Name: Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Leer een micropipetmethode om gecontroleerde kracht op de kern van levende cellen toe te passen. Deze techniek onderzoekt mechanische eigenschappen van de kern in verschillende adherente celtypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH R01 EB014869.

1. voorbereiding cellen van Imaging
Opmerking: De directe werking sonde (DFP) kan worden gebruikt voor elk celtype aanhangend. Hier, worden NIH 3T3 muis fibroblasten gebruikt als de cellijn model voor dit protocol.
<ol><li>Cultuur NIH 3T3 fibroblast cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% donor runderserum en 1% penicilline-streptomycine op een 35-mm glazen bodem schotel tot gewenste confluentie. Houden cellen bij 37 ° C en 5% CO2.<ol>
<li>Zorg ervoor dat alle gerechten van de onderkant van de 35-mm glas met 5 µg/mL fibronectine (of soortgelijke ECM eiwit), vóór het zaaien van NIH 3T3 cellen voor imaging jas. Opmerking: De cellen moeten worden volledig verspreiden en aanhangend op de schotel voor het experiment. Er zijn niet alle beperkingen op het gebied van confluentie DFP de methode werken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, de cellen tweemaal met PBS gevolgd door een enkel wassen met volledige groeimedium.</li>
	<li>Voeg 3 mL van volledige groeimedium aan de glazen bodem schotel.</li>
</ol>2. microscopie en beeldacquisitie
Opmerking: Een omgekeerde fluorescentie Microscoop (of equivalent) met micromanipulator op de zijarm, volgens de aanbevelingen van de fabrikant geïnstalleerd. De Microscoop moet ook worden uitgerust met een milieu kamer om de temperatuur bij 37 ° C, en 5% CO2 niveau te handhaven. Er is ook een micromanipulator en microinjector gekoppeld aan de Microscoop vereist. Een olie-immersie 40 x / 1.3 nb of 60 x / 1,49 NB (of gelijkwaardige doelstellingen) worden aanbevolen voor de experimenten. De Microscoop moet worden gemonteerd op een vibratie isolatie tafel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> Figuur 1 . Nucleaire vervorming en het concentreren van de Microscoop A. maximale nucleaire vervorming en ontspanning van nucleaire vervorming. Voor de berekening maximale nucleaire vervorming, waren de rug randen van de nucleaire vormen eerst viel samen om te corrigeren voor de vertaling van misvormde nucleus. De vorm van de kern op het moment van micropipet tip detachement was die op de aanvankelijke nucleaire shape worden bedekt voordat trekken. Het verschil in ruimte tussen de twee shapes werd gemeten als Δeen1. De maximale nucleaire vervorming werd gedefinieerd als ΔA1 gedeeld door de oorspronkelijke nucleair gebied. Ook een tweede parameter, ΔA2, kan worden gedefinieerd door te bedekken de eindtoestand steady nucleaire vorm na micropipet detachement op de oorspronkelijke nucleaire vorm. B. richten de cel in een vliegtuig en verplaats het brandvlak tot vliegtuig B te vinden de tip van micropipet. Tijdens imaging, werd de micropipet vertaald naar rechts (richting van oranje pijl). Dit cijfer is gewijzigd van Neelam et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol><li>Inschakelen van de microinjector per protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Met behulp van een onderdompeling olie druppelaar, toepassing een druppel van onderdompeling olie op de top van het objectief.</li>
	<li>Klem de schotel strak in de schotel-houder en de houder van de schotel op het podium te laden. Opmerking: De cellen moeten op 37 ° C en 5% CO2 gedurende het gehele experiment worden gehouden.</li>
	<li>Pas de hoogte van de doelstelling om de cellen in focus (vliegtuig A, figuur 1B).</li>
	<li>Verplaats het stadium van de Microscoop te vinden van een cel van belang.</li>
	<li>Draai de joystick op het micromanipulator om de pipet houder naar de bovenste positie. Laad de 0,5 µm diameter tip micropipet op de houder van de pipet.<ol>
<li>Om te voorkomen dat de cel adhesie aan de micropipet, vooraf behandelen de micropipet tip met 0,3 mg/mL PLL-g-PEG oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Testen op hechting door de micropipet aan de kern zonder enige zuigdruk aan te raken, en dan het vertalen van de micropipet uit de buurt van de kern. Het gebrek aan hechting kan worden onderscheiden van een compleet gebrek aan nucleaire vervorming en vertaling. Opmerking: Volg vervaardiging suggesties te openen van het pakket.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het objectieve brandvlak boven vlak A en de bovenkant van de cel naar vliegtuig B verhogen door de fijne controle aan te passen (figuur 1B, zie stap 2.4).</li>
