Het gebruik van de muis Splenocytes om te beoordelen van de pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon invloed op klok genexpressie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie en chronobiologie, zoals hoe microbiële componenten de moleculaire klok veranderen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig uit te voeren is, de effecten van verschillende microbiële componenten op de moleculaire klok worden beoordeeld en het zeer reproduceerbaar is. Om het protocol te beginnen, bereid het kweekmedium voor door foetaal bovien serum toe te voegen aan RPMI 1640 tot een eindconcentratie van 10%. Bereid 10 milliliter uitdagingsmedium voor voor elk van de PAMPS die getest moeten worden in 50 milliliter buizen door het vermelde PAMP kweekmedium toe te voegen.

Spuit een eerder voorbereide muizenrug in met 70%ethanol en veeg deze af met een papieren handdoek. Plaats de muis op zijn rug, lichtjes gekanteld naar zijn rechterzij. Snijd vervolgens het haar weg met dissectiescharen langs de linkerkant van de muis, ongeveer halverwege tussen de voor- en achterpoten.

Pak met een pincet het peritoneum en maak voorzichtig een snee zonder de milt te beschadigen. Verwijder de milt met een pincet en plaats deze in een steriele 50 milliliter buis met ongeveer 10 milliliter kweekmedium op ijs. Breng vervolgens de milt over met twee milliliter kweekmedium naar een kleine, steriele petrischaal.

Homogeniseer de milt door deze te malen tussen het bevroren gedeelte van twee steriele bevroren slides. Zodra het goed gehomogeniseerd is, pipet de twee milliliter kweekmedium met de splenocyten door een 40 micron nylon celzevener in een 50 milliliter buis. Voeg acht milliliter koud kweekmedium toe aan elk van de 50 milliliter buizen met de splenocyten, voor een totaal volume van 10 milliliter per buis.

Bepaal het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer. Voeg ongeveer een keer 10 tot de zesde cellen per put toe aan zes-puts kweekplaten. Voeg na het toevoegen van de cellen drie milliliter kweekmedium of drie milliliter uitdagingsmedium toe aan de cellen.

Incubeer vervolgens de platen gedurende drie uur bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Schraap de cellen van de bodem van de put af met een 1.000 microliter pipettentip verbonden aan een P1000 micropipet. Breng met dezelfde pipettentip het medium met de cellen over naar een 15 milliliter buis.

Pellet de cellen bij 167 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was het celpellet met vijf milliliter PBS. Na het opnieuw pelleten van de cellen bij 167 keer g gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant en voeg 600 microliter lysis buffer toe aan het celpellet.

Isoleer RNA van splenocyten met behulp van de RNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant en voer de optionele on-column DNA-digestie uit. Synthetiseerd cDNA voor elk van de monsters met behulp van de reverse transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 10 microliter RNA voor elk van de monsters in een totale reactievolume van 20 microliter.

Trek mRNA uit een paar controlemonsters in een 0,5 milliliter buis om het cDNA voor te bereiden dat gebruikt zal worden voor de standaardcurve bij het uitvoeren van kwantitatieve PCR. Voeg 10 microliter 2X reverse transcriptase mastermix toe. Voeg bij het einde van de reverse transcriptie 10 microliter water toe aan de reactiebuis, die dient als de startconcentratie in de verdunningsreeks voor de standaardcurve.

Voer een tienvoudige verdunningsreeks uit door 45 microliter water toe te voegen aan vier 0,5 milliliter buizen gemarkeerd met 10 tot de min één, 10 tot de min twee, 10 tot de min drie en 10 tot de min vier. Voeg vijf microliter van de startconcentratie één toe aan de tweede buis, 10 tot de min één, met behulp van een P20 micropipet. Meng door meerdere keren op en neer te pipetten en breng vervolgens vijf microliter van de 10 tot de min één buis over naar de buis gemarkeerd met 10 tot de min twee en meng.

Breng vijf microliter over met behulp van een P20 micropipet van de 10 tot de min twee buis naar de buis gemarkeerd met 10 tot de min drie en meng. Breng tenslotte vijf microliter over met behulp van een P20 micropipet van de 10 tot de min drie buis naar de buis gemarkeerd met 10 tot de min vier en meng. Bereid de reactie voor zodat deze 0,5 microliter van de primer sonde assay, vijf microliter genexpressie mastermix, twee microliter water en 2,5 microliter cDNA bevat.

Pipet de RNA-monsters in een 96-well qPCR-plaat. Incubeer primer sonde assays voor verschillende moleculaire klokgenen en voeg een assay toe voor een endogene controle, en laad deze in een qPCR-machine om de relatieve kwantificering van mRNA-niveaus te bepalen. Selecteer binnen de experimentele opstelling kwantificering, relatieve standaardcurve en TaqMan-chemie.

Verander vervolgens het reactievolume naar 10 microliter. Voer de relevante informatie in in het plaatlay-out. qPCR werd uitgevoerd op geïsoleerd RNA om de relatieve expressieniveaus van de moleculaire klokgenen, klok, Per2, Dbp en Rev-erb alpha te beoordelen.

Na PAMP-uitdaging waren de expressieniveaus van de klok niet significant anders vergeleken met controlecellen. Per2-expressieniveaus waren significant verhoogd in cellen uitgedaagd met LPS en ODN1826 vergeleken met niet uitgedaagde controles. LPS was de enige PAMP die Rev-erb alpha-expressie veranderde, aangezien de mRNA-niveaus significant lager waren dan in de niet uitgedaagde controles.

Er werden significant lagere mRNA-niveaus waargenomen voor Dbp na uitdaging met elk van de PAMP's vergeleken met de controles. Volgens deze procedure kunnen moleculen die geen PAMP's zijn, worden gebruikt om hun invloed op de moleculaire klok in splenocyten te beoordelen.