Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van nucleaire mechanica. Bijvoorbeeld, wat is de kracht die nodig is om de kern in een cel te vervormen? Wat zijn de bijdragen van cellulaire en nucleaire componenten aan de weerstand van de kern tegen vervorming?

Of varieert de nucleaire koppeling met cellulaire structuren met celtype? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om een sondeerkracht toe te passen om het integrerende nucleair-cytoskelet in een levende adherante cel te vervormen. Hoewel deze methode is gebruikt om inzicht te geven in de nucleaire mechanische eigenschappen in NIH-3T3 cellen, kan het ook worden toegepast op elk adherant celtype, zoals het sonderen van nucleaire mechanische eigenschappen in Hutchinson-Gilford progeria cellen.

Om deze procedure te beginnen, bedek een glasbodemschaal van 35 millimeter met 5 microgram per milliliter fibronectine. Kweek vervolgens de NIH 3T3 fibroblastcellen in DMEM aangevuld met 10% donorrunderserum en 1% Penicilline-Streptomycine op de beklede schaal bij 37 graden Celsius tot de gewenste confluency. Direct voorafgaand aan het experiment, was de cellen twee keer met PBS, gevolgd door een enkele was met compleet groeimedium.

Voeg daarna drie milliliter compleet groeimedium toe aan een glasbodemschaal. Schakel in deze procedure de microinjector in. Gebruik een immmersie-oliedruppelaar om een druppel immmersie-olie op het objectief aan te brengen.

Klem vervolgens de schaal stevig vast aan de schotelhouder en plaats de schotelhouder op de stage. Let erop dat de cellen gedurende het hele experiment op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide moeten worden gehouden. Pas vervolgens de hoogte van het objectief aan om de cellen scherp te stellen.

Verplaats de microscoopstandaard om een cel van belang te vinden. Gebruik de micromanipulator om de pipethouder naar de hoogste positie te verplaatsen. Laad vervolgens de micropipet met een tip van 0,5 micrometer diameter op de pipethouder.

Verhoog vervolgens het objectief-brandvlak boven vlak A en het bovenste deel van de cel naar vlak B door de fijne bediening aan te passen. Stel vervolgens de micromanipulator in op de grove bedieningspositie. Breng de micropipet langzaam naar vlak B door de silhouet van de micropipet te observeren tot de micropipet volledig scherp staat.

Zodra de micropipettip scherp staat, stel de micromanipulator in op fijne bediening. Verlaag vervolgens het objectief naar het equatoriale vlak van de cel en verlaag de micropipet tot ongeveer 15 micrometer daarboven. Stel de compensatiedruk op de microinjector in op de gewenste druk.

Wacht enkele seconden tot de druk is gestabiliseerd. Het is belangrijk om te controleren of de pipettip gebroken of verstopt is, anders zou de krachtmeting onnauwkeurig zijn. Zorg ervoor dat de micropipet niet verstopt is door de schone instelling op het micromanipulatorpaneel te gebruiken en zorg ervoor dat de luchtbellen uit de micropipettip komen.

Breng vervolgens de micropipettip in de cel in totdat deze lichtjes de nucleaire oppervlakte raakt. Maak een afdichting tussen de micropipettip en het nucleaire membraan door de druktoevoerbuis los te koppelen van het micro-injectiesysteem, waardoor het uiteinde van de micropipet naar de atmosfeer wordt geopend. Deze stap creëert een negatieve druk gelijk aan de compensatiedruk op het nucleaire oppervlak.

Open vervolgens de beeldverzamelsoftware. Stel een AVI-acquisitie in voor video of ND-acquisitie voor afbeeldingen in de beeldverzamelsoftware. Schakel vervolgens naar het overeenkomstige fluorescentiebeeldkanaal en begin met beeldvorming.

Verplaats de micropipettip weg van het lichaam van de cel totdat de kern zich losmaakt van de micropipet. Deze figuur toont de vervorming van een NIH 3T3 muisfibroblastkern. Terwijl de micropipettip naar rechts beweegt, vervormt de kern en loskoppelt uiteindelijk van de micropipettip.

De lengtespanning van de kern neemt toe met toenemende zuigkracht. De voorrand van de kern vormt een nucleaire uitstulping en de achterrand wordt van zijn oorspronkelijke positie verplaatst. De lengte van de uitstulping is veel groter dan de verplaatsing van de achterrand, wat wijst op een strakke integratie tussen de kern en het omringende cytoplasma.

De tijdschalen zijn kort voor het ontspannen van de voorrand van de kern en de achterrand van de kern. Er werd een directe krachtsonde gebruikt om de bijdrage van intranucleaire en cytoskeletaal structuren aan de weerstand van de kern tegen vervorming te bepalen. Fluorescentiebeelden toonden de overlay van de kern voor en na onder de aangegeven omstandigheden.

Hoewel er geen significante verschillen in nucleaire vervorming of translatie werden gevonden na F-actine-verstorende of microtubulus-verstorende behandelingen, resulteerde het verminderen van de menten-expressie door siRNA-gebaseerde knockdown in significant grotere nucleaire translatie en vervorming. Dit suggereert dat de menten-intermediate filamenten in fibroblasten het belangrijkste cytoskeletaal element zijn dat de kern hielp om lokale kracht te weerstaan. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gecontroleerde en bekende kracht op de kern in een levende adherante cel kunt toepassen.