Name: Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer flowcytometrie-workflows voor microbiome-dynamiek van zuivere culturen tot natuurlijke gemeenschappen. Deze methode maakt snelle, kosteneffectieve monitoring van microbiële ecologie en biotechnologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen dankbaar Michael Jahn en Yuting Guo voor het verstrekken van de procedure en de datasets van de reincultuur en de actiefslibinstallatie Gemeenschap, respectievelijk. We bedanken verder Katrin Mörters voor het analyseren van de monsters van de Gemeenschap biogas. Dit werk werd gefinancierd door de Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, Project Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) namens het Duitse Federaal Ministerie voor voedsel en landbouw (BMEL), het centrale innovatie-programma voor kleine en middelgrote ondernemingen (ZIM) van het federale ministerie van economische zaken en energie (BMWi) (INAR-ABO's, 16KN043222), de Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, Project On-demand Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und NUMBIS 33960/01-32), het Duits Federaal Ministerie voor onderwijs en Onderzoek (goedgekeurd) (FZK 03XP0041G), en van de vereniging van de Helmholtz programma georiënteerde financiering (POF III R31 onderwerp 3 bio-energie).

<ol><li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445(2015).</li>
<li>Fathepure, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+in+microbial+degradation+of+petroleum+hydrocarbons+in+hypersaline+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 173(2014).</li>
<li>Alshehrei, F. <a target="_blank" href="http://pubs.sciepub.com/jaem/5/1/2/">Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms.</a> Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).</li>
<li>Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Synthesis+of+medium-chain+chemicals+from+renewables%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).</li>
<li>Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+control+managed+natural+metacommunities%3A+Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+in+metacommunities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities.</a> Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).</li>
<li>Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification%2C+sorting+and+sequencing+of+methanogenic+archaea+based+on+F420+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 180(2017).</li>
<li>Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li>
<li>Lloyd-Price, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains%2C+functions+and+dynamics+in+the+expanded+Human+Microbiome+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project.</a> Nature. 550, 61-66 (2017).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li>
<li>Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li>
<li>Lefort, T., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/plankt/article/36/1/243/1519288">Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters.</a> Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).</li>
<li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462(2016).</li>
<li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li>
<li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li>
<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
<li>Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li>
<li>Günther, S., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning%3A+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li>
<li>Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326(2017).</li>
<li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://digital.csic.es/bitstream/10261/5293/1/planktonic.pdf">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li>
<li>Gasol, J. M., Morán, X. A. G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/8623_2015_139">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li>
<li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/2041-210X.12607">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li>
<li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li>
<li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li>
<li>Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprints%3A+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273(2014).</li>
<li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29265528">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li>
<li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization%3A+Flow+Cytometric+Fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li>
<li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26909672">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een succesvolle analyse van microbiële populaties en gemeenschappen vereist goed gestemde cytometers, een juiste keuze van de parameters van de cel en een betrouwbare workflow van de bemonsterings- en fixatie op weg naar de meet- en gegevens-evaluatie. De geselecteerde cel parameters moeten met de beschikbare excitatie golflengten gemaal. Wij gebruiken en raden DAPI, die zeer gevoelig is bij lage concentraties; maar moet worden opgewekt door een UV-laser, die meestal niet in de standaard cytometer set-ups bestaat. Andere kleurstoffen, zoals SYBR groene ik, ook hele populaties van de vlek of gemeenschappen, maar over het algemeen leveren lagere resoluties. Wij doen niet raden vis procedures of tests van de levensvatbaarheid in microbiële gemeenschappen. Deze benaderingen zijn onmogelijk te kwantificeren, te controleren en te besturen omdat hun effecten op de afzonderlijke soorten in de Gemeenschap is onzeker. Worden ze kunnen niet betrouwbaar getest, zolang een aanzienlijk deel van de typische gemeenschappen nog niet beschikbaar als een reincultuur is.
