorde worden binnengebracht. Sommige mechanismen die het genereren van defecte proviraal sequenties bevatten de foutgevoelige HIV-1 reverse-transcriptase enzym3, sjabloon schakelen4en/of APOBEC-geïnduceerde hypermutation5,6. Twee recente studies is gebleken dat ongeveer 5% van de HIV-1 proviruses van individuen op lange termijn ART geïsoleerd genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde zijn, en aan de snelle opleving in HIV-1 plasma niveaus bij stopzetting van de kunst bijdragen kan 1 , 2 , 7. vorige studies hebben vastgesteld dat de replicatie-bevoegde HIV-1 proviruses aanhouden in naïef en rusten geheugen CD4+ T cel subsets (met inbegrip van Midden-, overgangs- en effector geheugencellen T) het belang van gericht op deze cellen in de toekomst uitroeiing strategieën,2,,8,9.
Vroege inzichten in de distributie, de dynamiek en het onderhoud van de latente HIV-1 reservoir werden bereikt door het gebruik van de methoden van de één-proviraal sequencing (SPS) die genetisch sub-genomic regio's van de HIV-1 genoom10 karakteriseren ,11,12,13. SPS is een veelzijdig instrument, kundig voor volgorde een één provirus van HIV-1 uit binnen een enkele geïnfecteerde cel. SPS is echter niet in staat om te bepalen van de replicatie-bekwaamheid van proviruses, aangezien het alleen sub-genomic regio's en missers in de proviruses, die grote deleties binnen primer bandplaatsen bevatten sequenties. Een eerdere studie heeft aangetoond dat SPS overschat de grootte van de replicatie-bevoegde reservoir door 13 - tot 17 keer via het selectief sequencing intact sub-genomic regio2.
Inspelen op de beperkingen van SPS, Ho et al. 4 en Bruner et al. 1 ontwikkeld testen in reeks in de buurt van full-length HIV-1 proviruses. Hierdoor konden de frequentie van genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde, HIV-1 proviruses in individuen op lange termijn kunst te bepalen. Deze testen versterkt en sequenced (via Sanger sequencing) sub-genomic regio's die vervolgens werden gemonteerd om te verkrijgen van een opeenvolging van de (intacte of defect) HIV-1 provirus. Drie beperkingen van deze benadering zijn: 1) het gebruik van meerdere sequencing inleidingen verhoogt het risico van onbedoeld invoering van gebreken in de proviraal reeks, 2) primer incongruenties kan versterking van bepaalde proviruses, en 3) vaak de proviraal reeks kan niet worden opgelost als gevolg van de techniciteit van deze methoden.
Om te overwinnen van de beperkingen van bestaande full-length HIV-1 proviraal sequencing testen, ontwikkelden we de Full -Length ikndividual Proviral Sequencing (FLIPS) bepaling. Salto is een next-generation sequencing (NGS)-gebaseerde test die versterkt en in de buurt van full-length (intact of defect) proviruses van HIV-1 sequenties in een high-throughput en efficiënte manier. FLIPS biedt voordelen ten opzichte van eerdere testen, zoals het beperkt het aantal inleidingen gebruikt; Dus, het vermindert de kans voor primer incongruenties, die het aantal proviruses beperken kunnen gevangen of onbedoeld introduceren gebreken in een virale reeks. Salto is ook minder technisch uitdagende dan eerdere tests en omvat 6 belangrijke stappen: 1) lysis van HIV-1 besmette cellen, 2) versterking van één HIV-1 proviruses via genestelde PCR uitgevoerd te beperken met behulp van primers specifiek voor de zeer geconserveerde verdunning HIV-1 5' en 3' U5 LTR regio (figuur 1A), 3) zuivering en kwantificering van versterkte producten, 4) voorbereiding van de bibliotheek van versterkte proviruses voor NGS, 5) NGS, en 6) DOVO vergadering van gesequenceerd proviruses verkrijgen van contigs voor elk individuele provirus.
