Name: Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Leer grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de neocortex van muizen. Deze methode onthult neuronale structuren en kan worden toegepast op andere delen van het zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Atsushi Miyawaki en Hiroshi Hama voor hun advies over de AbScale experimenten, Charles Yokoyama voor het bewerken van het manuscript, Eriko Ohshima en Miyuki Kishino voor hun technische bijstand. Dit werk werd gesteund door onderzoeksgelden van RIKEN T.H. en Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan naar T.H. (innovatieve gebieden "Mesoscopische Neurocircuitry"; 22115004) en ZB (25890023).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de RIKEN Wako dier experimenten Commissie en RIKEN genetische Recombinant Experiment veiligheidscommissie en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de dierlijke faciliteiten van het hersenonderzoek RIKEN van institutionele Instituut.
1. bereiding van Imaging Chambers
<ol><li>
Imaging kamer19
	<ol>
<li>Met behulp van silicone rubber sheets, bereiden een kamer met een dikte van ongeveer 5 mm en vloer platen van verschillende diktes. Ook bereiden petrischalen met en zonder een glazen bodem (figuur 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Segment spacer
	<ol>
<li>Bereiden spacers om te houden van de monsters, silicone rubber platen met een dikte van 0.5 mm (Figuur 1 c).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tracer injectie
Opmerking: Zorg injecties in de pons (2.1) of superieure colliculus (2.2). Injectie in de pons label Sub cerebrale projectie neuronen in een regio van de grote hersenen met inbegrip van de visuele en motorische gebieden, terwijl injectie in de superieure colliculus etiketten sub cerebrale projectie neuronen in de visuele ruimte. Voor controle experimenten, injecteren zoutoplossing in plaats van fluorescently-geëtiketteerden cholera-toxine subeenheid B. Gebruik voor het handhaven van de steriele toestand gesteriliseerde apparatuur en plastic handschoenen gereinigd met ethanol.
<ol><li>
Injecties in de pons van volwassen muizen maken
	<ol>
<li>Tekenen van 1 µL van fluorescently-geëtiketteerden cholera-toxine subunit B (25 µg/µL in PBS) in een 26 G Hamilton spuit.</li>
		<li>Plaats een injector pomp op de spuit.</li>
		<li>Plaats de spuit en de pomp op de houder van het instrument van een manipulator geplaatst op een stereotaxic instrument. Kantel de manipulator 12° posteriorly van de verticale as.</li>
		<li>Anesthetize van een mannelijke of vrouwelijke volwassen muis (C57BL/6J of Tlx3-cre/Ai9) door het injecteren van sodium pentobarbital intraperitoneally (60 mg/kg lichaamsgewicht) of door het toedienen van Isofluraan (2-3%). Wacht totdat de muis geen reactie maakt wanneer haar staart is geknepen met pincet, die aangeeft dat de muis is volledig verdoofd.</li>
		<li>Plaats de muis op de stereotaxic instrument.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig haar met behulp van een scheermesje ter voorkoming van infectie en snijd 10 mm van de hoofdhuid zodat de bregma en de lambda zichtbaar zijn. Beheren van 0,1 mL van de 1% lidocaïne met behulp van een precisiepipet. Stel de hoek van het hoofd door de verticale positie van het mondstuk op de stereotaxic instrument aan te passen, zodat de bregma en de lambda hetzelfde z-niveau hebben.</li>
		<li>De positie van de manipulator aanpassen door deze te schuiven op de stereotaxic instrument zodat het uiteinde van de spuit zich dicht bij de bregma en de positie van de manipulator opnemen. De spuit intrekken door de houder van het gereedschap verplaatsen op de manipulator.</li>