Kritische stappen in het protocol omvatten procedures voor bemonstering en fixatie, alsmede de cel sorteren. De bemonstering kan worden bemoeilijkt door de neiging van bepaalde reinculturen en microbiële gemeenschappen statistische aan Floc of houden aan deeltjes van de monstermatrix. Het is essentieel om te verdrijven van deze aggregaten en scheiden van de cellen in een monster vóór invoering van hen aan stroom cytometrische analyse te garanderen van betrouwbare resultaten. De gepresenteerde voorbereiding protocollen werden geoptimaliseerd zodat eencellige analyse. Een laatste 50 µm filtratie wordt uitgevoerd vóór de meting op het verwijderen van alle resterende aggregaten en verhinderen dat de 70 µm mondstuk van de cel sorter en de meetcel van de stroom van de analysator verstopping. Cel Floc uit zuiveringsinstallaties voor afvalwater zijn bijzonder overvloedig, robuuste en essentieel voor de functie van het systeem. We onderzochten de planktonische en slib gebaseerd microbiële gemeenschappen in verschillende reservoirs van een volledige behandeling van afvalwater, voor het testen van de gangbaar protocol. Het slib vormen van cel aggregaten waren duidelijk verdwenen en de samenstelling van de Gemeenschap stabiel gebleven. Bovendien tentoongesteld planktonische en slib-gebaseerde gemeenschappen opmerkelijke gelijkenis tussen hen in alle drie bemonsterde tanks (Figuur 8, aanvullende bestand 1-S10). Deze resultaten werden gecontroleerd door vergelijkende 16S rDNA amplicon sequentiebepaling van een zoet-, een formaldehyde behandelde-, een formaldehyde en ethanol gefixeerd-, en een gesorteerde monster10. Buitengewoon uitdagende milieu monsters, zoals sterke biofilms of bacteriën groeien in strak aangesloten kettingen, kan echter onmogelijk te verdrijven. Bodemmonsters kunnen bijzonder problematisch, zoals de alomtegenwoordige deeltjes in het histogram weergegeven en de cellen door enorme overvloed kunnen verdoezelen. In dergelijke gevallen moeten rangschikken van de traditionele methoden worden toegepast.
De stabiliteit van de fixatie van elke nieuwe sample set moet worden getest voordat het ontwerpen van het experiment om resultaat deugdelijkheid te waarborgen. Goede fixatie stabiliteit maakt het ook mogelijk de gepoolde kleuring en waardering van meerdere meetpunten van de tijd op één dag. Het maakt bovendien replicatie metingen en retrospectieve cel sorteren van beslissende tijdstippen na de sluiting en de definitieve evaluatie van het experiment. De stabiliteit van de fixatie van de reincultuur werd meer dan 28 dagen (Figuur 9) gecontroleerd. Voor on-site experimenten, met inbegrip van monster vervoer, moet de stabiliteit van de fixatie over langere perioden (in dit geval, 60 dagen voor de Gemeenschap van actief slib, 195 dagen voor de biogas-Gemeenschap, aanvullende bestand 1-S9) worden getest.
De kleuring is meestal niet problematisch, maar moet worden gecontroleerd met een biologische norm om toepassing van de bioinformatic evaluatie-instrumenten. We gebruikten de mock stam E. coli BL21 (DE3), die was gefixeerd volgens het protocol van ASC en opgeslagen voor gebruik in elke kleuring batch.
Afgezien van de DAPI, SYBR Green ik is met succes toegepast om op te lossen van microbiële gemeenschappen voor meerdere jaren14,23,24,25,26. SYBR Green, ik kan het oplossen van gemeenschappen in hoge- en lage nucleïnezuur deelverzamelingen (HNA en LNA) met behulp van levende cellen in een online modus. DAPI, is specifieker in de binding met DNA en maakt het onderscheid van meer dan 50 subcommunities in één monster set maar vereist een fixatie stap vóór kleuring.
Cel Sorteren is een uitstekende functie van deze aanpak en kan worden toegepast als bepaalde subcommunities van de verdere rente. Het moet worden benadrukt dat noch PFA-(uitgevoerd voor slechts 30 min) noch ethanol behandeling of DAPI kleuring10 een negatief effect op de daaropvolgende 16S amplicon sequencing hadden. Potentieel invloeden van de fixatie en kleuring van procedures op subcommunity metagenome analyses nog moeten worden getest.
Een heleboel informatie over functies van de Gemeenschap en de dynamiek van de trend kan onafhankelijk van de sorteer aanpak worden verkregen wanneer waarbij bioinformatica tools community-features op een virtuele niveau van de cel door de cel te herleiden en verbinden deze functies met abiotische parameters.
Onlangs, een aantal nieuwe bioinformatics evaluatie-instrumenten, allemaal nuttig voor zowel de SYBR groene ik en de DAPI benaderingen, zijn ontwikkeld om op te lossen cytometrische Gemeenschap patronen. Dit zijn de FlowFP27, de pakketten gebruikt in deze studie (flowCHIC20, flowCyBar28), een vastgesteld met zoet water gemeenschappen29 deconvolutie-model en een instrument dat wordt gebruikt om te discrimineren stammen volgens hun fysiologische kenmerken30. Bovendien kan cytometrische diversiteit bepaald25 en zelfs stabiliteit eigenschappen van microbiële gemeenschappen kunnen nu worden gevolgd met een online hulpmiddel10.
Stroom cytometrische analyses hebben dus een enorm voordeel als het gaat om snelle evaluatie van microbiële gemeenschappen en mogelijk abiotische parameter correlaties. Er zijn echter nog steeds beperkingen aan de methode. Het kan niet echt online worden toegepast met het hulpmiddel van de flowCyBar, als gevolg van de ervaren gebaseerd poort instelling procedure. Bovendien zou de ontwikkeling van op maat gemaakte, makkelijk te gebruiken flow cytometers sterk vooraf de proliferatie van de aanpak van de microbiome analyse van het cytometrische van stroom. Eerste stappen in deze richting zijn ondernomen28.
Toekomstige toepassingen van microbiële stroom cytometry kunnen worden voorzien in microbiële ecologie, omdat het zorgt voor de hoge frequentie opvolging binnen het bereik van bacteriële generatie tijden en het is aangetoond dat ecologisch paradigma's zijn van toepassing op gegevens van de cytometrische5 ,10. De methode is zeer nuttig voor routinematige vertoningen van natuurlijke omgevingen zoals de verplichte drinkwater besturingselementen in Zwitserland31. Ook kan het een waardevol instrument voor medische toepassingen zoals menselijke15 of dierlijke32 microbiome screening. Daarnaast kunnen ontwikkelingen in bioinformatics microbiële stroom cytometry als een integraal sensor in het proces controles van beheerde microbiële systemen. Microbiële Gemeenschap cytometry biedt ook een screening tool voor het sorteren van de cel, waardoor hogere resolutie genomic onderzoeken van specifieke communautaire deelverzamelingen.