Reeksen gegenereerd door FLIPS kunnen ondergaan een strenge proces van eliminatie om te identificeren die genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde (Figuur 1 c)2 zijn. Genetisch intact proviruses missen alle bekende gebreken die in het genereren van een replicatie-incompetente provirus resulteren. Deze gebreken omvatten: inversie sequenties, grote interne verwijderingen, hypermutation/schadelijke stop codonen, leesraamverschuiving of mutaties in de 5' verpakking signaal of grote splice donor (MSD) site.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Figuur 1: kritische stappen in de full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) assay. (A) HIV-1 DNA-genoom met primer bandplaatsen regio 5' en 3' U5 LTR gebruikt door FLIPS om te versterken in de buurt van full-length (defect en intact) HIV-1 proviruses via genestelde PCR. (B) lay-out van een 96-Wells PCR plaat met 80 monster wells (20 wells voor elke verdunning), 4 negatieve controleputjes en 1 positieve controle goed. (C) proces van eliminatie gebruikt voor het identificeren van genetisch intact, en potentieel replicatie-bevoegde, HIV-1 proviruses. Dit cijfer is gewijzigd van Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Verdunn tot 5 mM voor geneste PCR</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substitute solution</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96 well thermocycler</td><td></td><td></td><td>Elke 96 well thermocycler kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 en PCR2 Primers</td><td></td><td></td><td>Ontzilt. Verdun tot (100 &micro;M) met H2O</td></tr><tr><td>PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Adhesive Seals</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Vereist om 96 well PCR platen te verzegelen</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td><td>Het volgende reagens werd verkregen via het NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) van Dr. Malcolm Martin (Cat# 114).</td><td></td><td>Verdund tot 105 kopieën/mL en gebruikt als positieve controle</td></tr><tr><td>PCR plate spinner of benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-GEL 48 1% Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Voorgevormd 1% agarose gels (twee gels gebruikt per 96 well plate). Elke 1% agarose gel kan worden vervangen. Bevat ethidiumbromide.</td></tr><tr><td>DirectLoad Wide Range DNA Marker</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>Elke ladder met een bereik tot 10 kb kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Mother E-Base device</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Vereist voor het draaien van voorgevormde 48 well 1% agarose gels</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Elk visualisatiesysteem voor ethidiumbromide bevattende agarose gels kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>Hittesealing film voor langdurige opslag</td></tr><tr><td>96 Well 0.8 mL Storage Plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0.8 mL 96 well plate vereist voor magnetische parel gebaseerde PCR zuivering</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (PCR zuivering kit)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Magnetische parel gebaseerde PCR zuivering kit. Andere PCR zuivering kits kunnen hier worden vervangen (bijv. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, voor moleculaire biologie</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shaker</td><td></td><td></td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Elutie buffer</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Een op fluorescentie gebaseerde kleurstof voor het meten van dsDNA concentratie</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Vereist voor Nextera XT DNA library voorbereiding kit</td></tr><tr><td>Library Quantification Kit - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Andere bibliotheek kwantificering kits kunnen worden vervangen (bijv. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>Geautomatiseerd elektroforese systeem. Gebruik in combinatie met een High Sensitivity DNA kit</td></tr><tr><td>High Sensistivty DNA kit</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq Platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

versterking van in de buurt van full-length hiv-1 proviruses voor next-generation sequencing

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

De Full-Length individuele proviraal Sequencing (FLIPS) bepaling is een efficiënte en hoog-productie methode ter versterken en volgnummer één, in de buurt van full-length (intact en defecte), HIV-1 proviruses. FLIPS kunt bepaling van de genetische samenstelling van geïntegreerde HIV-1 binnen een celpopulatie. Door het identificeren van de gebreken binnen HIV-1 proviraal sequenties die zich tijdens reverse transcriptie, zoals grote interne deleties voordoen, schadelijke stop codonen/hypermutation, frameshift mutaties en mutaties/verwijderingen in DIS handelend elementen vereist voor virion rijping herkent FLIPS geïntegreerde proviruses niet in staat om replicatie. De FLIPS bepaling kan worden gebruikt om het identificeren van HIV-1 proviruses die gebrek aan deze gebreken en dus potentieel replicatie-bevoegd zijn. Het FLIPS protocol omvat: lysis van HIV-1 besmette cellen, genest PCR van in de buurt van full-length HIV-1 proviruses (gebruikend inleidingen gericht tot de HIV-1-5' en 3' LTR), DNA zuivering en kwantificering, bibliotheek voorbereiding voor Next-generation Sequencing (NGS), NGS, DOVO vergadering van proviraal contigs en een eenvoudig proces van eliminatie voordeidentificatie van replicatie-bevoegde proviruses. FLIPS biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden ter volgorde geïntegreerd HIV-1 proviruses, zoals de één-proviraal sequencing. FLIPS versterkt sequenties in de buurt van full-length proviruses inschakelen replicatie competentie worden vastgesteld en gebruikt ook minder versterking primers, voorkomen van de gevolgen van de primer incongruenties. Salto is een nuttig hulpmiddel voor het begrijpen van de genetische landschap van geïntegreerde HIV-1 proviruses, met name binnen het latente reservoir, echter het gebruik kunt uitbreiden voor elke toepassing waarin de genetische samenstelling van geïntegreerde HIV-1 vereist is.