		<li>Verplaatsen van de manipulator 5.4 mm posteriorly en 0,4 mm lateraal. Verder de spuit zodat de tip dicht bij het punt van binnenkomst op de schedel is. De spuit intrekken en markeer het ingangspunt.</li>
		<li>Boor een gat met een diameter van ongeveer 1 mm op het duidelijke standpunt.</li>
		<li>Breng de tip van de injectiespuit door het gat, zodat de tip diepte 6,9 mm is meer dan die bij de bregma gemeten.</li>
		<li>Injecteren 1 µL van verklikstoffen gebruiken van de pomp op 0.2 µL/min.</li>
		<li>Verwijder de injectiespuit uit de hersenen.</li>
		<li>Indien nodig, dekken de blootgestelde hersenen met kleine fragmenten van microfibrillar hemostat en instant lijm.</li>
		<li>Spoel de blootgestelde hersenen met zoutoplossing geleverd met een pipet ter voorkoming van infectie en suture van de hoofdhuid.</li>
		<li>Verwijder de muis uit de stereotaxic instrument. Laat de muis om te herstellen van verdoving in een incubator op 30 ˚C, typisch voor 1 h. Laat niet de muis zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Terug de muis naar het gezelschap van andere dieren, nadat het volledig is hersteld.</li>
		<li>De muis gedurende 3-7 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injecties in de superieure colliculus van volwassen muizen maken
	<ol>
<li>Een glazen pipet met een diameter van de tip van 30-50 µm voor te bereiden.</li>
		<li>De glazen pipet verbinden met een injectiespuit Hamilton via een plastic buis (figuur 2A).</li>
		<li>Vul de glazen pipet, plastic buis en Hamilton spuit met de vloeibare paraffine.</li>
		<li>Plaats een injector pomp op de spuit.</li>
		<li>Plaats de glazen pipet op de manipulator en kantelen van de manipulator 60° posteriorly van de verticale as (figuur 2B).</li>
		<li>Uitvoeren van 2.1.4–2.1.9. De positie van de manipulator is 1.4 mm posterior, 0.5 mm lateral aan de lambda.</li>
		<li>Plaats een kleine plastic paraffine-film op de schedel en vervolgens ongeveer 1 µL van de tracer-oplossing op te zetten. Snel verder de glazen pipet en vul deze met ten minste 0,5 µL van de tracer-oplossing.</li>
		<li>De glazen pipet invoegen zodat de tip diepte 3.0 mm van het oppervlak van de hersenen is.</li>
		<li>Injecteren van 0,5 µL van verklikstoffen gebruiken van de pomp op 0.2 µL/min.</li>
		<li>De glazen pipet uit de hersenen te verwijderen.</li>
		<li>Uitvoeren van 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fixatie en trimmen
<ol><li>Natrium pentobarbital (60 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneally injecteren met een muis (C57BL/6J of Tlx3-cre/Ai9, met of zonder de tracer injectie zoals beschreven in stap 2. Wacht totdat de muis geen reactie maakt wanneer haar staart is geknepen met pincet, die aangeeft dat de muis is volledig verdoofd.</li>
	<li>De muis humaan euthanaseren door zoogdierlevercellen de muis transcardially20 met 0,9% zout.</li>
	<li>Oplossen van de muis20 door zoogdierlevercellen 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.5).</li>
	<li>
Snijd de hoofdhuid met behulp van een paar van schaar om de schedel als beschreven20bloot te stellen.
	<ol>
<li>De middellijn van de blootgestelde schedel met behulp van een paar van schaar te knippen. Het verwijderen van de schedel met pincet.</li>
		<li>Als de positie van de bregma en de lambda markeren noodzakelijk is, eerst verwijderen een halfrond van de schedel. Steek dunne wolfraam naalden in de hersenen op de posities van de bregma en de lambda op de schedel nog op de hersenen en verwijderen van de resterende schedel. Opmerking: De hersenen kan worden opgeslagen in PBS op 4 ˚C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voor het uitvoeren van antilichaam kleuring van remmende neuronen, snijd de hersenen monsters in reepjes.
