Name: Toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer toluidineblauwe verkleuring van hars-ingebedde zenuwsecties voor morfologische analyse van perifere zenuwen bij ratten. Deze methode biedt hoogwaardige beelden voor onderzoek naar zenuwherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil thankthe Jenkins microscopie faciliteit bij de Universiteit van Wyoming voor hun hulp, en de leden van de Bushman lab, Kelly Roballo, Hayden waarheidsgetrouw, Wupu Osimanjiang en Subash Dhunghana, voor hulp bij de verzorging van de dieren. Deze publicatie werd mogelijk gemaakt door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant # 2P20GM103432.

Volwassen Sprague-Dawley ratten werden gebruikt in dit project en alle procedures door de University of Wyoming institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité zijn goedgekeurd.
1. operatie en In Vivo zenuw fixatie
Opmerking: De leveranciersgegevens voor alle materialen en apparatuur die wordt gebruikt in dit protocol worden opgesomd in de Tabel van materialen.
Opmerking: In vivo de fixatie van de zenuw wordt gebruikt voor het behouden van het weefsel en structurele degradatie dat tussen het moment van overlijden en verzameling van de zenuwen plaatsvinden kan te verminderen. In vivo weefsel fixatie is een standaardprocedure voor bereiding van weefsel van het zenuwstelsel voor histologie, waar perfusie is vaak een voorloper van dit. De plaatsing en grootte van perifere zenuwen toegestaan voor in situ fixatie. We raden niet collectie en fixatie van weefsel na euthanasie te wijten aan de mogelijkheid van de aantasting van het weefsel.
<ol><li>Narcose de rat voorbereiden door deze te plaatsen in een inductie-kamer met 2-3% Isofluraan, dan plaatst u de narcose rat in de vatbaar positie op de bovenkant van een dissectie mat en onderhouden op 1-2% van Isofluraan via verdoving neus. Om ervoor te zorgen voldoende diepte van anesthesie, proefdieren voor het intrekken van de pedaal op de achtervoeten en controleren op de afwezigheid van ooglidreflex reflexen aan de ogen door het aanraken van de mediale canthus van het oog. Opmerking: Intraperitoneale injectie van ketamine is een veelgebruikte alternatief voor geïnhaleerde Isofluraan.</li>
	<li>Om te bloot van de nervus ischiadicus, scheren van het haar van de hind limb(s) en reinig de geschoren gebieden met 70% ethanol. Met een scalpel of schaar, maak een incisie van 2-3 cm in de huid langs de hind-limb vanaf de knie tot de grotere trochanter, waar palpatie van het dijbeen met behulp van de steriel scalpel om ervoor te zorgen de juiste locatie van de incisie. Het dijbeen is gelegen net proximale tot het meest toegankelijke segment van de nervus ischiadicus. Hoewel dit een niet-survival chirurgie is, handhaven steriele technieken.</li>
	<li>Na het maken van de huid incisie, zoek het vliegtuig tussen de musculus biceps femoris en de Musculus gluteus maximus, en met behulp van microdissection schaar scheiden van de onderliggende fascia en 2-3 cm van de onderstreping ischiadicus zenuw bloot. Om een duidelijke sectie van de nervus ischiadicus worden blootgesteld, gebruikt u een oprolmechanisme uit te breiden van de kloof tussen de twee spieren (figuur 1A). Met fijne pincet en iris schaar, zorgvuldig de zenuw van het omringende bindweefsel, met grote zorg niet te comprimeren of de zenuw te scheiden.</li>