	<li>Stel de micromanipulator op grof controle. Breng langzaam het micropipet tot vliegtuig B door te kijken voor het silhouet van de micropipet, totdat de micropipet volledig in focus komt.</li>
	<li>Zodra de micropipet tip in focus is, stel de micromanipulator op fijne controle.</li>
	<li>De doelstelling van het equatoriale vlak van de cel (vliegtuig A, figuur 1B) lager en lager van de micropipet tot ongeveer 15 µm boven vlak A (figuur 1B, onderbroken micropipet).</li>
	<li>De compensatie druk (Pc) instellen op de microinjector aan de gewenste druk; Wacht enkele seconden voor de druk om te stabiliseren. Opmerking: De optimale druk instelpunt hangt zowel celtype en de specifieke doelstellingen van het experiment. Voor de meeste gevallen zou 300 hPa een goed uitgangspunt.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de micropipet niet met behulp van de Clean -instelling op het paneel van micromanipulator en controleren om ervoor te zorgen dat er luchtbellen ontstaan uit de micropipet tip is verstopt.</li>
	<li>Breng de tip in de cel door de micropipet geleidelijk te verlagen tot de tip is de nucleaire oppervlak licht aanraken. Opmerking: Wanneer de micropipet te verlagen, het silhouet van de micropipet tip zal duidelijk worden als het komt in focus. Voordat de micropipet de kern raakt, het verhogen van de objectieve focus en uitlijnen van de micropipet tip bij nucleus (dezelfde x-y-coördinaat, hogere z-plane). Terugkeer van de focus terug naar het equatoriale vlak van de kern (vliegtuig A, figuur 1B) en geleidelijk lager de micropipet tip.</li>
	<li>Maak een afdichting tussen het uiteinde van de micropipet en het kernmembraan door los te koppelen van de druk-levering-buis uit het systeem van microinjection, waardoor het openen van het uiteinde van de buis van de micropipet aan de sfeer. Deze stap maakt een negatieve druk gelijk is aan Pc op het nucleaire oppervlak.</li>
	<li>Verwerven van beelden met de microscopen afbeelding collectie software. Een avi-acquisitie (video) of nd-acquisitie (afbeeldingen) in de afbeelding collectie software instellen. Opmerking: Voor elke imaging software verwerven, real-time video imaging of instellen time-lapse afbeelding overnames met een korte tijdsinterval.</li>
	<li>Schakelen om de overeenkomstige TL imaging kanaal (dat wil zeggen, GFP, RFP, etc.) en imaging beginnen.</li>
	<li>Vertalen van het micropipet uiteinde van het lichaam van de cel (aan de rechterkant, figuur 1B) totdat de kern is losgekoppeld van de micropipet. Opmerking: Trek de tip langs de positieve x-richting (naar rechts in het gezichtsveld). Het trekken tarief kan worden geprogrammeerd en gecontroleerd door de computer of de joystick handmatig kan worden verplaatst. Hebben we niet gevonden geen correlatie tussen het trekken tarief en nucleaire vervorming15 suggereren een voornamelijk elastische reactie te dwingen.</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
<ol><li>Beeld analyses uitvoeren met het enige fundamentele beeld-verwerkende software beschikbaar. De omvang van de nucleaire vervorming kan worden gekwantificeerd door de lengte stam (Ɛ) of de stam van de ruimte (figuur 1A). Kwantificeren van lengte stam met behulp van vergelijking 1, waar L en L0 vertegenwoordigen de lengtes van de kern op maximale vervorming en de aanvangspositie, respectievelijk. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(Vergelijking 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het meten van de mechanische integratie van de kern met het cytoskelet is een uitdaging voor de meest actuele methoden, zoals micropipet aspiratie16, omdat ze beide geïsoleerde kernen (waar de kern is van het cytoskelet ontkoppelde) vereisen of kernen in zwevende cellen (waar de extracellulaire krachten, zoals tractie krachten, zijn afwezig is). Kracht is vereffend met de nucleus door biaxial stam toe te passen op cellen aanhanger naar een membraan17,<sup class="...