	<ol>
<li>Leg het monster van de hersenen op een vibratome.</li>
		<li>Snijd plakjes tot 500 µm dik in PBS bij kamertemperatuur en gaat u verder met stap 5 (de AbScale methode).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als antilichaam kleuring overbodig is, trim de hersenen aan het monster wordt geblokkeerd (tot 3 mm dik) met behulp van een scheermesje (Figuur 3) en gaat u verder met stap 4 (de SeeDB-methode). Opmerking: De hersenen kan worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C na uitsnijden of knippen. De SeeDB-methode verdient de voorkeur wanneer het antilichaam kleuring is niet nodig want het vergt minder tijd dan de AbScale methode.</li>
</ol>4. clearing zonder antilichaam kleuring (de SeeDB-methode)
<ol><li>Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 20% (m/v) fructose en laat het 4 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 40% (m/v) fructose en laat het 4 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 60% (m/v) fructose en laat het 4 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 80% (m/v) fructose en Incubeer het 12u met zacht schudden bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 100% (m/v) fructose en Incubeer het 12u met zacht schudden bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 80.2% (w/w) fructose en laat het 24 h met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken. Opmerking: Omgaan met het monster zorgvuldig om vervormingen zo klein mogelijk te houden. Incubeer monsters langer dan aangegeven, niet als monsters kunnen snel ondoorzichtig geworden.</li>
	<li>Het monster in een imaging kamer gevuld met de 80.2% fructose-oplossing (figuur 1B) insluiten. Indien nodig, corrigeren het monster door kleine stukjes rubber lijm rond. Als de kamer te diep is, een vloerplaat in de kamer zetten alvorens de monsters te brengen.</li>
	<li>Plaats de petrischaal met een glasdeel op de imaging kamer en zet water in de schotel, en beeld met behulp van microscopie van de confocal of twee-foton met een water-onderdompeling werken lange afstand doelstelling. Excitatie golflengten en emissie filters staan beschreven in tabel 1. Gebruik indien nodig een gemotoriseerde stadium.</li>
</ol>5. clearing met antilichaam kleuring (de AbScale methode)
<ol><li>Bereiden reagentia zoals beschreven in tabel 2.</li>
	<li>Breng de segmenten met behulp van een spatel tot een 5 mL plastic koker met 4 mL Sca/eS0 oplossing en incubeer hen gedurende 12 h met zacht schudden bij 37 ° C (figuur 4B).</li>
	<li>De oplossing verwijderen uit de buis met behulp van een precisiepipet Voeg 4 mL oplossing van Sca/eA2 en incuberen de segmenten voor 36 h met zacht schudden bij 37 ° C.</li>
	<li>De oplossing van de buis met behulp van een precisiepipet verwijderen Voeg 4 mL Sca/eB4 oplossing en Incubeer de plakjes gedurende 24 uur met zacht schudden bij 37 ° C.</li>
	<li>De oplossing verwijderen uit de buis met behulp van een precisiepipet Voeg 4 mL oplossing van Sca/eA2 en incuberen de segmenten voor 12u met zacht schudden bij 37 ° C.</li>
	<li>De oplossing verwijderen uit de buis met behulp van een precisiepipet en voeg 4 mL PBS en de segmenten gedurende 6 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de plakjes op een plastic buis van 2 mL, met behulp van een spatel.</li>
	<li>Incubeer met primaire antilichamen (tabel 3) in 1 mL van AbScale oplossing voor 48-72 uur bij 37 ° C (figuur 4C) met zacht schudden.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de plakjes op een 5 mL plastic buis met behulp van een spatel.</li>
	<li>Incubeer in 4 mL AbScale oplossing voor 2 h 2 keer bij kamertemperatuur met zacht schudden.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de plakjes op een plastic buis van 2 mL, met behulp van een spatel.</li>
	<li>Incubeer met fluorescently-geëtiketteerden secundaire antilichamen (Tabel van materialen, 1:100) in 1 mL van AbScale oplossing gedurende 48 uur bij 37 ° C met zacht schudden.</li>
	<li>Verwijder de segmenten met behulp van een spatel tot een 5 mL plastic koker met 4 mL van de oplossing van AbScale voorzichtig en de segmenten gedurende 6 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>De oplossing uit de buis met behulp van een precisiepipet verwijderen en toevoegen van 4 mL van de oplossing van AbScale en de segmenten voor 2 h 2 keer met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Verwijder de oplossing uit de buis met behulp van een precisiepipet en voeg 4 mL 4% PFA en de segmenten voor 1 h met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Verwijder de oplossing uit de buis met behulp van een precisiepipet en voeg 4 mL PBS en de segmenten voor 1 h met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>De oplossing van de buis met behulp van een precisiepipet verwijderen Voeg 4 mL van de oplossing van de Sca/eS4 en Incubeer de segmenten voor 12u met zacht schudden bij 37 ° C.</li>
