Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese
26 juli 2018
Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen zoals hoeveel ribonucleotiden worden opgenomen in nascend, leading en lagging strand DNA in het genoom. Hoewel deze methode kwantitatieve en kwalitatieve informatie kan geven over de dichtheid van ribonucleotiden in het gistgenoom, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals zoogdiergenoom. De alkalische gelelektroforese biedt een semi-kwantitatieve weergave van ribonucleotide-incorporatie in het hele genoom en strengspecifiek zuiderblotting geeft een grotere gevoeligheid en kwantificering op een specifiek genomisch locus.
Om met deze procedure te beginnen, voegt u zes microliters van één molair kaliumhydroxide toe aan elk monster van vers bereid gistgenomisch DNA en incubeert u gedurende twee uur bij 55 graden Celsius. Na twee uur incubeert u de monsters gedurende vijf minuten op ijs. Voeg vervolgens aan elk monster vier microliters van 6-6 alkalische DNA-loading buffer toe.
Maak een alkalische gel met één procent agarose, 50 millimolair natriumhydroxide en één millimolair EDTA pH acht met een kam die toestaat om 24 microliters DNA-monster per baan te laden. Laat de buisjes met monsters even centrifugeren. Laad de volledige 24 microliters van elk monster in de alkalische agarose gel.
Neem een geschikte DNA-maatstaf op. Elektroforeer gedurende 30 minuten bij 30 volt. Verlaag vervolgens het voltage naar 10 volt en elektroforeer gedurende 18 tot 20 uur.
De volgende dag neutraliseert u de gel. Dompel de gel in neutralisatiebuffer één en incubeer bij kamertemperatuur met zachte agitering gedurende 45 minuten. Vervang de neutralisatiebuffer door verse buffer.
En incubeer nogmaals gedurende 45 minuten. Om het DNA te kleuren, weekt u de geneutraliseerde gel in 200 milliliter water dat een verdunning van een op 10000 van sybr goudkleuring bevat bij kamertemperatuur met zachte schommeling gedurende twee uur. Visualiseer het DNA met behulp van een UV-transilluminator.
Het DNA van de alkalische gel wordt overgebracht naar een positief geladen nylonmembraan door capillaire actie. Week eerst de alkalische gel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in alkalische overdrachtsbuffer. Bevochtig vervolgens het nylonmembraan kort met water en week het gedurende vijf minuten in alkalische overdrachtsbuffer.
Stel het overdrachtsplatform in door drie glazen bekers van 100 milliliter te keren in een glazen bakschotel die iets groter is dan de grootte van de agarose gel. Plaats een glazen plaat bovenop de glazen bekers. Leg twee grote stukken 3 MMCHR-chromatografiepapier over de glazen plaat.
Plaats de agarose gel op de bovenkant. Weer glad de bubbels. Omring alle randen van de gel met parafilm. Giet een kleine hoeveelheid alkalische overdrachtsbuffer over het chromatografiepapier en vul de glazen bak half. Maak de bubbels glad met behulp van een glazen pipet van vijf milliliter. Plaats de agarose gel erop.
Weer glad de bubbels. Leg het nylonmembraan dat al is geweekt op de bovenkant van de gel en maak de bubbels glad. Leg twee stukken chromatografiepapier op de grootte van de agarose gel. Plaats ze bovenop het membraan en maak eventuele bubbels glad.
Plaats een grote stapel papieren handdoeken op de bovenkant van het overdrachtssandwich en plaats voorzichtig een glazen plaat bovenop de papieren handdoeken. Voeg een zwaar object toe aan de bovenkant en laat de overdracht bij kamertemperatuur een nacht doorgaan. De volgende dag haalt u de overdrachtstapel voorzichtig uit elkaar.
Week het membraan gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in neutralisatiebuffer twee. Kruislink het DNA naar het geladen nylonmembraan met behulp van een UV-kruislinker. Gebruik de automatische kruislinkinstelling.