	<li>Voeg voldoende Trump de fixeer (4% formaldehyde, Glutaaraldehyde van 1% in 1 x PBS (phosphate buffered saline) met 1.16 g van NaH2PO4· H2O per 100 mL) in de holte met de blootgestelde zenuw betrekking hebben op de zenuwen te laten zitten voor 10 minuten. Als nodig, plaats gaas onder het achterste been om de hoek, zodat meer fixeerspray kan worden toegevoegd in de holte. Verwijder de fixeerspray na 10 min en herhaal deze stap twee meer tijden.</li>
	<li>Met behulp van een ontleden Microscoop, de zenuw aan beide zijden met behulp van fijn dissectie schaar, om ervoor te zorgen niet te rekken of knijpen van de nervus ischiadicus, knippen en zetten direct de zenuw secties in 15 mL tubes met de Trump fixeerspray bij 4 ° C gedurende één week, veranderen de elke 48 h-fixeerspray.</li>
	<li>Laat geen dieren zonder toezicht tijdens een deel van de chirurgische ingreep. Na verwijdering van de zenuw, euthanaseren dieren door cervicale dislocatie terwijl onder verdoving.</li>
</ol>2. Osmium Tetroxide behandeling en hars inbedding
<ol><li>Post van fixatie, zorgvuldig verwijderen van alle resterende vet en bindweefsel van de zenuw en gebruik een scherpe scalpel te snijden van de zenuw in segmenten ongeveer 5 mm lengte (zenuw segmenten kunnen worden gescheiden en voorzien in verschillende buizen). Bereiden van verse 2% osmium tetroxide verdund in de Trump kleefpoeders oplossing en houden in een glazen buis. Onderdompelen zenuw segmenten in 2% osmium tetroxide voor 2 h, die in plastic buizen voor deze korte periode van tijd worden kan. Opmerking: Sommige plastic buizen reageren met osmium tetroxide, veroorzaakt een verdonkering van de oplossing, zodat langdurige opslag van osmium tetroxide in plastic buizen wordt niet aanbevolen.</li>
	<li>Met behulp van een epoxy middellange kit te embedding, bereiden de uiteindelijke insluiten formule:<ol>
<li>Meng de epoxy insluiten medium met DDSA-oplossing (dodecenylsuccinic anhydride (en); mengsel A) en meng de epoxy insluiten medium met NMA oplossing (methylnadic anhydride (en), mengsel B). Laat beide mengsels A en B ten minste 20 min. mix door roeren met een magneetroerder.</li>
		<li>Onmiddellijk vóór gebruik, meng mengsel A en B en het toevoegen van de versneller DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) in het aandeel van 1,5 tot 2,0% van het totale volume van het mengsel. Er rekening mee dat de DPM-30-oplossing juist om te voorkomen dat het blok donker van kleur en breekbaar moet worden gemeten. Alle hars chemische stoffen zijn giftig; Neem extra zorg om te voorkomen dat contact met de huid of bij inademing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van 1,5 mL buizen, wassen zenuw segmenten met PBS en start het proces van uitdroging door het plaatsen van de zenuw segmenten in verschillende aceton/gedistilleerd water passages: 30%, 60%, 90%, concentraties voor elke 10 min, dan in 100% aceton 3 keer voor elke 10 min.  Merk op dat ethanol gebruikt kan worden in de plaats van aceton.</li>
	<li>Voor hars infiltratie, plaatst u de zenuw segmenten in een mengsel van 1 deel van het definitieve insluiten mengsel en 1 deel 100% aceton voor 30 min., daarna in een mengsel van 2 delen van het definitieve insluiten mengsel en 1 deel 100% aceton voor 30 min , en ten slotte de zenuw in de finale segmenten plaats insluiten mengsel gedurende 30 minuten.</li>