	<li>Plaatst het tussenstuk op een glasplaatje en plaats van de segmenten in de spacer en dompel de plakjes met Sca/eS4 oplossing. Het zegel van de spacer met een glazen cover (Figuur 1 d).</li>
	<li>Zet water op de cover glas en beeld met behulp van microscopie van de confocal of twee-foton met een water-onderdompeling werken lange afstand doelstelling. Gebruik indien nodig een gemotoriseerde stadium. Opmerking: Controleer of de diepe delen van het monster op dezelfde manier worden aangeduid op de oppervlakkige delen om te bevestigen het ontbreken van een significante labeling bias. Opmerking: De penetratie van de geteste antilichamen wordt beschreven in tabel 3.</li>
</ol>6. cel positie bepaling
<ol><li>Voor elke positie in de gescande afbeeldingen, correlatie waarden met behulp van een drie-dimensionaal beeld filter14 (figuur 5A-5D) te berekenen.</li>
	<li>Het bepalen van de standpunten van de toppen van de waarde van correlatie (figuur 5D).</li>
	<li>Onderzoeken-afbeeldingen rond de toppen om cellen (figuur 5E) te zoeken.</li>
</ol>

<ol><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462(2015).</li>
<li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+Challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+column%3A+a+structure+without+a+function%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li>
<li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+cortical+column+would+that+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose cortical column would that be?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li>
<li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li>
<li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kim, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631(2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex%2C+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+%28Ce3D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij hebben de procedures voor het verkrijgen van grootschalige driedimensionale beelden van de cel type-specifieke organisatie van de grote celtypes in muis neocortical laag 5 ingediend. Vergeleken met de conventionele segment kleuring, is de methode meer nuttig bij het bepalen van de driedimensionale organisatie van de neocortex. De methode kunt image aquisition van de bredere en de diepere hersengebieden in vergelijking met de typische in vivo 2-foton microscopie of conventionele confocale microscopie en, dus,...

De zoogdieren neocortex is samengesteld uit een groot aantal celtypes, elk met de specifiek gen-expressiepatronen, elektrofysiologische en biochemische eigenschappen, synaptic verbindingen, en functies in vivo 1,2 ,3,4,,5,,6,7. Of deze celtypes herhaalde structuren worden geordend is onduidelijk. Corticale kolommen, met inbegrip van visuele oriëntatie kolommen en somatosensorische vaten, structuren hebben herhaald, maar hun cellulaire organisatie blijft onduidelijk8,9. Deze zijn aanwezig in de specifieke corticale gebieden en niet een hersenen-omspannend rechtssysteem.
In neocortical laag 5, worden de grote meerderheid van de neuronen ingedeeld in vier grote typen. Een belangrijk type van excitatory neuronen, sub cerebrale projectie neuronen, axonen bij subcorticale doelen, met inbegrip van de pons, ruggenmerg en superieure colliculus projecten, en daarom, vertegenwoordigt de grote corticale uitvoer traject10. Projectie van de corticale neuronen, een andere belangrijke soorten excitatory neuronen, innervate de cortex10. Remmende neuronen bevatten ook twee grote klassen: parvalbumin-uitdrukken en het uiten van Somatostatine cellen11.
Recente analyses geven aan dat de vier celtypes herhaalde structuren12,13,14worden geordend. Zowel sub cerebrale projectie neuronen12,13,14 en projectie van de corticale neuronen14 indelen in celtype specifieke microcolumns met een diameter van 1-2 cellen. Parvalbumin-uitdrukken en het uiten van Somatostatine cellen uitlijnen specifiek met microcolumns van sub cerebrale projectie neuronen maar niet met de microcolumns van projectie van de corticale neuronen14 Microcolumns zelf uitlijnen periodiek op vorm een zeshoekige rooster matrix14 en aanwezig zijn in meerdere corticale gebieden met inbegrip van visuele, somatosensorische en motor in12,14 van de hersenen van de muis en in taal gebieden van menselijke hersenen13. Neuronen in de individuele microkolom gesynchroniseerde activiteit vertonen en hebben soortgelijke sensorische reacties14. Deze opmerkingen geven aan dat de laag 5 celtypes organiseren in een microkolom rooster structuur vertegenwoordigen de eerste bekende hersenen bestrijkende organisatie functionele modules te herhalen.