Voordat u begint met de hybridisatieprocedure, bereidt u de radioactief gelabelde sonde voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Rol het bevochtigde membraan in een hybridisatiebuis en voeg 25 milliliter vers bereide hybridisatiebuffer toe. Incubeer bij 65 graden Celsius met rotatie in een hybridisatieoven gedurende één tot twee uur.
Giet voorzichtig de oplossing af en voeg 25 milliliter hybridisatiebuffer plus de sonde toe. Incubeer bij 65 graden Celsius gedurende 16 tot 18 uur met rotatie. Giet vervolgens de oplossing in een radioactief afvalcontainer.
Voeg fosfaat STS-wasoplossing één toe aan de hybridisatiebuis en roteer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voer op deze manier vijf wasbeurten van vijf minuten uit met fosfaat STS-wasoplossing één. Na de vijfde was met fosfaat STS-wasoplossing één, was het membraan twee keer met fosfaat STS-wasoplossing twee voor elke keer 15 minuten bij 65 graden Celsius met rotatie.
Gebruik een pincet om het membraan uit de hybridisatiebuis te verwijderen en plaats het membraan in een geopende plastic beschermhoes. Dek af en stel bloot aan een beeldplaat. Indien nodig, verwijder en herprobeer de blot met een andere sonde.
Om te verwijderen, bedek het membraan met 25 milliliter van een 50 procent formamid 2XSSPE-oplossing en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende twee uur. Giet de oplossing in een radioactief afvalcontainer. Voeg fosfaat STS-wasoplossing twee toe aan de hybridisatiebuis en roteer bij 65 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Controleer het membraan met een geigerteller om de afwezigheid van signaal te bevestigen voordat u de prehybridisatie en hybridisatie uitvoert zoals eerder is aangetoond. Deze gelbeelden hebben gistgenomisch DNA dat wel of niet is behandeld met kaliumhydroxide en laten zien dat de cellen die RNH2 missen, meer ribonucleotiden in het genoom behouden. De M644L-variant van polymerase twee vermindert het vermogen om ribonucleotiden op te nemen, terwijl de M644G-mutant meer ribonucleotiden opneemt dan de wilde polymerase.
Een alkalische agarose gel kan verder worden onderzocht door strengspecifieke zuiderblotanalyse. In dit voorbeeld hechten de sondes zich aan de nascend leading DNA-streng binnen het URA3-reportergen dat is geïnsert in de buurt van ARS306 in twee tegengestelde oriëntaties. Represent
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert experimentele benaderingen om de incorporatie van ribonucleotiden in DNA tijdens eukaryote nucleaire DNA-replicatie te beoordelen. Het belicht de potentiële mutagene effecten van ribonucleotiden indien deze niet correct worden verwijderd.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- DNA-replicatie
- Genomische stabiliteit
- Mutagenese
Achtergrond
- Ribonucleotiden zijn niet-canonieke nucleotiden die in DNA voorkomen.
- Indien ze niet worden verwijderd, kunnen ze leiden tot DNA-schade.
- Inzicht in hun incorporatie is essentieel voor de genomische integriteit.
- Er zijn methoden nodig om de incorporatie van ribonucleotiden te kwantificeren.
Doel van de studie
- Om de ribonucleotide-incorporatie in DNA te kwantificeren.
- Om de mutagene effecten van ribonucleotiden te beoordelen.
- Om methoden te ontwikkelen die toepasbaar zijn op diverse genomische systemen.
Gebruikte methoden
- Alkalische gelelektroforese voor semi-kwantitatieve analyse.
- Strengspecifieke Southern blotting voor gevoelige kwantificering.
- Gebruik van kaliumhydroxidebehandeling voor DNA-monsters.
- Incubatie bij gecontroleerde temperaturen voor optimale resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatieve gegevens over de incorporatie van ribonucleotiden in gist-DNA.
- Vergelijking van de incorporatie in leidende en slepende strengen.
- Inzichten in het mutagene potentieel van ribonucleotiden.
- Toepasbaarheid van methoden op zoogdiergenomen.
Conclusies
- Ribonucleotiden vormen een risico voor de genomische stabiliteit.
- De ontwikkelde methoden zijn effectief voor het kwantificeren van inbouw.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrip van mechanismen van DNA-schade.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
De incorporatie van ribonucleotiden in genomisch DNA vormt een bron van instabiliteit die de validatie van targets en de identificatie van leads bij geneesmiddelenontwikkeling kan belemmeren. Het kwantificeren van deze incorporatie maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door bronnen van spontane mutagenese te verduidelijken die fenotype-genotype-relaties in preklinische modellen kunnen vertroebelen. Deze mogelijkheid ondersteunt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door echte therapeutische signalen te onderscheiden van artefacten van DNA-schade.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt of waargenomen fenotypen voortkomen uit de beoogde modulatie van het doelwit of uit ribonucleotide-geïnduceerde DNA-schade.
- Operationele waarde: Biedt strengspecifieke kwantificering om hypothesen over genfunctie in gistgebaseerde screeningssystemen te valideren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de preparatie van isogene giststammen met gedefinieerde ribonucleotidegehaltes mogelijk voor consistente assay-achtergronden.
- Operationele waarde: Standaardiseert de kwaliteitscontrole van genomisch DNA om variabiliteit in fluctuatie-assays en reportergen-validatie te verminderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Meet de door ribonucleotiden geïnduceerde mutagenesitesnelheden om de genetische stabiliteit van ziekterelevante systemen over een langere kweekperiode te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale monitoring van genomische integriteit in preklinische modellen die worden gebruikt voor lead-optimalisatie.
Integratie van pipeline & workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarbij targetvalidatie een schone genetische achtergrond vereist, in het bijzonder bij het gebruik van gistmodellen voor pathway-interrogatie of fenotypische screening.
- Discovery Biology: Verduidelijkt of de incorporatie van ribonucleotiden bijdraagt aan achtergrondmutagenese in fluctuatie-assays die worden gebruikt voor target-validatie.
- Screening: Waarborgt de consistentie van reagentia door DNA-monsters te kwalificeren die worden gebruikt in Southern blot-gebaseerde validatie van genetische constructen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve strengspecifieke gegevens die vergelijking van polymerase-varianten of genetische achtergronden mogelijk maken in lead-identificatiecampagnes.
- Translational Research: Volgt metrieken voor genomische stabiliteit die risico-gecorrigeerde vooruitgang vanuit hit-to-lead-stadia informeren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar QC-controlepunt voor de integriteit van genomisch DNA over meerdere gist-gebaseerde discovery-platforms.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door een bekende bron van spontane mutagenese in genetische screens te kwantificeren.
- Operationele waarde: Introduceert standaardisatie voor de preparatie van DNA-monsters, wat de reproduceerbaarheid van fluctuatie-assays en Southern blotting verbetert.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door te controleren voor storende factoren (confounders) in de vorm van DNA-schade in target-validatiedata.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door modellen met verhoogde ribonucleotideniveaus te markeren die mogelijk mitigatiestrategieën vereisen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in de omgang met nucleïnezuren, technieken met radioactieve probes en Southern blot-hybridisatie.
- Apparatuur voor alkalische gelelektroforese, UV-crosslinker en phosphorimager voor signaaldetectie.
- Gestandaardiseerde protocollen voor behandeling met kaliumhydroxide, neutralisatie en membraantransfer om consistentie tussen laboratoria te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het optimaliseren van het probe-ontwerp voor verschillende genomische loci en het aanpassen van de hydrolysetijden voor variërende kwaliteiten van DNA-monsters.
- Praktische beperkingen omvatten het semi-kwantitatieve karakter van alkalische gels zonder Southern blotting en de risico's verbonden aan radioactieve materialen, waarvoor gespecialiseerde afvalverwerking is vereist.