	<li>De zenuw segmenten gestoken silicone rubber molds te embedding (we hebben gebruik gemaakt van 106 mm lengte x 71 mm breedte x 7 mm diepte; blokkeren grootte 11 mm lengte x 6 mm breed x 3 mm diep). Zachtjes toevoegen de hars op de top van de zenuwen, ervoor zorgend om dekking van de hele zenuw segmenten en luchtbellen voorkomen. Laat de mal met zenuw segmenten met de hars te polymeriseren bij 60 ° C's nachts.</li>
</ol>3. afdelen door Ultramicrotome
<ol><li>Bereiden van glas messen met een glas mes maker (figuur 1B) en glas messen met boten (Figuur 1 c), die worden gebruikt voor het verzamelen van de zenuw secties drijvend op het gedestilleerd water.</li>
	<li>Plaats de hars ingesloten zenuw blokken in de ultramicrotome houder met de trapeziumvormige zijde naar boven. Gebruik het toepassingsgebied van de ultramicrotome, trim eventuele overtollige hars rondom het zenuwweefsel, en het blok een trapezium vorm gezicht en zo dicht bij de longitudinale oppervlak van de zenuw mogelijk met behulp van een single-edged mes, zoals een scheermesje. Niet doordringen in de lengterichting oppervlak van het zenuw-segment, die herkenbaar is door zijn donkere vlekken door osmium tetroxide. Opmerking: Trimmen van overtollige hars vermindert het gebied van hars worden gesegmenteerd en verbetering van de prestaties van de blade en snijden in opeenvolgende stappen.</li>
	<li>Met behulp van de ultramicrotome, maken meerdere kruissecties voldoende om een uniforme doorsnede oppervlakte van het zenuwweefsel gebruikend een mes plain glas bloot te stellen. Zodra dit is gedaan, ga naar een glas mes waarvan boot is gevuld met gedestilleerd water op kamertemperatuur en aanpassen van de ultramicrotome tot 1-2 μm te snijden van dunne secties.</li>
	<li>Overbrengen in zwevende dunne secties van de glazen mes boot een druppel gedeïoniseerd water op glasplaatje met behulp van metalen lus (Figuur 1 d). Dia's met secties door meerdere malen boven een vuur voor een paar seconden, om ervoor te zorgen niet te oververhitten van de secties te drogen. Gedroogde secties onmiddellijk met toluïdine blauwe vlekken of bewaren bij kamertemperatuur voor enkele dagen voor de kleuring. Opmerking: Secties kunnen ook worden gedroogd met behulp van een schotelverwarmer bij 60 ° C gedurende 15 minuten. Een langzaam droogproces maakt de secties glad.</li>
</ol>4. toluïdine blauw kleuring
<ol><li>Bereid 1%-oplossing van toluïdine blauw door ontbinding van 2 g natriumboraat in 100 mL gedeïoniseerd water, dan Voeg 1 g toluïdine blauw en roer tot het is opgelost. Filtreer de oplossing met behulp van filtreerpapier (porie grootte: 11 µm) en bewaar de oplossing in een ondoorzichtige fles op kamertemperatuur voor maximaal twee weken.</li>
	<li>Met behulp van een plastic pipet of micro Pipet, voeg een druppel toluïdine blauwe oplossing op de top van de secties van de zenuw en laat gedurende 20-30 s.</li>
	<li>Spoel alle toluïdine blauwe oplossing overtollige door zachtjes dompelen de dia's in gedeïoniseerd water kruik en herhaal 3 - 4 keer tot secties duidelijk zijn. De dia's ten minste 15 minuten bij 60 ° C, of 's nachts bij kamertemperatuur drogen en bedek dan de secties met een dekglaasje aan met behulp van reguliere montage medium. De gekoppelde dia's onmiddellijk onderzoeken of bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Onderzoeken onder een lichte Microscoop. Een 100 X olie-immersie objectief wordt aanbevolen voor gedetailleerde beelden gebruikt voor het berekenen van de g-ratio's.</li>
</ol>