Microcolumns hebben een straal van ongeveer 10 µm en een ruimtelijke frequentie van ongeveer 40 µm. Daarnaast is de richting van microcolumns parallel aan hun apicale dendrites en wijzigingen afhankelijk van hun positie in de cortex-14. De microkolom systeem is daarom moeilijk om te analyseren met behulp van conventionele corticale segmenten met een typische dikte van enkele tientallen micrometers. Bovendien, de analyse van de periodiciteit driedimensionale gegevens uit een groot aantal hersengebieden, en dus de typische opnamegebied van confocale microscopie vereist of in vivo 2-photon imaging is te smal.
Onlangs, technieken zijn ontwikkeld om te wissen van dikke weefsels15,16. Hier beschrijven we de toepassing van deze methoden voor het verkrijgen van grootschalige, drie-dimensionale beelden van de belangrijkste celtypen in muis neocortical laag 5 waaruit de microkolom systeem. Subcerebral projectie neuronen worden aangeduid door de retrograde labelen of door de uitdrukking van de verbeterde groen fluorescent proteïne in Crym-egfp transgene muizen12, en corticale projectie neuronen worden aangeduid door hetzij de retrograde labeling of door de expressie van de tdTomato in Tlx3-cre/Ai9 muizen17. Parvalbumin-uitdrukken en het uiten van Somatostatine cellen worden aangeduid door immunohistochemie. De methode (antilichaam schaal S) AbScale18 wordt gebruikt voor het antilichaam kleuring van experimenten, terwijl de methode (Zie diepe brein) SeeDB19 wordt gebruikt voor andere experimenten. Deze methoden de bovengenoemde moeilijkheden van de conventionele beeldvormende methoden en onthullen de nauwkeurige cellulaire organisatie van laag 514.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgene muizen</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgene muizen</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Siliconenrubberblad</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0,5 mm dikte</td></tr><tr><td>Siliconenrubberblad</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1,0 mm dikte</td></tr><tr><td>Siliconenrubberblad</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3,0 mm dikte</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxine subeenheid B (recombinant), Alexa Fluor 488-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxine subeenheid B (recombinant), Alexa Fluor 555-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxine subeenheid B (recombinant), Alexa Fluor 594-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxine subeenheid B (recombinant), Alexa Fluor 647-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton spuit</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Injectorpomp</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons injectie</td></tr><tr><td>Injectorpomp</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior colliculus injectie</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Natrium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine injectie 1% met epinefrine</td><td></td></tr><tr><td>Boor</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillaire hemostaat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische zijde</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipet</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Elektrode puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine vloeistof, licht</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Salina</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraam naald</td><td>Inter medical</td><td>&Phi;0,1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastic buis</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Twee-foton microscoop</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersie objectieven met lange werkafstand</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersie objectieven met lange werkafstand</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde stage</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastic buis</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastic buis</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-cyclodextrine</td><td>Tokyo chemical industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-Cyclodextrine</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1,1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Muis IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Ezel anti-Konijn IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersie objectieven met lange werkafstand</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td>

grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de neocortex muis

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

De zoogdieren neocortex is samengesteld uit vele soorten excitatory en remmende neuronen, elk met specifieke elektrofysiologische en biochemische eigenschappen, synaptic verbindingen, en in vivo functies, maar hun basic functionele en anatomische organisatie van cellulaire netwerk schaal wordt slecht begrepen. Hier beschrijven we een methode voor de driedimensionale beeldvorming van fluorescently-geëtiketteerden neuronen over grote gebieden van de hersenen voor het onderzoek van de corticale cellulaire organisatie. Bepaalde soorten neuronen worden aangeduid door de injectie van fluorescerende retrograde neuronale verklikstoffen of expressie van fluorescente proteïnen in transgene muizen. Blok hersenen monsters, bijvoorbeeld een halfrond, zijn bereid na fixatie, transparant gemaakt met weefsel van het ontruimen van de methoden, en onderworpen aan fluorescerende immunolabeling van de specifieke celtypes. Grote gebieden worden gescand met behulp van de confocal of twee-foton microscopen uitgerust met grote werken afstand doelstellingen en gemotoriseerde stadia. Deze methode kan de periodieke organisatie van de cel type-specifieke microkolom functionele modules in de neocortex muis is opgelost. De procedure kan nuttig zijn voor de studie van drie-dimensionale cellulaire architectuur in de verschillende hersengebieden en andere complexe weefsels.