Micro-organismen spelen een vitale rol in veel aspecten van de mens live. Ze zijn de belangrijkste biotische factoren van de planeten koolstof, stikstof, fosfor en zwavel cycli1, en fungeren als vernederende2,3 , alsmede het synthetiseren van4 biokatalysatoren in diverse industrieën, zoals de behandeling van afvalwater 5 of de biotechnologie6. Zij vormen zelfs de menselijke microbiome, die direct gezondheid van de mens en metabolisme7,8 beïnvloeden is. Daarom is de informatie over de structuur, functie en dynamisch gedrag van micro-organismen, in reactie op hun directe omgeving, nodig als wij willen volledig te begrijpen en manipuleren van deze systemen. Volgende generatie sequencing (NGS) is de gevestigde technologie voor het oplossen van de structuur en functie van de microbiome9. Echter de analyse en evaluatie van gegevens van het NGS kwantitatieve informatie niet kan opleveren, en is nog steeds duur, tijdrovend en geenszins bereid te verlenen ter plaatse resultaten binnen prestaties gangen. Sommige bacteriën weergegeven generatie tijden hieronder 1 h en oorzaak voortdurend veranderende structuren van de Gemeenschap in bepaalde omgevingen10. Na een dergelijke dynamiek, zou met behulp van sequencing benaderingen de capaciteit van het financiële en arbeidskrachten van de meeste wetenschappelijke labs overschrijden.
Daarentegen kan de stroom cytometry Gemeenschap vingerafdrukken NGS gegevens, vergelijkbaar met behoud van een hogere tijd-, arbeid- en kosten-efficiëntie bieden. Hier presenteren we stroom cytometrische technieken kunnen volgen van de microbiële Gemeenschap dynamiek op-lijn op het niveau van één cel. In tegenstelling tot NGS, stroom cytometry biedt geen fylogenetische verwantschap of informatie over functionele genen, maar levert kwantitatieve cel nummers. Met behulp van stroom cytometry, kunnen microbiële gemeenschappen worden opgelost in subcommunities met verschillende lichte spreidings- en fluorescentie-eigenschappen (forward scatter (FSC) en kant scatter (SSC) aanwijzingen geven voor Celgrootte en granulariteit, respectievelijk). De voorgestelde aanpak maakt voornamelijk gebruik van cel grootte - en DNA bedrag van verwante gegevens die zijn gekoppeld aan bepaalde celtypen en valt bestuurlijk gezien onder fysiologische (groei). De DNA-inhoud is gekwantificeerd aan de hand van de UV-prikkelbaar 4', 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) kleurstof, die bindt aan de A-T rijke regio's van het DNA en kan zelfs het oplossen van verschillende chromosomale niveaus. Door het combineren van de DAPI fluorescentie en FSC kunnen meer dan 50 subcommunities worden onderscheiden en gecontroleerd voor het wijzigen van abundanties over tijd11. De subcommunity overvloed variaties kunnen worden gecorreleerd met veranderingen in het milieu micro-omgeving, zoals pH en product titers12, met globale parameters, zoals het weer13,14, of in geval van darm of speeksel microbiomes met bepaalde medische behandelingen15. Deze correlaties onthullen belangrijke subcommunities die verantwoordelijk zijn voor bepaalde functies in het metabolische netwerk van de hele Gemeenschap. De belangrijkste subcommunities kunnen vervolgens worden specifiek bevorderd of onderdrukt door een wijziging van de omliggende micro-omgevingen of voor latere sequencing15 of Proteoom Onderzoek16gesorteerd.
Echter, microbiële Gemeenschap stroom cytometry niet is nog wijdverbreide gevestigd als gevolg van een nogal lage aantal stroom cytometrische apparaten staat correct omzetten van microbiële populaties of gemeenschappen. Anderzijds kan het gebrek aan ervaring, Gemeenschap analyse pijpleidingen en effectieve gegevensevaluatie een toetredingsdrempel voor onderzoekers microbiome analyse uitdagingen vormen. Wij hebben vastgesteld dat uitgebreide werkstromen om deze kwesties aan te pakken. Om te illustreren hun algemene toepasbaarheid, zal presenteren we hen op drie voorbeeldige sample sets (aanvullende bestand 1-S1), namelijk ik) een reincultuur (PC) voor biotechnologische toepassingen gegroeid in beschreven duidelijk medium (Pseudomonas putida KT 2440 op glucose), ii) een complexe lab Gemeenschap in duidelijke medium (actief slib Gemeenschap (ASC) in synthetische afvalwater) en iii) een complexe Gemeenschap van natuurlijke omgevingen in een dichte matrix (biogas Gemeenschap (BC) in maïs kuilvoer).
Verschillende factoren beïnvloeden de keuze van het protocol voor elk van deze sample-sets. Middel van diepvriezen afziet van het gebruik van giftige chemische stoffen, maar is meestal beperkt tot lab omgevingen ten gevolge van het gebruik van vloeibare stikstof voor schok glazuur. De formaldehyde stabilisatie en de daaropvolgende ethanol fixatie kunt bulk steekproeven zonder de noodzaak voor aliquoot voorbereiding en heeft bewezen stabiel te zijn over lange periodes. Eiwitrijke monsters zoals menselijke speeksel15 kunnen echter problematisch, omdat eiwitten Floc, denaturized door de formaldehyde, ongunstige signaal ruisverhoudingen kunnen veroorzaken. Het monster drogen duurt de meeste tijd (ongeveer 1 uur in totaal) van de procedures in deze vergelijking, maar kan worden uitgevoerd op de site, zonder giftige chemicaliën. Het levert stabiele pellets in buizen, die gemakkelijk kunnen worden verzonden zonder koeling of extra gevaar voorzorgsmaatregelen. Bovendien zijn tal van alternatieve fixatie methoden voorgestelde11geweest. Wij adviseren sterk om te testen van de resolutie en fixatie stabiliteit van verschillende protocollen bij de invoering van een nieuwe reeks van de steekproef.
Wij twee verschillende flow cytometers gebruikt voor het analyseren van de sets: i) een zeer verfijnde en duur, onderzoek gecentreerd cel diasorteerderweergave en ii) een toepassing gericht Bank top analyzer die meer geschikt is voor on-site toepassing5verschijnt. De BC werd gemeten met de Bank top analyzer, terwijl de PC en de ASC werden gemeten met de cel sorteerder. De analyse van de drie voorbeeldige monster wordt vereist verschillende procedures voor geoptimaliseerde reproduceerbaarheid, monster stabiliteit en gemak van de werkstroom ingesteld. Het volgende protocol geeft de secties voor de drie verschillende systemen.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q system Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Photomultiplier tubes R928 and R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 software</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &micro;m&nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F8815</td><td>350/440 blauw fluorescerend</td></tr><tr><td>2 &mu;m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 geel-groene fluorescerende kralen&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 blauw fluorescerend</td></tr><tr><td>1 &micro;mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 geel-groene fluorescerende kralen&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,</td><td>Coherent, Inc, Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml;rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>all optical filters</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Build number: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wezenlijke microbiome dynamics – stroom cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Het onderzoek van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek is essentieel om te begrijpen en beheersen van natuurlijke ecosystemen en technische toepassingen aangedreven door micro-organismen. Volgende generatie sequencing methoden worden algemeen gebruikt voor het oplossen van microbiomes, maar ze zijn over het algemeen resource en tijd intensief en vooral kwalitatieve informatie leveren. Flow cytometrische microbiome analyse geen last van die nadelen en kan subcommunity van de relatieve abundanties en absolute cel nummers op-lijn. Hoewel het niet direct fylogenetische informatie leveren, kan het verbeteren van de diepte van de analyse en de resolutie van sequencing benaderingen. In schril contrast met medische toepassingen in zowel onderzoek als standaardsettings, wordt stroom cytometry nog steeds niet op grote schaal gebruikt voor microbiome analyse. Ontbrekende informatie op monster voorbereiding en data analyse pipelines kan leiden een toetredingsdrempel voor de onderzoekers uitdagingen microbiome analyse dat zou vaak leerboek stroom cytometry toepassingen. Hier presenteren we drie uitgebreide werkstromen voor zuivere culturen, complexe gemeenschappen in duidelijk middellange en complexe gemeenschappen in uitdagende matrices, respectievelijk. We beschrijven van individuele procedures voor bemonstering en fixatie en geoptimaliseerd kleuring van protocollen voor de respectieve sample sets. We werken de analyse van de cytometrische met een complex onderzoek gecentreerd en een toepassing gerichte bank top apparaat, beschrijven de cel sorteren van de procedure en suggereren datapakketten analyse. Wij bovendien belangrijke experimentele besturingselementen voorstellen en de gepresenteerde werkstromen van toepassing op de respectieve sample sets.