<ol><li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development%3A+What+small+animal+models+can+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li>
<li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury%3A+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li>
<li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li>
<li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5%3A+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobioly%22%5BJournal%5D)">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li>
<li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue%3A+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li>
<li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue+and+Lugol%27s+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li>
<li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDykstra%2C+MJ+%22A+manual+of+applied+techniques+for+biological+electron+microscopy%22">A manual of applied techniques for biological electron microscopy</a>. , Plenum. New York. 257(1993).</li>
<li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li>
<li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/joces/s3-105/69/99.full.pdf">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li>
<li>Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+Part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li>
<li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+nerve+biopsies%3A+A+practical+guide+for+neuropathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li>
<li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li>
<li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2004.27.3.161">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li>
<li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2007.30.1.27">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+stains%3A+A+literature+review+and+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Journal+of+Health+Science%22%5BJournal%5D)">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li>
<li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+and+nonporous+nerve+conduits%3A+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li>
<li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse hebben.

Examens van de morfologische structuur van het perifere zenuw verwonding en regeneratie zijn frequente onderwerpen van studie13. In dit protocol beschrijven we de stappen voor het verkrijgen van hoge kwaliteitsbeelden voor histologische ondermeer met behulp van rat nervus ischiadicus weefsel ingebed in hars blokken en met toluïdine blauw gekleurd. Deze techniek geeft een beeld van de morfologie van de zenuw waarin de zenuw regeneratie kan worden gekwantificeerd door het meten van het aantal axonen...

Perifere zenuwen uitbreiden door het lichaam, innervating onderzoeken weefsels met motorische of sensorische axonen1 Perifere zenuwen defecten veroorzaakt door medische aandoeningen en trauma vertegenwoordigen een belangrijke openbare gezondheids-zorg en hebben grote economische gevolgen2,3. Ondanks de vooruitgang bij het beoordelen van de resultaten van de perifere zenuw letsel en begrip van de zenuw regeneratie, zijn traditionele methoden zoals zenuw histologie en kleuring technieken essentiële instrumenten om kwalitatief en kwantitatief beoordelen van zenuw-gezondheid Als een terminal resultaten meting in diermodellen of verwijderde menselijk weefsel. Dit is vaak gekoppeld aan elektrofysiologische metingen van perifere zenuwen functie, waar de morphometry onthullen kan waarom functionele zenuw regeneratie deed of zich niet heeft voorgedaan.
Toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen semi-dunne secties is een gespecialiseerde methode voor imaging-myelinated zenuwvezels, verstrekken van hoge kwaliteit en heldere gedetailleerde beelden van zenuw structuren4,5,6 . Toluïdine blauw is een acidophilic Metachromatische vlek, ontdekt door William Henry Perkin in 18567, en is gebruikt in diverse medische toepassingen8. Toluïdine blauw gebeitste perifere zenuwen secties verkregen zenuw hars-ingebedde segmenten voorziet in duidelijke visualisatie van zenuw structuren. Visualisatie van de myelineschede structuur kan worden verbeterd door het gebruik van osmium tetroxide na fixatie4,9. Osmium-tetroxide is een giftige oxidator en lipide kleefpoeders agent die samenwerkt met de dubbele bindingen in lipiden, wat resulteert in duidelijk gedefinieerde lipide-rijke myeline omhulsels10. Osmium tetroxide is echter giftig, dure, vereist een langere incubatietijd van zenuw segmenten, en niet altijd wordt gebruikt.
Alternatieve methoden van verwerking en vlekken zijn ontwikkeld voor de visualisatie van de morfologie van de perifere zenuw; Paraffine, cryogene afdelen en epoxy hars-embedded zenuw afdelen gevolgd door kleuring met toluïdine blauw of fenyleendiamine oplossing heeft geweest tweedehands voor het kwantificeren van de morfologische veranderingen van perifere zenuw regeneratie 11,12 . Deze methoden hebben hun voordelen en opbrengst essentiële gegevens over het aantal axonen, myeline dikte, diameter van de axon en axon diameter tot en met myelinated vezel diameter (g-ratio) 11,13,14,15 .
