Name: Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer een reproduceerbare methode voor 3D cocultures van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neuronen en astrocyten. Dit protocol meet synaptische circuitactiviteit met multielectrode arrays en immunoanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Dr. Erik Ullian (UCSF) voor intellectuele input over het ontwerp van deze procedures, Dr. Michael Ward (NIH) voor technisch advies over iNeuron differentiatie, en Saba Barlas voor voorlopige beeldanalyse.

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol beschrijven we een systematische methode voor de productie van 3D bollen van neurale cocultures. De bollen zijn samengesteld uit astrocyten en neuronen, die onafhankelijk zijn afgeleid van hPSCs. Hoewel nog niet de focus van dit protocol, kan de generatie van pure populaties van astrocyten van hPSCs28 is een cruciale stap en technisch uitdagende indien dat gebeurt zonder voorafgaande ervaring. Deze eerste stap in de generatie van deze synaptic micro schakelingen moet worden uitgevo...

Astrocyten zijn een zeer overvloedige gliale celtype binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) met een scala aan functionele verantwoordelijkheden buiten structurele steun. Door middel van de secretie van oplosbare synaptogenic factoren en componenten van de extracellulaire matrix (ECM), astrocyten steun bij de oprichting en clustering van volwassen synapsen tijdens ontwikkeling1. Ze ook spelen een cruciale rol in het behoud van de gezondheid en de plasticiteit van synapsen t/m extracellulaire signalering2,3,4,5, en bijdragen aan de stabiliteit op lange termijn van homeostatische omgevingen door het reguleren van extracellulaire kalium en glutamaat, evenals de secretie van energie substraten en ATP6,7,8. Ten slotte, ze kunnen bijdragen tot de transmissie door het beïnvloeden van extrasynaptic stromingen9, en niet indirect invloed kunnen uitoefenen op de activiteit via andere celtypes zoals het bevorderen van myelinisering10. Belangrijker, omdat abnormaliteit of disfunctie van astrocyten tot veel neurologische syndromen en volwassen Neuropathologie leiden kan, is er een duidelijke behoefte aan het opnemen van astrocyten naast neuronen binnen gemanipuleerde neurale netwerken in volgorde voor een betere model van het endogene hersenen milieu. Een wezenlijk kenmerk van astrocyten is hun vermogen om de dynamische interacties vorm met neuronale synapsen1,11,12. Bij het ontbreken van glia vormen de neuronen een beperkt aantal synapsen, die in het algemeen ook functionele looptijd13 ontbreekt.
Menselijke astrocyten morfologische, transcriptionele en functionele kenmerken vertonen die — zoals toegenomen omvang en complexiteit van vertakkende, evenals soortspecifieke genen-dat zijn niet gerecapituleerd in knaagdieren12,14, 15. Dientengevolge, studies met behulp van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide neurale cellen hebben worden geaccepteerd als een middel van CNS-gerelateerde ziekten in vitro onderzoeken terwijl het ontwikkelen van nieuwe therapieën, letsel modellen en cultuur paradigma's16 ,17. Bovendien toestaan hPSCs de studie van menselijke synapse formatie en functioneren zonder de behoefte aan primaire weefsel18,19.
Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen van de menselijke hersenen. Er is behoefte aan een geschikt platform om te recapituleren zijn synaptic netwerken met hifi en reproduceerbaarheid. Onlangs, belang is gebleken bij de productie van 3D cultuur systemen (algemeen bekend als 'organoids,' 'spheroïden', of 'mini hersenen')20 tot complexe driedimensionale (3D) model structuren op mobiele en macro niveau. 3D cultuur systemen behouden ECM en cel-cel interacties die normaal afwezig of beperkt tijdens typische 2D coculture paradigma's21,22. Een overvloed aan technieken bestaan voor het kweken van 3D neurale spheroïden23,24,25; echter veel vereisen lange cultuur perioden (maanden tot jaren) voor spontane ontwikkeling en behoud van de laag, met de gebruiker vertonen zeer weinig controle over de output.
Hier, we illustreren een systematische methode om snel en consequent bioengineer Neurale interacties tussen meerdere celtypen (vooraf gedifferentieerde neuronen en astrocyten) afgeleid van hPSCs door het monteren van cellen in het gebied cocultures ('Asteroïden')26 die recapituleren mens-specifieke morfologische complexiteit van 3D. Gelijkmatig verspreide neurale subtypen dat volwassen eigenschappen overneemt na verloop van tijd en kunnen worden vertoond of vehiculumcontrolegroep in een high-throughput manier genereert deze high-density neurale systeem. We laten zien voor de eerste keer dat menselijke astrocyten synaptic netwerkactiviteit burst in deze 3D cocultures induceren. Dit protocol is bovendien gemakkelijk aan te passen voor het genereren van bollen van verschillende maten, te gebruiken van cellen die zijn opgegeven met verschillende regionale identiteiten van de CNS, en te bestuderen van interacties van meerdere andere celtypes zoals gewenst.