We label projectie van de corticale neuronen door expressie van tdTomato in Tlx3-cre/Ai9 transgene muizen en sub cerebrale projectie neuronen gevisualiseerd door het injecteren van de retrograde tracer CTB488 in de pons. De linker hemisfeer van de hersenen werd blootgesteld aan de SeeDB-methode en gescand met behulp van een twee-foton microscoop voorzien van een water-onderdompeling lange afstand doelstelling werken (25 X, N.A. 1.1, afstand 2 mm) en een gemotoriseerde po...

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van neurowetenschappen, zoals de analyse van de structuur en functie van de neocortex. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de grootschalige driedimensionale structuur in de hersenen kan onthullen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de neocortex, kan het ook worden toegepast op andere zenuwstelsels, zoals het ruggenmerg.Om de tracer in de pons van volwassen muizen te injecteren, trekt u eerst één microliter van de fluorescent gelabelde Cholera toxine subeenheid B in een Hamilton-sering met een dikte van 26 gauge. Plaats een injectorpomp op de spuit en plaats vervolgens de spuit en de pomp op de gereedschapshouders van een manipulator op een stereotactisch instrument. Kantel de manipulator 12 graden naar achteren vanaf de verticale as.Plaats vervolgens de muis op het stereotactisch instrument. Gebruik een scheermesje om het haar te verwijderen om infectie te voorkomen. Snijd vervolgens 10 millimeter van de hoofdhuid zodat de bregma en lambda zichtbaar zijn.Breng 0,1 milliliter 1% lidocaine aan met behulp van een pipette. Stel de hoek van het hoofd in door de verticale positie van de mondstuk op het stereotactisch instrument aan te passen, zodat de bregma en lambda dezelfde Z-niveau hebben. Pas vervolgens de positie van de manipulator aan door deze op het stereotactisch instrument te schuiven, zodat de punt van de spuit dicht bij de bregma is.Noteer de positie van de manipulator. Trek de spuit terug door de gereedschapshouders op de manipulator te verplaatsen. Vervolgens beweeg de manipulator 5,4 millimeter naar achteren en 0,4 millimeter naar de zijkant.Schuif de spuit naar voren zodat de punt dicht bij het toegangspunt op de schedel komt, trek vervolgens de spuit terug en markeer het toegangspunt. Op de gemarkeerde positie, boor een gat met een diameter van ongeveer één millimeter. Steek de punt van de spuit door het gat, zodat de spuittand 6,9 millimeter dieper is dan die gemeten bij de bregma.Injecteer vervolgens één microliter tracers met behulp van de pomp bij 0,2 microliter per minuut. Verwijder na de injectie de spuit uit de hersenen. Indien nodig, bedek het blootgestelde brein met kleine fragmenten microfibrillaire hemostaat en instant lijm.Veeg het blootgestelde brein af met zoutoplossing om infectie te voorkomen en naai het hoofdhuid. Verwijder vervolgens de muis uit het stereotactisch instrument. Laat de muis ongeveer een uur herstellen van de anesthesie in een incubator bij 30 graden Celsius.Laat de muis niet onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn heeft herkregen om de borst te kunnen blijven liggen. Breng de muis terug naar de andere dieren nadat het volledig is hersteld. Om het hersenweefsel te verzamelen, snijd het hoofdhuid met een schaar om de schedel bloot te leggen.Snijd vervolgens de middellijn van de blootgestelde schedel met een schaar. Verwijder vervolgens de schedel met behulp van een pincet. Als het markeren van de positie van de bregma en lambda noodzakelijk is, verwijder eerst een zijde van de schedel.Steek vervolgens dunne tungsteennaalden in de hersenen op de posities van de bregma en lambda en verwijder vervolgens de rest van de schedel. Plaats vervolgens het hersenmonster op het vibratome platform. Snijd de secties tot 500 micrometer dik in PBS bij kamertemperatuur.Overbreng in deze procedure de plakjes naar een plastic buis van vijf milliliter met vier milliliter van de Scale S0-oplossing. Incubeer ze vervolgens gedurende 12 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 12 uur de