Het primaire onderscheid van de hars inbedding in dit protocol is dat het verkrijgen van 1-2 μm dikte dwarsdoorsneden vanwege de hardheid van de hars vergemakkelijkt met behoud van de histologische kwaliteiten van de zenuw. Deze dunne secties, in tegenstelling tot de 4-5 μm dikte secties verkregen paraffine insluiten, bieden perifere zenuwen secties met een hogere resolutie, waardoor een nauwkeuriger kwantificering van axon myelinisering, zoals de g-ratio, die niet kan worden dikkere secties16verkregen. Terwijl cryogene afdelen kan worden gebruikt voor het verkrijgen van 1-2 µm secties, is het onze ervaring dat het moeilijker te verkrijgen van secties zonder talrijke grote barsten is geweest. Deze gebarsten secties kunnen leiden tot onjuiste telling van het aantal axonen en aspecten van myelinisering.
Naast toluïdine blauw kleuring17, kan een silver kleuring methode18 en Masson van trichrome kleuring4 ook worden gebruikt om te laten zien van de zenuw axonen. Echter, met behulp van hars inbedding van rat mediane zenuw secties gekleurd met haematoxyline en eosine of Masson van trichrome toonde vaag myeline omhulsels en niet-herkende structuren, overwegende dat toluïdine blauw kleuring duidelijk myelineschede beeld toonde en gemakkelijk kan worden gekwantificeerde4. Ondanks enkele beperkingen, toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen is een waardevolle techniek die kan worden gebruikt wanneer de hoge resolutie opnamen van zenuw morfologie zijn vereist.
Het primaire nadeel voor het insluiten van de hars is dat het is tijdrovend en niet mogelijk is om immunokleuring van het hetzelfde weefsel als gevolg van de moeilijkheid van het antigeen ophalen in vergelijking met paraffine en bevroren ingesloten secties technieken. Het is dus niet in het algemeen kunnen gebruik maken van het zelfde weefsel voor immunokleuring dat wordt verwerkt via hars-insluiting voor toluïdine blauw kleuring. Hoewel niet gebruikt hier, immunohistochemistry is desgewenst in de hars ingesloten secties, het gebruik van glycol methacrylaat harsen te embedding zorgt voor immunohistochemistry op weefselsecties moeten worden uitgevoerd, maar het is relatief duur19. Dit kan enigszins worden verzacht door het snijden van de perifere zenuw in afzonderlijke segmenten, sommige voor het insluiten van hars en anderen voor immunokleuring direct na fixatie.
Het proces van toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen, zoals met meest histopathologisch analyse, kan worden opgesplitst in vijf fasen, met inbegrip van fixatie, uitdroging, insluiten, afdelen en kleuring van20. Wij willen hier een protocol en praktische leidraad voor het gebruik van hars ingesloten rat nervus ischiadicus secties gekleurd met toluïdine blauw te verwerven hoge kwaliteitsbeelden.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Om Trump's fixatief pH aan te passen</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Voor het trimmen van harsblok</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>Voor het oppakken van dunne harssecties</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Perifere zenuwen uit te breiden door het hele lichaam, innervating onderzoeken weefsels met motorische of sensorische axonen. Als gevolg van wijdverspreide distributie, zijn perifere zenuwen vaak beschadigd als gevolg van trauma of ziekte. Zoals methoden en strategieën zijn ontwikkeld om te beoordelen van de perifere zenuw verwonding in diermodellen, functie en regeneratie, analyseren van de morphometry van de perifere zenuw geworden een essentiële terminal resultaten meting. Toluïdine blauwe verkleuring van de zenuw cross-secties verkregen uit hars ingesloten zenuw secties is een reproduceerbare methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties van de perifere zenuwen, waardoor de visualisatie van morfologie axonen aantal en de mate van myelinisering. Deze techniek, kan zoals bij vele andere histologische methoden, moeilijk zijn om te leren en meester gebruikt standaard geschreven protocollen. De bedoeling van deze publicatie is daarom te accentueren schriftelijke protocollen voor toluïdine blauwe verkleuring van de perifere zenuwen met videografie van de methode, met behulp van de ischiadicus zenuwen geoogst van ratten. In dit protocol, beschrijven we in vivo de fixatie van de perifere zenuwen en de collectie van het weefsel, en na fixatie met 2% osmium tetroxide, inbedding van zenuwen in epoxyhars, en ultramicrotome segmenteren van zenuwen tot 1-2μm dikte. Zenuw secties vervolgens overgebracht naar een glasplaatje en gekleurd met toluïdine blauw, waarna ze zijn kwantitatief als in kwalitatief opzicht beoordeeld. Voorbeelden van de meest voorkomende problemen worden weergegeven, evenals stappen voor deze problemen.