<table><tbody><tr><td>6 well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Detachment solution</td></tr><tr><td>AggreWell plate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>Prevent cell adhesion to microwell plates</td></tr><tr><td>Anti/anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>BrainPhys neuronal medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>Neurophysiological basal medium alternative</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>Cryopreservation medium with 10% DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>With GlutaMAX supplement</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 &mu;M</td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td></tr><tr><td>Doxycycline Hydrochloride (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Working concentration: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Working concentration: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fluoromount-G mounting solution</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer</td></tr><tr><td>Hemacytometer or automatic cell counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>Working concentration: 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Magnetic plate</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel membrane matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>ECM coating solution. Working concentration: 80 &mu;g/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.</td></tr><tr><td>MEA 2100 System</td><td>Multichannel Systems</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>Mounting solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Tissue embedding solution for cryosectioning</td></tr><tr><td>Pap Pen (Aqua Hold)</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Working concentration: 0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Rectangular glass cover slips</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>Detachment and passaging reagent</td></tr><tr><td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Working concentration: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>Working concentration: 2 &mu;M</td></tr><tr><td>Spinner flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>Working concentration: 20% or 30% in PBS</td></tr><tr><td>T25 Culture Flask</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Vented caps</td></tr><tr><td>T75 Culture Flask</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>Vented caps</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Detergent. Working concentration: 1%</td></tr><tr><td>TeSR-E8 basal medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Human pluripotent stem cell (hPSC) medium</td></tr><tr><td>TeSR-E8 supplements</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Supplements for human pluripotent stem cell medium</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Primary antibody; astrocytes perisynaptic</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Primary antibody; astrocytes</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Primary antibody; astrocytes</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Gift from Dr. Jeffrey Rothstein</td><td>n/a</td><td>Primary antibody; astrocytes</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Synaptic Systems</td><td>188 004</td><td>Primary antibody; neurons</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Primary antibody; neurons, post-synaptic</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Primary antibody; astrocytes</td></tr><tr><td>Synapsin 1</td><td>Synaptic Systems</td><td>106 103</td><td>Primary antibody; neurons, pre-synaptic</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta;3-tubulin (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Primary antibody; neurons</td></tr></tbody></table>

synaptische microcircuit modeling met 3d cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen voor het bestuderen van het menselijk brein. Een opkomende technologie om dit probleem te verhelpen is het gebruik van drie dimensionale (3D) neurale celculturen, betiteld als 'organoids' of 'spheroïden', voor de langetermijnbewaring van intercellulaire interacties met inbegrip van extracellulaire celadhesie-moleculen. Echter, deze cultuur-systemen zijn tijdrovend en niet systematisch gegenereerde. Hier, we detail een methode om snel en consistent produceren 3D cocultures van neuronen en astrocyten van menselijke pluripotente stamcellen. Eerste, vooraf gedifferentieerde astrocyten zijn neuronale voorlopercellen losgekoppeld en geteld. Vervolgens cellen worden gecombineerd in de bol-vormende gerechten met een Rho-Kinase inhibitor en op specifieke verhoudingen tot bollen van reproduceerbare grootte. Na verscheidene weken van cultuur als drijvende bollen, zijn cocultures ('Asteroïden') ten slotte gesegmenteerd voor immunokleuring of verguld op multielectrode arrays synaptic dichtheid en de sterkte te meten. In het algemeen verwacht wordt dat dit protocol 3D neurale bollen die volwassen cel-type beperkt markeringen weergeven, functionele synapsen vormen en spontane synaptic netwerkactiviteit barsten vertonen zal opleveren. Samen, toelaat dit systeem drug screening en onderzoek naar mechanismen van ziekte in een geschikter model ten opzichte van enkelgelaagde culturen.