De FLIPS bepaling versterkt en één, in de buurt van full-length proviruses van HIV-1 sequenties. Het protocol bestaat uit 6 stappen te verkrijgen in de buurt van full-length proviraal sequenties. Deze stappen omvatten: lysis van geïnfecteerde cellen, genestelde PCR van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses, DNA zuivering en kwantificering, bibliotheek voorbereiding, NGS, sequencing en DOVO vergadering van sequenced proviruses. Het einde van elke stap kan worden beschouwd als een controlepost waarin de kwaliteit van het product (bijvoorbeeld versterkt DNA, gezuiverde DNA, sequencing bibliotheek of sequentie) voorafgaand aan de volgende stap kan worden beoordeeld. Een overzicht van de beoordeling uitgevoerd aan het einde van elke stap en de verwachte resultaten zoals hieronder is beschreven.
Naar aanleiding van genestelde PCR, versterkte producten worden uitgevoerd op een 1% agarose gel (Figuur 3). De oorspronkelijke kwaliteit van de PCR kan worden bepaald door de inspectie van negatieve en positieve controles. Negatieve-controleputjes met versterkte product geven verontreiniging en positieve controleputjes afwezig van versterkte product geven onvoldoende versterking. Vervolgens zijn putten met versterkte product geselecteerd voor het rangschikken. Voorkom putten met mengsels van meerdere versterkte proviruses, worden alleen putten met versterkte product draaien bij verdunning van het eindpunt beschouwd voor het rangschikken. Volgens de Poisson-verdeling, wordt de end-point verdunning gevonden wanneer 30% van putten positief voor versterkte product zijn. Bij deze verdunning, is er een 80% kans deze putjes bevatten een enkel versterkte provirus. Daarnaast kunnen putten met meerdere versterkte proviruses van verschillende lengtes worden gevisualiseerd in dit stadium, zoals meerdere banden op de gel verschijnen zal. Deze putten moeten niet zijn geselecteerd voor de rangschikking (Figuur 3).
Na zuivering van de versterkte proviruses geselecteerd voor het rangschikken, kwantificering zorgt ervoor dat geen proviraal DNA verloren tijdens de fase van de zuivering. Indien de concentratie van het DNA van een versterkte provirus < 0,2 ng/µL, het resterende monster in de PCR2 plaat kan worden gezuiverd. Een soortgelijke controlepost treedt op na de bereiding van de bibliotheek, waarin elke individuele bibliotheek wordt gekwantificeerd. Dit zorgt voor individuele proviruses zijn op de juiste manier gefragmenteerd, gelabeld en versterkt voorafgaand aan het rangschikken. Individuele proviraal bibliotheken zijn gebundeld in mengsel bedragen tot een concentratie van de definitieve bibliotheek van 4 nM (of zoals aangegeven door de sequencing-provider). Als de concentratie van een individuele proviraal bibliotheek te laag is, het kan worden uitgesloten uit de sequencing bibliotheek groep, of de afzonderlijke bibliotheek opnieuw bereid. Een definitieve controle van de concentratie van de gebundelde bibliotheek wordt uitgevoerd voorafgaand aan het rangschikken samen met de bevestiging van de gemiddelde fragment lengtes.
Kwaliteitscontrole stappen voordat de DOVO vergadering fase zorgt voor de kwaliteit van de leest gebruikt voor het monteren van de laatste proviraal aanliggend. Deze stappen omvatten: verwijdering van adapter sequenties, trimmen van 5' en 3' nucleotiden, een strenge kwaliteitscontrole limiet, en rekening te houden met korte leest. CLC Genomics Workbench kan kwaliteitscontrole rapporten die kunnen worden gebruikt voor de oorspronkelijke kwaliteit van de leest en gids trimmen instellingen, en vervolgens na beoordelen om te bepalen als het wegsnijden volstond om te verwijderen van de regio's van lage kwaliteit bieden. Bovendien, voor DOVO de montage, de kwaliteit van de verzamelde contigs kan worden beoordeeld voor voldoende diepte (> 1000 X) en gelijkmatigheid van de dekking (figuur 4A). Gemengde bevolking kunnen ook in dit stadium worden geïdentificeerd. Mengsels van meerdere full-length (~ 9 kb) proviruses worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van meerdere SNPs met een frequentie van meer dan 40%, overwegende dat mengsels van korte (met een grote interne schrapping) en full-length proviruses kunnen worden geïdentificeerd door ongelijke Lees dekking na toewijzing aan een volledige referentie van eenzelfde deelnemer (figuur 4B).