Ziektebeelden zoals kanker impliceren wijzigingen aan nucleaire vorm en structuur1,2, die over het algemeen vergezeld gaan van een 'verzachtende' van de kern3,4. Nucleaire weerstand aan mechanische vervorming in het algemeen gekenmerkt door een kracht naar geïsoleerde kernen5.
De kern in cellen is het moleculair verbonden met het cytoskelet door de Linker van Nucleoskeleton en het cytoskelet (LINC) complexe6,,7,,8,9. Dientengevolge, is de kern mechanisch geïntegreerd met het cytoskelet en, door middel van cel-substraat verklevingen, de extracellulaire matrix. Mechanisch sonderen de kern binnen Adherente cellen kan inzicht geven in deze mechanische integratie. Methoden voor het manipuleren van de kernen in levende cellen omvatten micropipet aspiratie10,11, en atomic force microscopie12,13,14. We onlangs beschreven een directe kracht-sonde (DFP) toepassing van mechanische krachten direct bij de kern in een levende aanhangend cel15.
We schetsen hier, de procedure voor het gebruik van een systeem van microinjection dat is vaak beschikbaar in microscopie faciliteiten toe te passen een bekende, nano-schaal mechanische kracht direct op de kern in een aanhangend cel. Een femtotip (0,5 µm diameter micropipet tip) is gemonteerd en aangesloten op het systeem van microinjection door een buis. De tip, geplaatst in een hoek van 45° ten opzichte van het oppervlak van de cultuur schotel, is verlaagd tot grenzend aan het nucleaire oppervlak. De buis is vervolgens verbroken en opengesteld voor de sfeer, die wordt gemaakt van een negatieve zuigdruk op het nucleaire oppervlak en bezegelt het uiteinde van de micropipet tegen de nucleaire oppervlak. Door middel van vertaling van de micropipet tip, is de kern vervormd en uiteindelijk (afhankelijk van de omvang van de uitgeoefende kracht), los van de micropipet. Dit detachement treedt op wanneer herstel (weerstand) krachten, uitgeoefend door de celkern en cel, gelijk de zuigkracht toegepast door de micropipet. Analyse kan worden uitgevoerd door het meten van de verplaatsing van de kern, de lengte stam (vergelijking 1) of de stam van de ruimte (figuur 1A).

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>uit productie genomen, huidig equivalent model: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Huidig model FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor olie-immersie 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF olie-immersie 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donor Runder Serum (DBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 serum</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modificatie van Eagle's (DMEM)</td><td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 medium</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 medium supplement</td></tr><tr><td>Immersieolie Type LDF Niet-fluorescerend</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>Immersieolie voor objectieflens&nbsp;</td></tr></tbody></table>