De volgende representatieve resultaten benadrukken de noodzaak van replicaat-organismen en illustreren van verschillende data visualisatie- en analysetechnieken op elk van de drie sets van de steekproef. Ze tonen de resultaten van mogelijke gegevens evaluatie pijpleidingen geschikt voor het beantwoorden van onderzoeksvragen van de standaard over de respectieve set. De voorgestelde technieken zijn echter niet exclusief voor de monster-set die zij met zijn gepresenteerd. De stroom cytometry onbewerkte gegevens publiekelijk beschikbaar met de FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 gesteld. Eerder zijn geüploade ASC-gegevens beschikbaar onder ID FR-FCM-ZYD7.
Biologische en technische replicatieonderzoeken werden gegrepen, voorbereid en geanalyseerd volgens gepubliceerde protocollen11. Biologische wordt gerepliceerd van de PC en de ASC werden genomen uit drie parallelle kolven. Biologische replicatieonderzoeken voor de BC werden genomen als drie latere proeverijen op één locatie in een pilot schaal plant. Drie aliquots van één monster werden vastgesteld, gekleurd en geanalyseerd om te zorgen voor technische reproduceerbaarheid. De reproduceerbaarheid van methoden werd beoordeeld op basis van eerder gepubliceerde procedures11. Een sjabloon van de poort voor alle monsters van één monster set (aanvullende bestand 1-S6) werd gebruikt voor het berekenen van de standaarddeviatie (%) per poort.
Voor de PC werd de maximale standaardafwijking van de relatieve overvloed 3.44%, terwijl de gemiddelde standaardafwijking 2,13% (Figuur 1 was). Voor de ASC en de BC waren de maximale standaardafwijkingen van de relatieve abundanties 1,27% en 0.88%, terwijl de gemiddelden van de standaarddeviaties 2,13% en 0,21% (aanvullende bestand 1-S8 waren).
Een standaardprocedure, bij het onderzoeken van een zuivere stam cultuur, is de voorbereiding van een groeicurve lag fase, de generatie tijden en de celdichtheid onder bepaalde voorwaarden analyseren. We deze procedure in combinatie met de stroom cytometrische analyse workflow te bereiken een dieper begrip van het systeem (Figuur 2). De FSC vs. DAPI fluorescentie percelen onthullen de Staten van de celcyclus van de cultuur op verschillende tijdstippen van de batch-cultuur. Een master gate sjabloon (aanvullende bestand 1-S6) werd opgericht om het kwantificeren van het percentage cellen met één (c1n), twee (c2n) en meerdere chromosomen (cXn, figuur 2B). Het overheersende aantal geënte cellen had slechts één chromosoom (93,7% bij 0 h). Dit veranderde drastisch tijdens exponentiële groei, waar bijna alle cellen die meer dan één (99,6%, 4 h) en meer dan de helft van de bevolking (53,1%) bevatte zelfs meer dan twee chromosomen. Dit illustreert P. putidas vermogen om te repliceren de chromosomen sneller dan de generatietijd van zijn.
Flow cytometrische analyse heeft bewezen zeer nuttig zijn voor het toezicht op de evolutie van microbiële gemeenschappen. Het kunt communautaire dynamiek dichterbij dan de meer resource intensieve moleculaire methoden5,10volgen. Wij gewezen op deze dynamiek in een film en een overzicht van de actiefslibinstallatie Gemeenschap verschuivingen na verloop van tijd kreeg. Elk één seconde frame toont een FSC vs. DAPI fluorescentie-plot van een monster punt (aanvullende bestand 2). Een duidelijke verschuiving tussen dag 0 en dag 4 werd gevolgd door de oprichting van een kern-Gemeenschap na dag 7. Extra subcommunities kwam op dag 21. Wij vastgesteld een master gate-sjabloon (aanvullende bestand 1-S6) waardoor de evaluatie van microbiële dynamiek op een subcommunity niveau. Het dominante subcommunities in verschillende stadia van het experiment waren duidelijk geïdentificeerd met behulp van het hulpprogramma CyBar (Figuur 3). In combinatie met de frequentieverdeling van de subcommunity van de relatieve abundanties hielp om te selecteren poorten die interessante (significante verandering in overvloed geactiveerd op een belangrijke tijdstip) en levensvatbare (meer dan 5% relatieve overvloed) voor het sorteren en verder analyse22.
Industriële schaal bioreactor toepassingen kunnen potentiële ruimtelijke heterogeniteiten vanwege agitatie beperkingen worden geconfronteerd. Ze worden ook vaak blootgesteld aan de veranderende operationele parameters, zoals de afwisseling in de kwaliteit van de niet-synthetische substraten. De BC vertegenwoordigt van een dergelijk systeem en uit verschillende plaatsen in een dynamisch gedreven plug flow reactor werd bemonsterd. De FSC vs. DAPI fluorescentie percelen (Figuur 4) van de voorbeeldige voorbeeldpunten Toon alleen beetje ruimtelijke, maar uitgesproken temporele heterogeniteit. De BC werd verder onderzocht met behulp van beide, de snel-geautomatiseerde CHIC en de meer diepgaande master gate sjabloon gebaseerde aanpak van de CyBar.
Geautomatiseerde, snelle en onpartijdige karakter van haar, maakt de CHIC met name interessant voor on-site controle van bioprocessen in een industriële omgeving. Rauwe .fcs gegevens van alle beschikbare monsters worden vergeleken. Twee van deze vergelijkingen worden weergegeven in Figuur 5. De resultaatwaarden van de principegeloven bevestigen de eerdere opmerkingen met betrekking tot ruimtelijke en temporele heterogeniteit. De NMDS percelen gegenereerd vorm de CHIQUE tools volgens matrix (Figuur 6) verder concretiseert dit resultaat en visualiseert het dienovereenkomstig.
Bovendien, berekend we de relatieve abundanties van 23 subcommunities van de BC met behulp van een basispagina gate sjabloon (aanvullende bestand 1-S6). Een analyse van de correlatie van 48 monsters uit een periode van één jaar werd uitgevoerd om functionele betrekkingen in de microbiële Gemeenschap te begrijpen. Dit kan bijdragen tot het identificeren van de poorten van belang voor verder onderzoek (4 cel Sorteren). Sterke positieve of negatieve correlaties met abiotische parameters zoals product titers helpen kunnen te begrijpen en ecosystemen en biotechnologische processen te optimaliseren. De organische densiteit opgenomen in deze correlatie (Figuur 7) is een voorbeeld van een dergelijke abiotische parameter. G4, G5 en G10 vertonen sterke positieve correlaties en kan eventueel bevatten fermenterende soorten, terwijl de negatieve correlatie in de G8 naar methanogenic archaea hint kan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Figuur 1: reproduceerbaarheid van cytometrische analyse van de reincultuur. FSC vs. DAPI fluorescentie Staanplaatsen met controle kralen (A, B) en bar percelen van de 3 subcommunity abundanties [%] met foutbalken vertegenwoordigen ± één standaarddeviatie (C, D). De relatieve abundanties werden vastgesteld met de sjabloon van de poort weergegeven in aanvullende bestand 1-S6. Drie biologische replicatieonderzoeken A, B en C werden genomen van de groeicurve 4 uur en drie technische replicatieonderzoeken P1, P2, P3 waren bereid van Monster A en gemeten driemaal, respectievelijk: M1, M2, M3, en worden gegeven met hun respectieve standaarddeviaties. 50.000 gebeurtenissen werden vastgelegd in de cel-poort. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Figuur 2: analyse van de celcyclus van de reincultuur genomen tijdens een groeicurve experimenteren meer dan 12 h. (A). FSC vs. DAPI fluorescentie percelen van de bi-uurtarief bemonsteringen die een verschuiving van de DNA-inhoud tijdens de fase van exponentiële groei vertonen. Deze meting-serie omvat geen kralen (Zie aanvullende bestand 1-S3). (B). optische dichtheid gebaseerde groeicurve met foutbalken die ± één standaarddeviatie en relatieve abundanties in de subcommunities na verloop van tijd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Figuur 3: evolutie van de actiefslibinstallatie communautaire structuur meer dan 24 dagen. (A) de flowCyBar met het bedekken van frequentie distributies gevisualiseerd in boxplots voor de afzonderlijke poorten die zijn gerangschikt door de gelijkenis van de trends, de overeenkomstige kleur toets (B) en een analyse van de gelijkenis in een NMDS perceel wit R < 0,001 () C). de onderliggende percelen worden weergegeven in de volgorde van de film in aanvullende File 2. Relatieve abundanties werden bepaald met behulp van de sjabloon poort in aanvullende bestand 1 - S6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Figuur 4: ruimtelijke en temporele heterogeniteit van de structuur van de microbiële Gemeenschap in industriële schaal plug flow biogas reactor. (A) de vergelijking van de structuur van de microbiële Gemeenschap van de vier bemonstering poorten I-IV op dag 223. (B) de vergelijking van de tijd afhankelijk communautaire structuur variaties van dag 0 tot dag 384 inpoort II. Het geluid heeft te laat zijn afgesneden om de visualisatie. 250.000 evenementen werden gemeten in de cel poort (aanvullende bestand 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Figuur 5: cytometrische Histogram afbeelding vergelijking — CHIQUE. Het beginsel van het CHIQUE algoritme wordt geïllustreerd door het vergelijken van twee monsters ruimtelijke en temporele heterogeniteit, respectievelijk. (i) CHIQUE beelden zijn opgebouwd uit .fcs bestanden na het selecteren van twee parameters weer te geven (FSC vs. DAPI fluorescentie). De grijswaarden (0-255) codeert het aantal gebeurtenissen in een pixel. (ii) CHIQUE deelverzamelingen zijn gegenereerd na het opgeven van het gebied met cellen (hier: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR combinatie