Afhankelijk van de toepassing, kan de uiteindelijke uitlijning worden gevisualiseerd met behulp van hulpprogramma's zoals ggtree beschikbaar als een pakket in "R: A taal en omgeving voor het berekenen van statistische"27. In een recente studie, FLIPS werd gebruikt om de reeks HIV-1 proviruses uit het naïef, midden-, overgangs-, en effector geheugen CD4+ T cellen geïsoleerd van individuen op lange termijn kunst, met het doel om te identificeren als bepaalde cel subsets hoger toonde verhoudingen van genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde HIV-1-2. Hier wordt de visuele representatie van de sequenties van één deelnemer van deze studie (deelnemer 2026) geïsoleerd (Figuur 5) gepresenteerd. In deze deelnemer, de meerderheid (97%) van de sequenties werden defecte, met intact sequenties gevonden in effector en tijdelijke geheugen CD4+ T cellen. Deze visualisatie tool is handig voor het weergeven van het aantal sequenties met grote interne verwijderingen en hun positie in het genoom. Het kan verder worden geannoteerd om aan te geven van de sequenties met schadelijke stop codonen, frameshift mutaties en verwijderingen/mutaties in de MSD-site en/of de verpakking signaal.
Een toepassing van de bepaling van de FLIPS is de identificatie van genetisch intact en potentieel replicatie-bevoegde HIV-1 proviruses. In een recente studie van 531 sequenties van CD4 geïsoleerd+ T cellen van 6 deelnemers op lange termijn kunst, 26 (5%) genetisch intact HIV-1 proviruses werden geïdentificeerde2. De resterende defecte proviruses opgenomen die met inversie sequenties (6%), grote interne verwijderingen (68%), schadelijke stop codonen/hypermutation (9%), frameshift mutaties (1%) en gebreken in de verpakking signaal en/of de mutaties in de MSD-site (11%) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Figuur 2: Overzicht van workflow voor DOVO montage van HIV-1 proviruses. De grote stappen in de workflow zijn: 1) volgorde lezen kwaliteitscontrole, 2) het samenvoegen van overlappende paren, 3) DOVO vergadering, en 4) remapping en consensusvorming zijn rood, blauw, groen en oranje, respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Figuur 3: voorbeeld agarose gel van PCR versterkt HIV-1 proviruses. Putjes 1, 2, 3, 6, 9 en 10 bevatten versterkte HIV-1 proviruses. Goed 10 bevat een provirus met een grote interne schrapping, goed 2 bevat co versterking van twee HIV-1 proviruses van verschillende lengtes (mengsel) en goed 12 bevat positieve controle. Opmerking het percentage van putten met versterkte product is 60%, hetgeen hoger is dan het percentage moet isoleren van één sjablonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Figuur 4: voorbeeld van de uitvoer van Lees toewijzing. (A) voorbeeld tonen zelfs dekking als gevolg van de versterking van een enkele full-length HIV-1 provirus. Na assemblage van DOVO , worden alle leesbewerkingen toegewezen aan de geassembleerde aanliggend tot een consensus-reeks. Het softwareplatform kan de toegewezen leest te inspecteren voldoende en zelfs dekking. (B) voorbeeld demonstreren co versterking van twee HIV-1 proviruses van verschillende lengtes (mengsel). Om te bepalen van mengsels, zijn leest toegewezen aan een full-length (~ 9 kb) referentie opeenvolging van eenzelfde deelnemer en lees toewijzing geïnspecteerd. De aanwezigheid van ongelijke dekking geeft een mengsel. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Figuur 5: Voorbeeld visualisatie van HIV-1 proviraal sequenties van CD4 geïsoleerd+ T cel subsets van een individu op lange termijn ART. Individuele HIV-1 proviraal sequenties worden vertegenwoordigd door horizontale lijnen. Dit cijfer is gewijzigd van Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van HIV, zoals het bepalen van de genetische samenstelling van HIV-provirussen en verschillende celtypen. Vooral het identificeren van degenen die genetisch intact en potentieel replicatie competent. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het ons in staat stelt om bijna volledige lengte HIV provirussen uit enkele HIV geïnfecteerde cellen te versterken en deze vervolgens te sequencen door de volgende generatie sequencing.Om te beginnen, bereid alle buffers zoals beschreven in het tekstprotocol. Verkrijg een celpellet en voeg honderd microliters lysebuffer per miljoen cellen toe. Meng door pipetting op en neer.Lyse de cellen door uit te broeden in een thermische cycler op 55 graden Celsius gedurende een uur en voeg vervolgens 85 graden Celsius gedurende 15 minuten. Om te beginnen met het versterken van enkele HIV-1 DNA provirussen mengen de reagentia voor de eerste ronde PCR zoals vermeld in tabel een van de tekst protocol. Voeg 38 microliters toe aan 85 putten in een 96 goed PCR plaat en label deze plaat als PCR 1.Verplaats hierna de PCR 1-plaat naar een duidelijk gebied dat is aangewezen voor de toevoeging van genomisch DNA. Met behulp van tris hydrochloride serie verdunnen de genomische DNA van een verhouding van een tot drie tot een verhouding van een tot 81 ervoor te zorgen voor 45 microliters van elke verdunning voor te bereiden. Voeg twee microliters van verdund genomic DNA aan elk monster goed en twee microliters van tris hydrochloride aan elke negatieve controle goed.Verzegel de hele plaat, behalve de positieve controle goed. Ga vervolgens naar een gebied dat is aangewezen voor de toevoeging van de positieve controle. Voeg twee microliter van de positieve controle toe aan de overeenkomstige put en sluit de plaat vervolgens volledig af.Gebruik een PCR-plaatspinner om de PRC 1-plaat kort te draaien en eventuele restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken. Voer de PCR 1-plaat uit in de thermische cyclusr zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng vervolgens de reagentia voor de tweede ronde van PCR zoals vermeld in tabel één.Voeg 28 microliter van deze PCR 2 mix toe aan 85 putten van een nieuwe 96 well PCR plaat. Label deze plaat als PCR 2. Met behulp van een plaatspinner draait u de PCR 1-plaat kort om de restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken.Voeg 80 microliter tris hydrochloride toe aan elke put van deze plaat. Gebruik hierna een mutlikanaalpipet om twee microliter van elke put van de PCR 1-plaat over te zetten naar de overeenkomstige putten in de PCR 2-plaat. Verzegel de PCR 2 plaat met een duidelijke kleefwrap.Draai kort de PCR 2 plaat in de plaatspinner. Verzegel ondertussen de PCR 1-plaat met een warmteafdichtingsfilm voor langdurige opslag bij min 20 graden Celsius. Voer de PCR 2-plaat uit in een thermische cycler zoals beschreven in het tekstprotocol.Draai vervolgens kort de PCR 2-plaat om eventuele restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken. Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 60 microliter tris hydrochloride aan elke put. Vervolgens lopen 15 microliter van elke put op twee 48 goed precast een procent agarose gels die ethidium bromide bevatten.Identificeer de putten die het versterkte product en hun geschatte maten bevatten en sla het gelbeeld op. Bepaal hierna de verdunning waarbij niet meer dan 30 procent van de putten positief is voor versterkt product. Gebruik eerst een plaatspinner om de PCR 2-plaat kort te draaien en eventuele restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken.Breng 40 microliter uit de putten met versterkt product naar de overeenkomstige putten van een nieuwe 96 goed midi plaat. Stel vervolgens een magnetische feed gebaseerde zuivering kit ervoor om de magnetische kralen op kamertemperatuur te brengen en een nieuwe oplossing van 80 procent ethanol voor te bereiden. Zodra de kralen bereiken kamertemperatuur vortex hen om ervoor te zorgen dat ze grondig worden geresuspended.Voeg met behulp van een multi-channel pipet 40 microliter kralen toe aan de 40 microliter van versterkt product in elke put van de midi-plaat. Meng door zachtjes pipetten op en neer 10 keer. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden.Breng de plaat vervolgens over op een magnetische standaard en laat deze twee minuten rusten. Verwijder en gooi hierna de supernatant weg. Met de plaat nog steeds op de stand, was de kralen door het toevoegen van tweehonderd microliter van de 80 procent ethanol oplossing aan elke put.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden en verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal dit wasproces een keer van het toevoegen van de ethanol aan het weggooien van de supernatant. Met behulp van een multi-channel pipet verwijderen van overtollige ethanol.Laat de kralen 15 minuten aan de lucht drogen. Verwijder hierna de plaat van de standaard. Voeg 30 microliter elutie buffer aan elke put en meng door zachtjes pipetteren op en neer 10 keer.