High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biomedische wetenschap. Zoals het gebruik van zebravissen om genetische modellen van ziekten te genereren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een vroege identificatie van genotypen mogelijk maakt met behulp van een eenvoudige methode met hoge doorvoer.

Hoewel deze methode uitgebreid onderzoek mogelijk maakt met behulp van zebravismodellen van genetische epilepsie, kan het ook worden toegepast op andere genetische ziektemodellen en elk type mutatiestudie. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de doorknippen van de larfvin precies moet worden uitgevoerd binnen de pigmentopening van de staart. Voordat u begint met het knippen van de vin van de zebravislarven, bereidt u het dissectieoppervlak voor.

Plak een stuk autoclaaftape over de binnenkant van het deksel van een negen centimeter Petrischaal en plaats het deksel onder een stereomicroscoop. Bereid een P1000 pipettepunt voor om een drie dpf larve met minimale stress te plaatsen, door het uiteinde van de pipettepunt af te snijden tot een diameter van twee millimeter. Plaats drie tot vijf dagen na bevruchting, of dpf, zebravislarven in een petrischaal en verdoof in 1,5 millimolair tricaine in 1x E3 embryomedium.

Gebruik de aangepaste P1000 micropipet om een verdoofde zebravislarve op te halen en plaats deze op het gepositioneerde autoclaaftape op het petrischaaldeksel. Verwijder overtollig tricaine-oplossing rond de larve. Het gebied moet zo droog mogelijk zijn om de vin te kunnen snijden en op te pakken, maar nog steeds nat om het overleven te garanderen.

Om bloeding te voorkomen en het overleven van de larve tijdens het knippen van de vin te waarborgen, moet de doorsnede binnen de pigmentopening plaatsvinden. Distal van de grens van de bloedcirculatie, zoals aangegeven in deze afbeelding. Gebruik onder een stereomicroscoop een microscalpel om de staartvin door te snijden.

Tijdens de incisie moet een gelijkmatige maar zachte neerwaartse druk worden uitgeoefend om schade aan de chorda dorsalis te voorkomen. Beeld de doorgesneden vin af onder de microscoop en plaats het stuk op de punt van de microscalpelblad. Plaats de microscalpel met de vin erop op het oppervlak van een klein stukje filterpapier.

Door de aanwezigheid van melanocyten in het doorgesneden weefsel, ziet de vin eruit als een kleine zwarte stip. Om een succesvolle DNA-extractie te garanderen, is het belangrijk dat een zwarte stip die de plaatsing van de vin markeert, op het filterpapier wordt waargenomen voordat u doorgaat met het protocol. Gebruik schaar en pincetten om het filterpapier met de vin over te brengen naar een putje van een 96-well PCR-plaat die 25 microliter van een 50 millimolair natriumhydroxide-oplossing bevat.

Bereid vervolgens een platte bodem 96-well weefselkweekplaat voor en nummer de putjes volgens het label van de PCR-plaat. Gebruik de aangepaste P1000 pipet, gevuld met 200 microliter vers e3 embryomedium, en verzamel voorzichtig de zebravislarve met zachte druk. Plaats de larve in de 96-well plaat in hetzelfde putjenummer als de PCR-plaat.

Zorg ervoor dat het filterpapier met de vin goed ondergedompeld is in de oplossing. Om kruisbesmetting tussen elke snede te voorkomen, reinig het mes van de microscalpel en de pincetten door ze in een 70% ethanol-oplossing te dompelen. Veeg het mes schoon met een papieren tissue of doek.

Wanneer alle larven zijn geknipt, bewaar de larven in de 96-well plaat bij 28 graden Celsius totdat hun genotypen zijn geïdentificeerd. Begin deze procedure door de 96-well PCR-plaat met de vinstukken te verzegelen en de monsters gedurende één minuut te centrifugeren bij 1000 keer G. Om ervoor te zorgen dat alle filterpapieren ondergedompeld zijn in de natriumhydroxide-oplossing.

Voor weefsellyse, verwarm de monsters in een thermische cyclus op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gevolgd door afkoeling tot vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens zes microliters van 500 millimolair tris-HCL pH8.0 toe aan elk monster.

Vortex de monsters. Centrifugeer de plaat kortstondig bij 1500 keer G gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Om genomisch DNA te extraheren met behulp van deze methode, knip de vin zoals eerder gedemonstreerd, maar voeg het filterpapier met de geknipte vin toe aan een putje van een 96-well PCR-plaat die 30 microliter van 5% chelerende hars bevat.

Nadat alle vinstukken zijn geknipt, verzegel de 96-well PCR-plaat en centrifugeer de monsters kortstondig om er zeker van te zijn dat alle filterpapieren ondergedompeld zijn in de chelerende hars. Verwarm de monsters in een thermische cyclus op 95 graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door afkoeling tot vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters kortstondig om de harskralen te pelleten en het DNA in de suspensie te verkrijgen.

Een multiplex PCR-assay zal de discriminatie tussen homozygote mutanten, heterozygoten en wilde type larven mogelijk maken. Stel de PCR-reactie in zoals beschreven in het protocol. Voer de PCR-reacties uit in een 96-well thermische cyclus.

Bereid een 1% agarosegel in natriumboraatbuffer, gekleurd met 1x gelrood. Om het proces te vergemakkelijken, gebruik indien mogelijk een gelsysteem dat compatibel is met meerkanaals pipetten om hogere doorvoercapaciteit mogelijk te maken door de tijd om monsters te laden te verminderen. Laat de gel draaien in 1x natriumboraatbuffer bij 250 volt gedurende 15 minuten.

Beeld de gel af onder ultraviolet licht om de verschillende genotypen te kunnen onderscheiden. Begin deze test door twee 12% polyacrylamide gels voor te bereiden met behulp van de 1,5 millimeter spacer plate en de 15 monsters combs zoals beschreven in het protocol. Gebruik een verticaal elektroforese systeem en 1x TBE buffer als loopbuffer.

Na het uitvoeren van PCR zoals beschreven in het protocol, verwarm de PCR-producten gedurende vijf minuten op 94 graden Celsius, ge