Wanneer goed uitgevoerd, zal dit protocol omschreven populaties van functionele cocultures van astrocyten28,33,34 en neuronen35 gegenereerd op basis van hPSCs (figuur 1A-1C), produceren als gedetailleerde eerder26 en hier beschreven in stap 2.1-2.2. Deze stapsgewijze procedure, met het gebruik van micro...

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen over hoe intercellulaire communicatie tussen meerdere menselijke neurale celtypen bijdraagt aan de vorming en functie van synaptische circuits. Deze techniek genereert snel en systematisch driedimensionale cocultuursferen van functioneel volwassen astrocyten en neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Deze kunnen worden gebruikt voor rigoureus experimenteel onderzoek.De reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van dit protocol is een gedefinieerde alternatief voor de opkomende organoïdtechnologieën. Deze beloven nieuwe medicijnontwikkeling en cel-inenttherapie om neuroregeneratie na verwonding of ziekte te bevorderen. Begin met het plaatsen van clusters van HPSC's in twee milliliter HPSC-medium met de rho-kinase-remmer Y-27632 in elke put van een ECM-gecoate zes-putsplaat.Bewaar de stamcellen tot ze ongeveer 50%confluent zijn, vervolgens verander het medium naar zenuwmedium dat SB431542 en DMH1 bevat om neurale inductie te bevorderen. Wanneer de cellen ongeveer 95%confluent zijn, verdeel elke put een-op-zes in nieuwe ECM-gecoate putten. Op dag 14 dissocieert u de cellen met losmaak opl

synaptic-microcircuit-modeling-with-3d-cocultures-astrocytes-neurons

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates the development of a 3D neuronal culture coupled to a planar microelectrode array with hippocampal neurons. The isolated neurons form a 2D network on the microelectrode array's active area and adhere to glass microbeads in a multi-well plate with a membrane insert. Upon transferring these neuron-coated microbeads to the electrode, they organize into an interconnected 3D neural network.

Building Three-Dimensional Neuronal Networks Coupled to Micro-Electrode Arrays

The video demonstrates a method to generate astrospheres from progenitors from human pluripotent stem cells. It involves the growth and proliferation of stem cells with nutrient media containing growth factors and kinase inhibitors. These cells then aggregate and differentiate into astrocytes, forming astrospheres.

Generating and Maintaining Astrospheres Using Human Pluripotent Stem Cells

This video demonstrates a procedure for co-culturing the astrocytes and neurons to form 3D spheres. These 3D spheres provide a distinct platform for examining synapse formation and neural network integration, thereby serving as a potential model for research in developmental neuroscience, neurodegenerative diseases, and neuropharmacological interventions.

Generating 3D Co-culture Spheres of Astrocytes and Neurons to Induce Synapse Formation

This video demonstrates the procedure of using the multielectrode array (MEA) to measure synaptic physiology in 3D coculture spheres. This method allows to understand the neural network dynamics and synaptic network burst activity within the 3D spheres.

Utilizing Multielectrode Arrays to Measure Synaptic Physiology in 3D Coculture Spheres

This video demonstrates establishing a neuron-astrocyte co-culture for recording neuronal network activity. Upon establishing the co-culture of motor neurons and astrocytes on a multi-electrode array (MEA) plate, the synchronous rhythmic electrical activity of the neuronal network was recorded extracellularly using the MEA.

Recording Electrophysiological Activity of the Neuronal Network in a Neuron-Astrocyte Co-culture

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Hier presenteren we een protocol om 3D-gebioprinte coculturen van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten te produceren. Dit cocultuurmodel, gegenereerd in een hydrogelsteiger in formaten met 96 of 384 putjes, toont een hoge levensvatbaarheid na het printen en neurietuitgroei binnen 7 dagen en toont de expressie van rijpheidsmarkers voor beide celtypen.

Driedimensionale bioprinting van menselijke iPSC-afgeleide neuron-astrocyt coculturen voor screeningstoepassingen

Leer een reproduceerbare methode voor 3D cocultures van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neuronen en astrocyten. Dit protocol meet synaptische circuitactiviteit met multielectrode arrays en immunoanalyse.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen