Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen over hoe intercellulaire communicatie tussen meerdere menselijke neurale celtypen bijdraagt aan de vorming en functie van synaptische circuits. Deze techniek genereert snel en systematisch driedimensionale cocultuursferen van functioneel volwassen astrocyten en neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Deze kunnen worden gebruikt voor rigoureus experimenteel onderzoek.

De reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van dit protocol is een gedefinieerde alternatief voor de opkomende organoïdtechnologieën. Deze beloven nieuwe medicijnontwikkeling en cel-inenttherapie om neuroregeneratie na verwonding of ziekte te bevorderen. Begin met het plaatsen van clusters van HPSC's in twee milliliter HPSC-medium met de rho-kinase-remmer Y-27632 in elke put van een ECM-gecoate zes-putsplaat.

Bewaar de stamcellen tot ze ongeveer 50%confluent zijn, vervolgens verander het medium naar zenuwmedium dat SB431542 en DMH1 bevat om neurale inductie te bevorderen. Wanneer de cellen ongeveer 95%confluent zijn, verdeel elke put een-op-zes in nieuwe ECM-gecoate putten. Op dag 14 dissocieert u de cellen met losmaak oplossing en brengt u de inhoud van elke put over naar een niet-gecoate T25 fles met medium dat Y-27632 bevat om de vorming van aggregaten te bevorderen.

Om astrocyten-progenitors en astrocyten in spontaan gevormde 3D-aggregaten te genereren, schakelt u over naar zenuwmedium dat EGF en FGF2 bevat en voert u elke drie tot vier dagen totdat de identiteit van astrocyten op vier tot zes maanden is bevestigd. Standaard produceert dit protocol dorsale corticale astrocyten. Astrocyten-subtypen kunnen echter regionaal worden gespecificeerd door de toevoeging van patroonvormende morphogenes, indien gewenst.

Een keer per week, wanneer donkere centra verschijnen, verzamelt u de sferen door centrifugatie, en dissocieert u vervolgens voorzichtig de H-astro-aggregaten met losmaak oplossing. Plaats alleen die sferen opnieuw die niet spontaan hechten om het doorvoeren van niet-CNS en niet-neurale cellen te voorkomen. Na vier tot zes maanden van expansie, bevestigt u de celidentiteit in ofwel vries- en cryo-conserveringsmedium volgens de instructies van de fabrikant, of gebruikt u deze onmiddellijk voor experimenten.

Voor de generatie van niet-transgene neuronale progenitoren in neuronen, of H-neuronen, zaait u dag-14 HPSC-afgeleide neurale progenitoren in ECM-gecoate zes-putsplaten met twee milliliter zenuwmedium en Y-27632 per put. Als u werkt met doxycycline-induceerbare iNeurons, voegt u zenuwmedium met doxycycline toe wanneer de cellen ongeveer 35%confluent zijn om differentiatie te induceren en genexpressie te activeren. Na twee dagen, voer u transgene en niet-transgene lijnen met twee milliliter zenuwmedium per put per dag.

Ga door tot de cellen klaar zijn om te tillen bij 70%confluency. Voor coculturen, dissocieert u eerst voorzichtig H-astro's van 3D-aggregaten met losmaak oplossing. Ga vervolgens verder met het dissociëren van H-neuronen, of iNeurons, van een 2D-monolayer.

Verwijder eerst het medium van de zes-putsplaat en voeg 500 microliter losmaak oplossing toe aan elke put met monolaagculturen. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, voegt u voorzichtig twee tot drie milliliter DMEM-F12-medium toe om de gehechte cellen te verwijderen.

Verzamel vervolgens de cellen in medium in een 15-milliliter kegelbuis en centrifugeer gedurende één minuut bij 300 keer G. Aspibeer het supernatant, voeg een milliliter vers medium toe en pipet op en neer voorzichtig met een 1.000-microliter micropipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Tel elk celtype afzonderlijk met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.

Voeg de gewenste verhouding van gedissocieerde H-astro's en H-neuronen, of iNeurons, toe in een totaal volume van twee milliliter aan elke put van een microplaat. Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten bij 100 keer G en plaats deze terug in de incubator gedurende twee dagen. Na één dag zouden dicht gepakte microsferen zich in de plaat moeten hebben gevormd.

Gebruik een 1.000-microliter micropipet om voorzichtig sferen uit de microputjes te verwijderen. Oefen lichte druk uit op de bodem van de microputjes met medium om eventueel aanhechtende sferen te verwijderen. Nadat u alle sferen in een 15-milliliter kegelbuis hebt verzameld, laat u ze bezinken.

Was vervolgens de sferen door eerst het oude medium te aspireren en vervolgens ten minste twee milliliter vers medium toe te voegen. Voeg de sferen toe aan een spinnerfles met 50 tot 60 milliliter medium. Plaats de fles in de incubator op een magnetische roerplaat ingesteld op 60 RPM.

Een minimum van drie weken in cultuur is nodig voor synapsvorming. Begin met het coaten van het oppervlak van elk multi-elektrodenarray, of MEA, met één milliliter polyornithine om het oppervlak hydrofiel te maken en incubeer gedurende minimaal vier uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verwijdert u de polyornithine en wast u het oppervlak van elke MEA met gedeïoniseerd water.

Voeg vervolgens één milliliter extracellulair matrix toe en brengt u het terug naar de incubator voor minimaal vier uur. Wanneer klaar, verwijdert u de extracellulaire matrix en brengt u de sferen in 1,5 milliliter medium aan op het MEA-oppervlak, waarbij u ervoor zorgt dat de sferen bovenop de elektrodenarray zijn gepositioneerd. Laat twee dagen aanhechten.

Om de elektrische activiteit van neurale sferen te meten, plaatst u de MEA op een temperatuur-gecontroleerde hoofdfase. Gebruik een vijf-Hertz hoogdoorlaatfilter en een 200-Hertz laagdoorlaatfilter en een piekdrempel van vijf keer standaarddeviatie om spontane elektrische activiteit op te nemen. Sla ruwe gegevens op, inclusief piekfrequentie en amplitude voor statistische analyse.

Neural-celtype-beperkte eiwitmarkers, zoals MAP2 voor neuronen en GFAP voor astrocyten, tonen visueel de gelijkmatig vers