Hars ingesloten perifere zenuw secties gekleurd met toluïdine blauwe toestaan voor nauwkeurige histologische ondermeer. Een overzicht van de procedure blijkt uit (Figuur 2). Ischiadicus zenuwen secties ingesloten in hars medium en gekleurd met toluïdine blauwe toonde duidelijke beelden met optimale resolutie (3 cijfers). Schade aan de zenuwen kan leiden tot veel veranderingen in zenuw morfologische structuren, bijvoorbeeld, veranderingen in d...

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van fijne structuren van perifere zenuwen door verkrijgen en 1-2 µm secties met toluïdine blauwe vlekken

Toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van perifere zenuwbeschadiging en regeneratie, zoals wat de morfologie van een perifere zenuw is, hoeveel axonen er aanwezig zijn, wat de staat van myelinisatie is en of er fibrotisch weefsel aanwezig is? Het grote voordeel van deze techniek is dat het een hoge resolutie visualisatie van zenuwkenmerken mogelijk maakt. Begin door een verdoofde rat in rugligging op de bovenkant van een dissectiemat te plaatsen.Plaats een neuskoker om de anesthesie te handhaven met 1-2% isofluraan. Om een adequate diepte van anesthesie te garanderen, test u de dieren op pedaalintrekking en palpebralereflexen van de achterpoten. Zodra een geschikte anesthesiediepte is bereikt, scheer het haar van de achterpoten en steriliseer de geschoren gebieden met 70% ethanol.Palpeer het dijbeen om de juiste locatie voor de incisie te identificeren. Het dijbeen bevindt zich net proximaal van het meest toegankelijke segment van de nervus ischiadicus. Nadat u een incisie van twee tot drie centimeter in de huid langs de achterpoot heeft gemaakt, vanaf de knie tot aan de trochanter major, lokaliseert u het vlak tussen de biceps femoris spier en de gluteus maximus spier.Gebruik vervolgens microdissectie schaar om het onderliggende fascia te scheiden en onder twee tot drie centimeter van de onderliggende nervus ischiadicus bloot te leggen. Gebruik een retractor om de opening tussen de twee spieren te vergroten. Gebruik fijne forceps en iris schaar om de zenuw voorzichtig van het omringende bindweefsel te scheiden, zorg ervoor dat u de zenuw niet comprimeert of snijdt.Bedek vervolgens de blootgestelde zenuw met Trump's Fixatief en laat 10 minuten staan. Plaats indien nodig gaas onder de achterpoot om de hoek te verbeteren, zodat meer fixatief in de holte kan worden toegevoegd. Verwijder het fixatief na 10 minuten en herhaal deze stap nog twee keer.Snij onder de dissectiescoop de nervus ischiadicus aan beide kanten door met fijne dissectieschaar, zorg ervoor dat u de zenuw niet uitrekt of knijpt. Plaats de zenuwsecties onmiddellijk in 15 mL buisjes met Trump's Fixatief en fixeer gedurende een week op vier graden Celsius, ververs het fixatief elke 48 uur. Na fixatie verwijdert u voorzichtig alle resterende vet en bindweefsels van de zenuw en gebruikt u een scherp scalpel om de zenuw in segmenten van ongeveer vijf millimeter lengte te snijden.Zenuwsegmenten kunnen worden gescheiden in verschillende gelabelde buisjes. Dompel zenuwsegmenten gedurende twee uur in vers bereid 2% osmiumtetroxide. Gebruik een epoxy inbeddingskit om de uiteindelijke inbeddingsmixtuur voor te bereiden.Meng het epoxy inbeddingsmedium met DDSA-oplossing en meng het epoxy inbeddingsmedium met NMA-oplossing. Meng beide oplossingen gedurende minimaal 20 minuten met een magnetische roerder. Combineer direct voor gebruik de versneller DPM met oplossing B en combineer dit vervolgens met oplossing A zodat het uiteindelijke gewichtsdeel van de versneller tussen één punt vijf en 2% van het totale volume ligt.Breng de zenuwsegmenten over naar een punt vijf milliliter buisjes en na wassen met PBS, begint u met het uitdrogingsproces door de PBS te vervangen door toenemende concentraties aceton en gedistilleerd water gedurende 10 minuten elk, gevolgd door driemaal 10 minuten in 100% aceton. Een kritische stap is de uitdroging van het weefsel. Water en hars zullen niet interageren, dus als er nog water in het weefsel achterblijft, zal het niet worden geïnfiltreerd door de hars, waardoor gaten in de sectie ontstaan die zijn verstoken van histologische eigenschappen.Voor hars infiltratie, plaats de zenuwsegmenten eerst in een een-op-een mix van inbeddingsmixtuur en 100% aceton gedurende 30 minuten. Na 30 minuten brengt u de segmenten over naar een twee-op-een mix van inbeddingsmixtuur en 100% aceton gedurende 30 minuten. Plaats de zenuwsegmenten in siliconenrubber inbeddingsvormen en voeg voorzichtig de hars bovenop de zenuwen toe, zorg ervoor dat het hele zenuwsegment wordt bedekt en vermijd luchtbellen.Laat de hars overnacht polymeriseren bij 60 graden Celsius. Plaats een harsblok met ingebedde zenuw in de ultramicrotoomhouder met de trapeziumvormige zijde naar boven. Terwijl u door de ultramicrotoom-microscoop kijkt, gebruikt u een scherp mes om overtollig hars rond het zenuwweefsel te trimmen.Doorboor het longitudinale oppervlak van het zenuwsegment niet, dat herkenbaar is aan zijn donkere kleuring door osmiumtetroxide. Gebruik een gewone glazen mes op de ultramicrotoom om meerdere dwarsdoorsneden te maken om een uniforme dwarsdoorsnede van de zenuw bloot te leggen. Zodra dit is gebeurd, schakel over naar een glazen mes met de boot gevuld met gedistilleerd water op kamertemperatuur en stel de ultramicrotoom in op een tot twee micron om dunne secties te snijden.Gebruik een metalen lus om zwevende dunne secties van de glazen mesboot over te brengen naar een druppel gedeïoniseerd water op een glazen plaat. Een andere kritische stap is tijdens de overdracht van dunne secties van het glazen mes naar de plaat. Deze dunne secties zijn erg kwetsbaar en kunnen breken of vouwen.Na het snijden, droogt u de secties op de platen door een plaat meerdere keren over een vlam te halen, zorg ervoor dat de secties niet oververhit raken. Platen kunnen enkele dagen op kamertemperatuur worden bewaard als ze niet onmiddellijk worden gekleurd met toluidineblauw. Om de zenuwsecties te kleuren, gebruikt u een plastic pipette of micropipet om een druppel toluidineblauw oplossing op de bovenkant van de zenuwsecties te plaatsen.Na 20 tot 30 seconden, spoel u alle overtollige toluidineblauw oplossing weg door de platen voorzichtig in een pot met gedeïoniseerd water te dompelen, herhaal dit drie tot vier keer totdat de secties helder zijn. Droog de platen gedurende ten minste 15 minuten bij 6