image is gemaakt door het vergelijken van pixels tussen de subsets kunt weergeven. Geen verschil gelijk is aan 0 en wordt weergegeven als zwart. Maximaal verschil gelijk is aan 200 en wordt weergegeven als wit. De overeenkomstige XOR-waarde wordt berekend door de waarden van de grijsschaal van alle pixels in de XOR-afbeelding toe te voegen. (iv) combinatie overlaybeeld is gemaakt door de waarden van de grijswaarden van de pixels van de deelverzamelingen toe te voegen. Het bijbehorende overlay-waarde wordt berekend door het tellen van de pixels van een overlay-afbeelding die niet gelijk zijn aan nul en daarom informatie bevatten. (v) volgens waarden worden berekend door XOR en overlay waarden. Dit zijn de basis voor het perceel van de NMDS in Figuur 6. Zowel de principegeloven-waarden en de NMDS plot show een te verwaarlozen ruimtelijke- en een uitgesproken temporele Gemeenschap heterogeniteit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Figuur 6: CHIC gebaseerd gelijkenis analyseresultaten van de monsters van de Gemeenschap biogas. De 0-dagen-monster werd uitgesloten van dit perceel als gevolg van de zeer verschillende communautaire structuur verstoren de analyse (aanvullende bestand 1-S11). De plot van de NMDS bevestigt de veronderstelling over lage ruimtelijke- en hogere temporele heterogeniteit gemaakt met behulp van het CHIQUE gereedschap en toegelicht in Figuur 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Figuur 7: correlatie analyse op de Gemeenschap biogas. De matrix was berekend aan de hand van Spearman rangorde coëfficiënt en is gebaseerd op de relatieve abundanties van 23 subcommunities, die werden vastgesteld met de master gate sjabloon in aanvullende bestand 1-S6. Ze werden gecorreleerd met de organische densiteit (OLR) voor 48 monsters uit een periode van één jaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Figuur 8: analyse van de gelijkenis van planktonische (P) en slib gebaseerd (S) gemeenschappen in afvalwater. Monsters werden genomen uit de primaire clarifier (PCL), geactiveerd slib bekken (AS) en digester tank (DT) voor een volledige behandeling van afvalwater (dot plots in aanvullende bestand 1-S10). Relatieve abundanties werden bepaald met behulp van de sjabloon van de poort weergegeven in aanvullende bestand 1-S6. Deze subcommunity abundanties waren ook geanalyseerd met het hulpprogramma flowCyBar om een CyBar (aanvullende bestand 1-S10) en NMDS perceel (R < 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Figuur 9: fixatie stabiliteit van de reincultuur. Monsters van de groei curve experiment op 0 h genomen werden opgeslagen meer dan 28 dagen bij-80 ° C na fixatie in 15% glycerol. FSC vs. DAPI fluorescentie Staanplaatsen met controle kralen worden weergegeven. Meting serie omvat geen kralen (aanvullende bestand 1-S3). 50.000 gebeurtenissen werden vastgelegd in de cel poort (aanvullende bestand 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende bestand 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende File 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in microbiële ecologie en biotechnologie, bijvoorbeeld welke ecologische concepten een bepaald ecosysteem aansturen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de snelle microbioomdynamiek te volgen met het korte intervalbemonsteringsregime, terwijl het zeer kosteneffectief blijft. Deze methode kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over biotechnologische en natuurlijke microbiële gemeenschappen en ook op dierlijke en menselijke microbiomen voor voedings- en gezondheidstoestanden.De procedure wordt gedemonstreerd door Florian Schattenberg, technicus en SediMeter-operator in ons laboratorium. Om een biogasgemeenschapsmonster te drogen, gebruikt u een aangepaste pipettip van één milliliter om 200 microliter van het stroperige digestaat over te brengen naar een buisje van twee milliliter dat 1,7 milliliter PBS bevat. Na grondig mengen, plaatst u de buisjes een minuut in een ultrasone bad om eventuele grote celaggregaten te ontbinden en cellen die aan plantencelresidu's plakken los te maken.Na het bewerken met ultrasone trillingen, mengt u het monster grondig en filtert u de cellen door een zeef met poriën van 50 micrometer in een plastic buisje van 2 milliliter. Verdeel het filtraat in vier fracties van 400 microliter en centrifugeert u de fracties twee keer, waarbij u beide keren het supernatant volledig weggooit om het microbemonster zo grondig mogelijk mechanisch uit te drogen. Droog vervolgens het monster in een verwarmde vacuümcentrifuge om een stabiel pellet te creëren en bewaar het pellet op vier graden Celsius, beschermd tegen licht.Voor stabilisatie en fixatie van actieve slibmonsters, centrifugeert u vier milliliter van de cellen en suspendeert u het pellet opnieuw in vier milliliter van twee procent formaldehyde in PBS. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeert u het gestabiliseerde celmonster en fixeert u het pellet in vier milliliter 70% ethanol voor opslag bij minus 20 graden Celsius. Meng en breng 0,6 milliliter van de gefixeerde celsuspensie over in een glazen buisje met 1,4 milliliter PBS en soniceer na grondig mengen gedurende 10 minuten, zoals gedemonstreerd.Aan het einde van het bewerken met ultrasone trillingen, verzamelt u de cellen door centrifugatie en suspendeert u het pellet opnieuw in twee milliliter vers PBS. Na grondig mengen, soniceer de cellen zoals zojuist gedemonstreerd gedurende vijf minuten en pas de OD 700 nanometer aan 035 aan met vers PBS. Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeert u het pellet in één mililiter van een permeabilisatiebuffer met 0,11 molair citroenzuur en 4,1 milimolair tween 20, met grondig mengen, gedurende 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur.Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet grondig in twee mililiter van een kleuroplossing met 0,68 micromolair DAPI, voor minimaal 60 minuten incubatie bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voor bead-kalibratie, laadt u de beadmix voor lineaire kalibratie in de flowcytometer en meet u de beads continu terwijl u de nozzle- en laseropticaposities manipuleert om het instrument in het lineaire bereik vooraf te kalibreren. Wanneer de beadpieken in een vooraf ingesteld kalibratiesjabloon passen, schakelt u over naar log-modus en laadt u een logaritmische kalibratie-beadmonster.Pas de logaritmische beadpieken aan aan hun vooraf ingestelde kalibratiesjabloon om de hardware van het instrument te verfijnen en gebruik de photomultiplierbuisversterkerinstelling om eventuele noodzakelijke eindaanpassingen aan de beadpositie te maken. Het meest cruciale aspect van deze procedure is het handhaven van consistente metingen om vergelijkbaarheid tussen experimenten mogelijk te maken. Daarom zijn dagelijkse cytometerkalibratie en het gebruik van beads in de biologische stum-lids essentieel voor het succes van langzame cytomische microbioomdialyse. Wanneer de cellen klaar zijn, mengt u en filtert u de monsters en voegt u de logaritmische beadmix toe aan de cellen.Meng en laad nu het monster op de cytometer en maak een poort om de gekleurde cellen op te nemen en het geluid en de beads uit te sluiten. Analyseer vervolgens de monsters achtereenvolgens met een maximale snelheid van 3.000 gebeurtenissen per seconde totdat 250.000 cellen worden gedetecteerd binnen de celpoort. Om de flowcytometriegegevens te analyseren, ontwikkelt u een master poortsjabloon voor gebruik op alle monsters.Begin met het laden van de flowcytometriestandaardbestanden in een geschikt flowcytometrieanalyseprogramma en verwerk de monsters achtereenvolgens. Laad de monsters, klik dubbel op een meting en selecteer de X- en Y-asparameters, uit hun respectievelijke vervolgkeuzemenu's om een voorwaartse verstrooiing versus DAPI-fluorescentieplot te openen. Gebruik het polygoontekengereedschap om de eerder gegenereerde meetcelpoort te reproduceren om de beads en het geluid uit te sluiten en noem de poort dienovereenkomstig.Sleep de celpoortingang naar de groepslijst van alle monsters en klik dubbel op de celpoort om alleen de celgebeurtenissen selectief weer te geven. Definieer de subgemeenschappen die in een monster prevalent zijn met het elliptische poortgereedschap en pool ze. Voeg vervolgens extra subgemeenschapsallocaties en volgende monsters toe totdat de master poortsjabloon past op alle monsters.Beheers de sjabloon van de master poort met de zijverstrooiingscanmethode om subgemeenschappen die dicht bij elkaar clusteren op te lossen. Voeg vervolgens alle subgemeenschappen toe aan de tabeleditor en stel de uitvoerstatistiek in op frequentie van ouder. Gebruik de tabeleditor om de relatieve subgemeenschapsabundanties te exporteren naar een geschikte spreadsheetsoftware en pas de gegevensopmaak aan volgens de richtlijnen in de zijbalkhandleiding.Vervolgens, om de dynamischen en correlaties van de subgemeenschap te visualiseren, installeert u en laadt u het R-pakket en laadt en normaliseert u het txt-bestand. Voorwaartse verstrooiing versus DAPI-fluorescentieplots onthullen de celcyclustoestanden van pure stamculturen op verschillende punten in een batchcultuur. Het gebruik van een master poortsjabloon maakt het mogelijk om de verhouding van cellen met één, twee of meerdere chromosomen te kwantificeren, wat bijvoorbeeld de mogelijkheid van deze representatieve microbe om zijn chromosomen sn