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Plaats de plaat terug op de magnetische standaard en laat deze twee minuten rusten. Met behulp van een multi-channel pipet, overdracht 25 microliter van de supernatant naar de overeenkomstige putten van een nieuwe 96 goed PCR plaat.Gebruik vervolgens een spectra fotometer om de geschatte concentratie van elk versterkt DNA-product te bepalen en vast te leggen. Zet een dubbelstrenged DNA kwantificeringskit uit en verdun de buffer tot één keer in steriel AS-vrij water. Voeg 99 microliter van de buffer toe aan een passend aantal lege putten in een platte bodemweefselkweekplaat.Voeg vervolgens honderd microliter buffer toe aan drie lege putten. Voor elk versterkt product te meten voeg een microliter gezuiverd DNA in drievoud aan elke put met buffer. Verdun lambda dubbel gestrand DNA 10 keer van twee nanogram per microliter tot nul nul nanogram per microliter om de normen voor te bereiden.Voeg honderd microliter van elke dubbelstrengs DNA-standaard toe aan drie putten. Verdun de florescentiekleurstof één tot tweehonderd met buffer. Voeg snel honderd microliters toe aan elke put die een monster, blanco of standaard bevat en meng door op en neer te pipetten.Bedek hierna de plaat met folie om contact met licht te voorkomen. Met behulp van een microplate lezer, record de florescence emissie. Gebruik de geregistreerde metingen om de concentratie van dubbelstrengs DNA in elk monster te bepalen.Verdun vervolgens elk gezuiverd product met water tot een concentratie van nulpunt twee nanogram per microliter. Na geneste PCR, de versterkte producten worden uitgevoerd op een een procent agarose gel. De initiële kwaliteit van de PCR kan worden bepaald door de besturingselementen te inspecteren.Omdat negatieve controles die versterkt product bevatten, duiden op verontreiniging en de positieve controles zonder versterkt product duiden op onvoldoende versterking. Alleen putten draaien op het eindpunt verdunning die enkele versterkte provirussen bevatten worden overwogen voor sequencing. Terwijl putten met meerdere versterkte provirussen van verschillende lengtes in dit stadium kunnen worden gevisualiseerd, moeten ze niet worden geselecteerd voor sequencing.Voor de de novo-assemblage kan de kwaliteit van de geassembleerde aaneengesloten worden beoordeeld op voldoende diepte en gelijkmatigheid van de dekking. Gemengde populaties kunnen in dit stadium ook worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van ongelijke dekking. Visuele weergave van de sequenties geïsoleerd van een deelnemer blijkt dat 97 procent van hun sequenties defect zijn.Met intacte sequenties gevonden in effector en overgangsgeheugen CD4 positieve T-cellen. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen versterkte producten verkregen bij de beperkende verdunning, dat is waar niet meer dan 30 procent van de putten positief zijn, bevatten een enkel provirus. Na deze procedure kunnen versterkte producten worden gesequenced om de genetische samenstelling van HIV-provirussen te bepalen.Na de ontwikkeling ervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van HIV om de verspreiding van genetisch intacte HIV-provirussen en verschillende celtypen bij patiënten op therapie te onderzoeken om te bepalen waar genetisch intacte en potentieel replicatie competente provirussen zich verbergen. Vergeet niet dat het werken met hiv-geïnfecteerde cellen gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van passende persoonlijke beschermingsmiddelen en het werken aan een gecertificeerd laboratorium moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

amplification-near-full-length-hiv-1-proviruses-for-next-generation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

We valideerden eerder een protocol voor op amplicon gebaseerde whole genome Usutu virus (USUV) sequencing op een nanopore sequencing platform. Hier beschrijven we de methoden die in meer detail worden gebruikt en bepalen we het foutenpercentage van de nanopore R10-stroomcel.

Validering van Whole Genome Nanopore Sequencing, met behulp van Usutu Virus als voorbeeld

Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.

Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Leer de FLIPS-methode voor het versterken en sequencen van volledige HIV-1 provirussen uit enkele geïnfecteerde cellen. Deze techniek helpt onderzoekers de latent reservoir te begrijpen en replicatiecompetente virussen te identificeren.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Meer video's verkennen