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een combinatie van verschillende technieken om het verzamelen van gegevens te maximaliseren van muis weefsel wordt gepresenteerd.

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

This video demonstrates the staining technique of resin-embedded, osmium tetroxide-treated rat peripheral nerve sections using toluidine blue. The stained nerve sections help visualize the fine structures of peripheral nerves.

Toluidine Blue Staining of Peripheral Nerve Sections: A Technique to Stain Myelinated Nerve Fibers For Peripheral Nerve Structure Visualization

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

Technieken voor het visualiseren retinale cytoarchitecture direct aan individuele elektroden binnen een retinale stimulator.

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

Demyeliniserende ziekten kunnen worden gemodelleerd bij dieren door lokale toepassing van lysolecithin in het CZS. Een enkele injectie van lysolecithin in het ruggenmerg van muizen produceert een laesie die zich na verloop van tijd spontaan herstelt. Het doel is om factoren te bestuderen die betrokken zijn bij de- en remyelinisatie en middelen te testen om het herstel te verbeteren.

Experimentele Demyelinisatie en Remyelinisatie van Muriene Spinal Cord door Focal Injectie van lysolecithine

Hier beschrijven we een nieuwe voorbereiding voor het beeldvormen van levende lancetvormige sensorische terminalen van palissade-uiteinden die tijdens kleuring en ontkleur met styryl pyridinium kleurstoffen de haarzakjes van de muizenoorhuid innerveren.

Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.

Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Leer toluidineblauwe verkleuring van hars-ingebedde zenuwsecties voor morfologische analyse van perifere zenuwen bij ratten. Deze methode biedt hoogwaardige beelden voor onderzoek naar zenuwherstel.

Toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen

Meer video's verkennen