een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

De mechanische eigenschappen van de kern bepalen haar reactie op mechanische krachten gegenereerd in cellen. Omdat de kern moleculair continu met het cytoskelet is, zijn methoden nodig om de sonde van het mechanische gedrag in Adherente cellen. Hier bespreken we de directe werking sonde (DFP) als een instrument om het geweld zich rechtstreeks wenden tot de kern in een levende aanhangend cel. We hechten een smalle micropipet aan de nucleaire oppervlak afzuigen. De micropipet is vertaald uit de buurt van de kern, waardoor de kern te vervormen en te vertalen. Wanneer het herstel kracht gelijk aan de zuigkracht is, de kern wordt verbroken en elastisch ontspant. Omdat de zuigdruk precies bekend is, is de kracht op het nucleaire oppervlak bekend. Deze methode is gebleken dat de nano-schaal krachten volstaan om te vervormen en vertalen van de kern in Adherente cellen, en geïdentificeerd cytoskeletal elementen waarmee de kern krachten weerstaan. De DFP kan worden gebruikt voor het ontleden van de bijdragen van cellulaire en nucleaire componenten nucleaire mechanische eigenschappen in levende cellen.

Figuur 2A toont het dwingen van een NIH 3T3 muis fibroblast nucleus. Zoals de tip micropipet is vertaald naar het recht, de kern vervormt en uiteindelijk het micropipet uiteinde losgekoppeld. De stam van de lengte van de kern wordt gezien om te verhogen met toenemende zuigkracht (figuur 2B). De voorste rand van de kern (micropipet trekken van de rand) vormt een nucleaire uitsteeksel en de afvallende flank wordt verplaatst van de ...

In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van nucleaire mechanica. Bijvoorbeeld, wat is de kracht die nodig is om de kern in een cel te vervormen? Wat zijn de bijdragen van cellulaire en nucleaire componenten aan de weerstand van de kern tegen vervorming?Of varieert de nucleaire koppeling met cellulaire structuren met celtype? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om een sondeerkracht toe te passen om het integrerende nucleair-cytoskelet in een levende adherante cel te vervormen. Hoewel deze methode is gebruikt om inzicht te geven in de nucleaire mechanische eigenschappen in NIH-3T3 cellen, kan het ook worden toegepast op elk adherant celtype, zoals het sonderen van nucleaire mechanische eigenschappen in Hutchinson-Gilford progeria cellen.Om deze procedure te beginnen, bedek een glasbodemschaal van 35 millimeter met 5 microgram per milliliter fibronectine. Kweek vervolgens de NIH 3T3 fibroblastcellen in DMEM aangevuld met 10% donorrunderserum en 1% Penicilline-Streptomycine op de beklede schaal bij 37 graden Celsius tot de gewenste confluency. Direct voorafgaand aan het experiment, was de cellen twee keer met PBS, gevolgd door een enkele was met compleet groeimedium.Voeg daarna drie milliliter compleet groeimedium toe aan een glasbodemschaal. Schakel in deze procedure de microinjector in. Gebruik een immmersie-oliedruppelaar om een druppel immmersie-olie op het objectief aan te brengen.Klem vervolgens de schaal stevig vast aan de schotelhouder en plaats de schotelhouder op de stage. Let erop dat de cellen gedurende het hele experiment op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide moeten worden gehouden. Pas vervolgens de hoogte van het objectief aan om de cellen scherp te stellen.Verplaats de microscoopstandaard om een cel van belang te vinden. Gebruik de micromanipulator om de pipethouder naar de hoogste positie te verplaatsen. Laad vervolgens de micropipet met een tip van 0,5 micrometer diameter op de pipethouder.Verhoog vervolgens het objectief-brandvlak boven vlak A en het bovenste deel van de cel naar vlak B door de fijne bediening aan te passen. Stel vervolgens de micromanipulator in op de grove bedieningspositie. Breng de micropipet langzaam naar vlak B door de silhouet van de micropipet te observeren tot de micropipet volledig scherp staat.Zodra de micropipettip scherp staat, stel de micromanipulator in op fijne bediening. Verlaag vervolgens het objectief naar het equatoriale vlak van de cel en verlaag de micropipet tot ongeveer 15 micrometer daarboven. Stel de compensatiedruk op de microinjector in op de gewenste druk.Wacht enkele seconden tot de druk is gestabiliseerd. Het is belangrijk om te controleren of de pipettip gebroken of verstopt is, anders zou de krachtmeting onnauwkeurig zijn. Zorg ervoor dat de micropipet niet verstopt is door de schone instelling op het micromanipulatorpaneel te gebruiken en zorg ervoor dat de luchtbellen uit de micropipettip komen.Breng vervolgens de micropipettip in de cel in totdat deze lichtjes de nucleaire oppervlakte raakt. Maak een afdichting tussen de micropipettip en het nucleaire membraan door de druktoevoerbuis los te koppelen van het micro-injectiesysteem, waardoor het uiteinde van de micropipet naar de atmosfeer wordt geopend. Deze stap creëert een negatieve druk gelijk aan de compensatiedruk op het nucleaire oppervlak.Open vervolgens de beeldverzamelsoftware. Stel een AVI-acquisitie in voor video of ND-acquisitie voor afbeeldingen in de beeldverzamelsoftware. Schakel vervolgens naar het overeenkomstige fluorescentiebeeldkanaal en begin met beeldvorming.Verplaats de micropipettip weg van het lichaam van de cel totdat de kern zich losmaakt van de micropipet. Deze figuur toont de vervorming van een NIH 3T3 muisfibroblastkern. Terwijl de micropipettip naar rechts beweegt, vervormt de kern en loskoppelt uiteindelijk van de micropipettip.De lengtespanning van de kern neemt toe met toenemende zuigkracht. De voorrand van de kern vormt een nucleaire uitstulping en de achterrand wordt van zijn oorspronkelijke positie verplaatst. De lengte van de uitstulping is veel groter dan de verplaatsing van de achterrand, wat wijst op een strakke integratie tussen de kern en het omringende cytoplasma.De tijdschalen zijn kort voor het ontspannen van de voorrand van de kern en de achterrand van de kern. Er werd een directe krachtsonde gebruikt om de bijdrage van intranucleaire en cytoskeletaal structuren aan de weerstand van de kern tegen vervorming te bepalen. Fluorescentiebeelden toonden de overlay van de kern voor en na onder de aangegeven omstandigheden.Hoewel er geen significante verschillen in nucleaire vervorming of translatie werden gevonden na F-actine-verstorende of microtubulus-verstorende behandelingen, resulteerde het verminderen van de menten-expressie door siRNA-gebaseerde knockdown in significant grotere nucleaire translatie en vervorming. Dit suggereert dat de menten-intermediate filamenten in fibroblasten het belangrijkste cytoskeletaal element zijn dat de kern hielp om lokale kracht te weerstaan. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gecontroleerde en bekende kracht op de kern in een levende adherante cel kunt toepassen.

