Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis
September 5th, 2018
Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van neurowetenschappen, zoals de analyse van de structuur en functie van de neocortex. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de grootschalige driedimensionale structuur in de hersenen kan onthullen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de neocortex, kan het ook worden toegepast op andere zenuwstelsels, zoals het ruggenmerg.
Om de tracer in de pons van volwassen muizen te injecteren, trekt u eerst één microliter van de fluorescent gelabelde Cholera toxine subeenheid B in een Hamilton-sering met een dikte van 26 gauge. Plaats een injectorpomp op de spuit en plaats vervolgens de spuit en de pomp op de gereedschapshouders van een manipulator op een stereotactisch instrument. Kantel de manipulator 12 graden naar achteren vanaf de verticale as.
Plaats vervolgens de muis op het stereotactisch instrument. Gebruik een scheermesje om het haar te verwijderen om infectie te voorkomen. Snijd vervolgens 10 millimeter van de hoofdhuid zodat de bregma en lambda zichtbaar zijn.
Breng 0,1 milliliter 1% lidocaine aan met behulp van een pipette. Stel de hoek van het hoofd in door de verticale positie van de mondstuk op het stereotactisch instrument aan te passen, zodat de bregma en lambda dezelfde Z-niveau hebben. Pas vervolgens de positie van de manipulator aan door deze op het stereotactisch instrument te schuiven, zodat de punt van de spuit dicht bij de bregma is.
Noteer de positie van de manipulator. Trek de spuit terug door de gereedschapshouders op de manipulator te verplaatsen. Vervolgens beweeg de manipulator 5,4 millimeter naar achteren en 0,4 millimeter naar de zijkant.
Schuif de spuit naar voren zodat de punt dicht bij het toegangspunt op de schedel komt, trek vervolgens de spuit terug en markeer het toegangspunt. Op de gemarkeerde positie, boor een gat met een diameter van ongeveer één millimeter. Steek de punt van de spuit door het gat, zodat de spuittand 6,9 millimeter dieper is dan die gemeten bij de bregma.
Injecteer vervolgens één microliter tracers met behulp van de pomp bij 0,2 microliter per minuut. Verwijder na de injectie de spuit uit de hersenen. Indien nodig, bedek het blootgestelde brein met kleine fragmenten microfibrillaire hemostaat en instant lijm.
Veeg het blootgestelde brein af met zoutoplossing om infectie te voorkomen en naai het hoofdhuid. Verwijder vervolgens de muis uit het stereotactisch instrument. Laat de muis ongeveer een uur herstellen van de anesthesie in een incubator bij 30 graden Celsius.
Laat de muis niet onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn heeft herkregen om de borst te kunnen blijven liggen. Breng de muis terug naar de andere dieren nadat het volledig is hersteld. Om het hersenweefsel te verzamelen, snijd het hoofdhuid met een schaar om de schedel bloot te leggen.
Snijd vervolgens de middellijn van de blootgestelde schedel met een schaar. Verwijder vervolgens de schedel met behulp van een pincet. Als het markeren van de positie van de bregma en lambda noodzakelijk is, verwijder eerst een zijde van de schedel.
Steek vervolgens dunne tungsteennaalden in de hersenen op de posities van de bregma en lambda en verwijder vervolgens de rest van de schedel. Plaats vervolgens het hersenmonster op het vibratome platform. Snijd de secties tot 500 micrometer dik in PBS bij kamertemperatuur.
Overbreng in deze procedure de plakjes naar een plastic buis van vijf milliliter met vier milliliter van de Scale S0-oplossing. Incubeer ze vervolgens gedurende 12 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 12 uur de oplossing uit de buis met behulp van een pipette en voeg vier milliliter van de Scale A2-oplossing toe.
Incubeer de plakjes gedurende 36 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 36 uur de oplossing uit de buis en voeg vier milliliter van de Scale B4-oplossing toe. Incubeer de plakjes gedurende 24 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius.
Verwijder na 24 uur de oplossing uit de buis en voeg vier milliliter van de Scale A2-oplossing toe. Incubeer de plakjes gedurende 12 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 12 uur de oplossing uit de buis en voeg vier milliliter van PBS toe.
Incubeer de plakjes gedurende zes uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de plakjes voorzichtig in een plastic buis van twee milliliter. Incubeer ze met een primaire antilichaam in één milliliter van de AB Scale-oplossing gedurende 48 tot 72 uur bij 37 graden Celsius met zacht schudden.
Verwijder vervolgens de plakjes voorzichtig in een plastic buis van vijf milliliter. Incubeer ze in vier milliliter van de AB Scale-oplossing gedurende twee uur twee keer bij kamertemperatuur met zacht schudden. Verwijder vervolgens de plakjes voorzichtig in een plastic buis van twee milliliter.
Incubeer met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam in één milliliter van de AB Scale-oplossing gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius met zacht schudden. Verwijder voorzichtig de plakjes in een plastic buis van vijf milliliter met vier milliliter van de antilichaam Scale-oplossing en incubeer de plakjes gedurende zes uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en voeg vier milliliter van de AB Scale-oplossing toe en incubeer de plakjes gedurende twee uur twee keer met zacht schudden bij kamertemperatuur.
Verwijder vervolgens de oplossing en voeg vier milliliter van 4%PFA toe en incubeer de plakjes gedurende één uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de oplossing en voeg vier milliliter van PBS toe en incubeer de plakjes gedurende één uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en voeg vier milliliter van de Scale S4-oplossing toe en incubeer de plakjes gedurende 12 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius.
Plaats vervolgens de afstandhouder op een glasplaat en plaats de plakjes in de afstandhouder en dompel de plakjes in de Scale S4-
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie schetst een gedetailleerd protocol voor weefselklaring, fluorescente labelen en grootschalige beeldvorming van muizenhersenweefsel. De methodologie stelt onderzoekers in staat om de driedimensionale organisatie van celtypen in de neocortex te visualiseren, wat waardevolle inzichten biedt in zijn structuur en functie.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Weefselbeeldvorming
- Fluorescente labelen
Achtergrond
- De structuur en functie van de neocortex zijn fundamenteel in de neurowetenschappen.
- Inzicht in celorganisatie kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke onderzoeksvragen.
- Deze techniek kan worden uitgebreid naar andere delen van het zenuwstelsel, zoals het ruggenmerg.
Doel van de studie
- Om een methodologie te ontwikkelen voor verbeterde visualisatie van hersenstructuren.
- Om de organisatie van celtypen binnen de neocortex te onderzoeken.
- Om een raamwerk te bieden dat toepasbaar is op bredere onderzoeken naar het zenuwstelsel.
Gebruikte methoden
- Grootschalige beeldvorming met behulp van confocale of twee-foton microscopie.
- Het model omvat volwassen muizen en specifieke hersengebieden zoals de pons.
- Het protocol beschrijft procedurele stappen voor tracerinjectie en weefselvoorbereiding.
- Incubatie in oplossingen zoals Scale S0, A2, B4, en het gebruik van fluorescente antilichamen waren cruciale stappen.
Belangrijkste resultaten
- De methode onthult grootschalige driedimensionale structuren in muizenhersenweefsel.
- Specifieke labelen van corticale projectieneuronen en andere celtypen werd bereikt.
Conclusies
- Deze studie toont een robuuste methode aan voor het visualiseren van neuronale organisatie.
- De bevindingen dragen significant bij aan het begrijpen van de neocorticale structuur en zijn functie.
- De methodologie kan worden aangepast voor diverse toepassingen in neurowetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
