Toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van perifere zenuwbeschadiging en regeneratie, zoals wat de morfologie van een perifere zenuw is, hoeveel axonen er aanwezig zijn, wat de staat van myelinisatie is en of er fibrotisch weefsel aanwezig is? Het grote voordeel van deze techniek is dat het een hoge resolutie visualisatie van zenuwkenmerken mogelijk maakt. Begin door een verdoofde rat in rugligging op de bovenkant van een dissectiemat te plaatsen.

Plaats een neuskoker om de anesthesie te handhaven met 1-2% isofluraan. Om een adequate diepte van anesthesie te garanderen, test u de dieren op pedaalintrekking en palpebralereflexen van de achterpoten. Zodra een geschikte anesthesiediepte is bereikt, scheer het haar van de achterpoten en steriliseer de geschoren gebieden met 70% ethanol.

Palpeer het dijbeen om de juiste locatie voor de incisie te identificeren. Het dijbeen bevindt zich net proximaal van het meest toegankelijke segment van de nervus ischiadicus. Nadat u een incisie van twee tot drie centimeter in de huid langs de achterpoot heeft gemaakt, vanaf de knie tot aan de trochanter major, lokaliseert u het vlak tussen de biceps femoris spier en de gluteus maximus spier.

Gebruik vervolgens microdissectie schaar om het onderliggende fascia te scheiden en onder twee tot drie centimeter van de onderliggende nervus ischiadicus bloot te leggen. Gebruik een retractor om de opening tussen de twee spieren te vergroten. Gebruik fijne forceps en iris schaar om de zenuw voorzichtig van het omringende bindweefsel te scheiden, zorg ervoor dat u de zenuw niet comprimeert of snijdt.

Bedek vervolgens de blootgestelde zenuw met Trump's Fixatief en laat 10 minuten staan. Plaats indien nodig gaas onder de achterpoot om de hoek te verbeteren, zodat meer fixatief in de holte kan worden toegevoegd. Verwijder het fixatief na 10 minuten en herhaal deze stap nog twee keer.

Snij onder de dissectiescoop de nervus ischiadicus aan beide kanten door met fijne dissectieschaar, zorg ervoor dat u de zenuw niet uitrekt of knijpt. Plaats de zenuwsecties onmiddellijk in 15 mL buisjes met Trump's Fixatief en fixeer gedurende een week op vier graden Celsius, ververs het fixatief elke 48 uur. Na fixatie verwijdert u voorzichtig alle resterende vet en bindweefsels van de zenuw en gebruikt u een scherp scalpel om de zenuw in segmenten van ongeveer vijf millimeter lengte te snijden.

Zenuwsegmenten kunnen worden gescheiden in verschillende gelabelde buisjes. Dompel zenuwsegmenten gedurende twee uur in vers bereid 2% osmiumtetroxide. Gebruik een epoxy inbeddingskit om de uiteindelijke inbeddingsmixtuur voor te bereiden.

Meng het epoxy inbeddingsmedium met DDSA-oplossing en meng het epoxy inbeddingsmedium met NMA-oplossing. Meng beide oplossingen gedurende minimaal 20 minuten met een magnetische roerder. Combineer direct voor gebruik de versneller DPM met oplossing B en combineer dit vervolgens met oplossing A zodat het uiteindelijke gewichtsdeel van de versneller tussen één punt vijf en 2% van het totale volume ligt.

Breng de zenuwsegmenten over naar een punt vijf milliliter buisjes en na wassen met PBS, begint u met het uitdrogingsproces door de PBS te vervangen door toenemende concentraties aceton en gedistilleerd water gedurende 10 minuten elk, gevolgd door driemaal 10 minuten in 100% aceton. Een kritische stap is de uitdroging van het weefsel. Water en hars zullen niet interageren, dus als er nog water in het weefsel achterblijft, zal het niet worden geïnfiltreerd door de hars, waardoor gaten in de sectie ontstaan die zijn verstoken van histologische eigenschappen.

Voor hars infiltratie, plaats de zenuwsegmenten eerst in een een-op-een mix van inbeddingsmixtuur en 100% aceton gedurende 30 minuten. Na 30 minuten brengt u de segmenten over naar een twee-op-een mix van inbeddingsmixtuur en 100% aceton gedurende 30 minuten. Plaats de zenuwsegmenten in siliconenrubber inbeddingsvormen en voeg voorzichtig de hars bovenop de zenuwen toe, zorg ervoor dat het hele zenuwsegment wordt bedekt en vermijd luchtbellen.

Laat de hars overnacht polymeriseren bij 60 graden Celsius. Plaats een harsblok met ingebedde zenuw in de ultramicrotoomhouder met de trapeziumvormige zijde naar boven. Terwijl u door de ultramicrotoom-microscoop kijkt, gebruikt u een scherp mes om overtollig hars rond het zenuwweefsel te trimmen.

Doorboor het longitudinale oppervlak van het zenuwsegment niet, dat herkenbaar is aan zijn donkere kleuring door osmiumtetroxide. Gebruik een gewone glazen mes op de ultramicrotoom om meerdere dwarsdoorsneden te maken om een uniforme dwarsdoorsnede van de zenuw bloot te leggen. Zodra dit is gebeurd, schakel over naar een glazen mes met de boot gevuld met gedistilleerd water op kamertemperatuur en stel de ultramicrotoom in op een tot twee micron om dunne secties te snijden.

Gebruik een metalen lus om zwevende dunne secties van de glazen mesboot over te brengen naar een druppel gedeïoniseerd water op een glazen plaat. Een andere kritische stap is tijdens de overdracht van dunne secties van het glazen mes naar de plaat. Deze dunne secties zijn erg kwetsbaar en kunnen breken of vouwen.

Na het snijden, droogt u de secties op de platen door een plaat meerdere keren over een vlam te halen, zorg ervoor dat de secties niet oververhit raken. Platen kunnen enkele dagen op kamertemperatuur worden bewaard als ze niet onmiddellijk worden gekleurd met toluidineblauw. Om de zenuwsecties te kleuren, gebruikt u een plastic pipette of micropipet om een druppel toluidineblauw oplossing op de bovenkant van de zenuwsecties te plaatsen.

Na 20 tot 30 seconden, spoel u alle overtollige toluidineblauw oplossing weg door de platen voorzichtig in een pot met gedeïoniseerd water te dompelen, herhaal dit drie tot vier keer totdat de secties helder zijn. Droog de platen gedurende ten minste 15 minuten bij 6