a-direct-force-probe-for-measuring-mechanical-integration-between

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We presenteren twee onafhankelijke, microscoop-gebaseerde tools om de veroorzaakte nucleaire en cytoskelet vervormingen in enkele, levende hechtende cellen te meten in reactie op globale of lokale stam toepassing. Deze technieken worden gebruikt om de nucleaire stijfheid (dat wil zeggen, vervormbaarheid) te bepalen en om intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet sonde.

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

Er is onlangs een aantal FRET-gebaseerde krachtbiosensoren ontwikkeld, waardoor de proteïne-specifieke resolutie van intracellulaire kracht mogelijk is. In dit protocol laten we zien hoe een van deze sensoren, ontworpen voor de linker van het nucleoskelet-cytoskelet (LINC) complex-eiwit Nesprin-2G kan worden gebruikt om actomyosinekrachten op het nucleaire LINC-complex te meten.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van DNA-gebaseerde spanningsondes om de receptorkrachten in beeld te brengen die door immuuncellen worden toegepast. Deze aanpak kan receptorkrachten &gt;4,7pN in realtime in kaart brengen en krachten in de loop van de tijd integreren.

DNA-spanningsondes om de voorbijgaande piconewtonreceptorkrachten door immuuncellen in kaart te brengen

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Leer een micropipetmethode om gecontroleerde kracht op de kern van levende cellen toe te passen. Deze techniek onderzoekt mechanische eigenschappen van de kern in verschillende adherente celtypen.

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Meer video's verkennen