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere...

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.

Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Met behulp van flowcytometrie

Stroom cytometry in combinatie met visuele clustering biedt een easy-to-use en snelle methode voor het bestuderen van aquatische biofilms. Het kan worden gebruikt voor de karakterisering van de biofilm, de detectie van veranderingen in de structuur van de Gemeenschap van de biofilm, en detectie van abiotische deeltjes ingebed in de biofilm.

Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Baanbrekende krommen (BBC's) zijn efficiënte instrumenten om het transport van bacteriën in poreuze media te bestuderen. Hier introduceren we tools op basis van vloeibare apparaten in combinatie met microscopie en flow cytometrische tellingen om BTC's te verkrijgen.

Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Dit protocol beschrijft een kwantitatieve benadering om microbiële autoaggregatie te meten met behulp van beeldvormende flowcytometrie.

Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen

Dit protocol biedt een uitgebreide richtlijn voor het opzetten en kwantitatief monitoren van co-culturen, inclusief fotoautotrofe suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gisten.

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

We bieden een techniek om intact boomfloëem te behouden en het voor te bereiden op observatie. We creëren een apparaat genaamd een floëemsandwich dat het mogelijk maakt om geleedpotigen, microben en andere organismen die in floëemweefsels leven te introduceren en observeren.

Techniek voor het bestuderen van geleedpotigen en microbiële gemeenschappen binnen Tree Tissues

Wilde dieren worden vaak geparasiteerd door een breed scala aan wormen.  De vier belangrijkste soorten wormen zijn “rondwormen” (nematoden), “stekelhoofdige wormen” (acanthocephala), “suikers (trematoden), en “lintwormen” (cestoden).  Hier beschrijven we hoe wormen worden verzameld van een gewerveld dier en hoe ze worden bewaard en taxonomisch...

Helminth-verzameling en -identificatie uit wilde dieren

Leer flowcytometrie-workflows voor microbiome-dynamiek van zuivere culturen tot natuurlijke gemeenschappen. Deze methode maakt snelle, kosteneffectieve monitoring van microbiële ecologie en biotechnologie mogelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Meer video's verkennen