oplossing uit de buis met behulp van een pipette en voeg vier milliliter van de Scale A2-oplossing toe.Incubeer de plakjes gedurende 36 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 36 uur de oplossing uit de buis en voeg vier milliliter van de Scale B4-oplossing toe. Incubeer de plakjes gedurende 24 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius.Verwijder na 24 uur de oplossing uit de buis en voeg vier milliliter van de Scale A2-oplossing toe. Incubeer de plakjes gedurende 12 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 12 uur de oplossing uit de buis en voeg vier milliliter van PBS toe.Incubeer de plakjes gedurende zes uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de plakjes voorzichtig in een plastic buis van twee milliliter. Incubeer ze met een primaire antilichaam in één milliliter van de AB Scale-oplossing gedurende 48 tot 72 uur bij 37 graden Celsius met zacht schudden.Verwijder vervolgens de plakjes voorzichtig in een plastic buis van vijf milliliter. Incubeer ze in vier milliliter van de AB Scale-oplossing gedurende twee uur twee keer bij kamertemperatuur met zacht schudden. Verwijder vervolgens de plakjes voorzichtig in een plastic buis van twee milliliter.Incubeer met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam in één milliliter van de AB Scale-oplossing gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius met zacht schudden. Verwijder voorzichtig de plakjes in een plastic buis van vijf milliliter met vier milliliter van de antilichaam Scale-oplossing en incubeer de plakjes gedurende zes uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en voeg vier milliliter van de AB Scale-oplossing toe en incubeer de plakjes gedurende twee uur twee keer met zacht schudden bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de oplossing en voeg vier milliliter van 4%PFA toe en incubeer de plakjes gedurende één uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de oplossing en voeg vier milliliter van PBS toe en incubeer de plakjes gedurende één uur met zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en voeg vier milliliter van de Scale S4-oplossing toe en incubeer de plakjes gedurende 12 uur met zacht schudden bij 37 graden Celsius.Plaats vervolgens de afstandhouder op een glasplaat en plaats de plakjes in de afstandhouder en dompel de plakjes in de Scale S4-

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Haakse microprisma ingebracht in de muis neocortex maakt diepe beeldvorming van meerdere corticale lagen met een standpunt typisch gevonden in slice. One-millimeter microprisma bieden een breed veld-of-view (~ 900 um) en ruimtelijke resoluties voldoende om dendritische spines op te lossen. We demonstreren laag V neuronale beeldvorming en neocorticale vasculaire beeldvorming met behulp van microprisma.

In vivo beeldvorming van Deep Corticale lagen met behulp van een microprisma

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Multifoton microscopie van hele muis organen is mogelijk door de clearing optisch orgaan voor beeldvorming, maar niet alle protocollen behouden het fluorescerende signaal van fluorescerende eiwitten. Met behulp van een optische clearing methode met ethanol op basis van uitdroging en benzylalcohol: benzylbenzoaat clearing, tonen we een hoge resolutie multifoton beelden van de hele hersenen van muizen uiten YFP.

Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Deze studie beschrijft de stappen voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen door micro-computertomografie (micro-CT) en een contrastmiddel te combineren in ex vivo monsters. We beschrijven basis morfometrische analyses om de grootte en vorm van de hersenen in deze beelden te kwantificeren.

Micro-CT-beeldvorming en morfometrische analyse van neonatale hersenen van muizen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de neocortex van muizen. Deze methode onthult neuronale structuren en kan worden toegepast op andere delen van het zenuwstelsel.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Meer video's verkennen