Name: Niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-Engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer niet-destructieve monitoring van vaatremodellering en scaffoldafbraak in weefsel-geïnspireerde bloedvaten met optische coherentie tomografie. Deze methode biedt realtime beeldvorming voor langetermijncultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen erkennen van de wetenschap en de technologie Planning Project van de provincie Guangdong (2016B070701007) voor de ondersteuning van dit werk.

1. afbreekbaar PGA steiger op basis van weefsel-engineered vaartuigen cultuur
<ol><li>PGA steiger Fabrication<ol>
<li>Naai de PGA mazen (diameter van 19 mm en 1 mm dik) rond silicone slangen gesteriliseerd met ethyleenoxide (17 cm lengte, 5.0 mm diameter en 0,3 mm dik) met 5-0 hechtdraad.</li>
		<li>Naai de polytetrafluorethyleen (ePTFE, 1cm lengte) met 4-0 hechtdraad op elk uiteinde van PGA Maas en overlapt door 2 mm.</li>
		<li>Dompel PGA steigers met de hand in 1 mol/L NaOH voor 1 min te passen de ruimtelijke structuur van de Maas en geniet met weefselkweek rang water drie keer, gedurende 2 minuten elk. Voorzichtig pat droog het schavot met een papieren zakdoekje telkens. Vervolgens opdrogen steigers in een kap met een blower gedurende 1 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vergadering van bioreactor en de Y-junction voor OCT imaging<ol>
<li>Geniet van de zelf ontwikkelde glas cilindrische bioreactor (10 cm diameter en 11,7 cm in hoogte met vier lippen binnen en vier kant-armen buiten de reactor zoals afgebeeld in Figuur 1), PGA steigers, Siliconen slang (uitwendige diameter 5 mm, dikte 0,3 mm), biocompatibel buizen, connectoren, roer bar en apparatuur voor montage in een 95% ethanol tank voor 2 h.</li>
		<li>Trek PGA steiger door kant-wapens van de bioreactor verbonden aan één zijde voorzien van een connector, evenals een andere kant bij de Y-junction gebruikt voor het leveren van OCT guidewire. Een ander PGA steiger in de bioreactor monteren op dezelfde manier. Zie Figuur 1.</li>
		<li>Passen ePTFE aan bioreactor lippen door aanscherping met 4-0 hechtingen.</li>
		<li>Zet de bioreactor in de ethanol bak weer voor 1 h en overnachting in kap met blower op opdrogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaaien van HUASMCs en statische Bioreactor Conditioning<ol>
<li>Isoleren HUASMCs van menselijke navelstreng slagaders door standaard explant technieken.</li>
		<li>Uitbreiden en onderhouden van cellen in gladde spieren cel groeimedium samengesteld uit DMEM medium, 20% foetale runderserum, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL penicilline G, 50 µg Mo/mL proline, 20 µg Mo/mL alanine, 50 µg Mo/mL glycine, 1,5 µg/mL CuSO4, ascorbinezuur 50 µg Mo/mL , 10 ng/mL basis fibroblast groeifactor en 10 ng/mL bloedplaatjes afkomstige groeifactor.</li>
		<li>De HUASMCs van het zaad in een concentratie tussen 5 × 106 cellen/mL in het bovenstaande kweekmedium op de PGA steigers.</li>
		<li>Zet een roer bar (1,5 cm lengte) in de bioreactor. Plaats een vultrechter (diameter 5 mm, 15 cm lengte) en drie korte buis segmenten (diameter 5 mm, lengte 7 cm) voor gasuitwisseling via het silicone kurk deksel.</li>
		<li>Hechten PTFE 0,22 µm filters aan elke verandering luchtslang en één heparine GLB naar de vultrechter. Aanpassen van de roer-bar met een opzwepende snelheid van 13 rondes per minuut. Monteren het glas bioreactor, siliconen kurk deksel en PGA steiger in het systeem van de cultuur.</li>
		<li>Toestaan HUASMCs te houden voor 45 min door leunend de bioreactor elke 15 min met standaard, links en rechts. De poorten van de reactor en de gewrichten worden afgedicht met paraffine film.</li>
		<li>Sluit de Luo-gij pomp, PBS tas, de chauffeur met biocompatibel buizen als de perfusie-systeem. Open de drive te vullen de buizen met PBS.</li>
		<li>Plaats de algehele bioreactor in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C. Vul de cultuur kamer met 450 mL gestolde voedingsbodem HUASMCs.</li>
		<li>Druk op de stopknop en schakel de stroom van het apparaat rijden. Groeien de geplaatste steigers onder statische cultuur gedurende één week.</li>
		<li>Wijzigen van het kweekmedium elke 3-4 dagen door aspirating de helft van het oude medium via de vultrechter en het bijvullen van de reactor met een equivalente hoeveelheid verse kweekmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van het systeem van de perfusie van OCT imaging<ol>
<li>Pomp vloeistoffen in de zak van de PBS te circuleren door middel van biocompatibel buizen en terug naar de zak.</li>
		<li>Open de kracht van het stuurprogramma en reguleren pomp instelling met een frequentie van 60 slagen per minuut en output systolische druk van 120 mmHg. Aanpassen van de mechanische parameters volgens de behoeften van engineering vasculaire weefselkweek.</li>
		<li>Klik op uitvoeren om het systeem van de perfusie werken te maken. Bieden de bovenstaande vaste Pulsatiele stimulatie voor de vaartuigen voor 3 weken door het iteratief Drukbehandeling biocompatibel buizen10,12 na 1 week van statische cultuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. uitvoeren van optische beeldvorming met OCT
<ol><li>Gebruik een lichtbron om de axiale resolutie van 10-20µm en de diepte van 1-2 mm ter identificatie van de structuur van de TEBV op basis van de frequentie-domein OCT intravasculaire imaging systeem9.</li>
	<li>Zet de schakelaar en open de afbeelding capture software.</li>
	<li>De vezel optische beeldvorming katheter verbinden met de drive-motor en optische controller (DOC) met katheter automatische retraite functie.</li>
	<li>Instellen van de parameters van de beeldsnelheid van de verwerving tot 10 beelden per seconde met een snelheid van de automatische pullback van 10 mm/s.</li>
	<li>Bevestig imaging katheter naar Y-kruising via heparine cap met een naald 18G.</li>
	<li>Plaatsen van de katheter in de silicone buis en identificeren van de hechtdraad krapte van PGA Maas alvorens PGA steiger op de bioreactor te laden.</li>
	<li>Plaats het uiteinde van de katheter op de regio van belang. Pas de pullback apparaat en het selectievakje voor de beeld kwaliteit8.</li>
	<li>Verwerven van beelden op 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 dagen in cultuur voor elke afzonderlijke TEBV en opeenvolgend opslaan met real-time observatie van de microstructuur van de TEBV, met inbegrip van bovengrondse morfologie, de interne structuur en de samenstelling.</li>
	<li>Herhaal de meting voor 3 keer om betrouwbare meting van gemodificeerde schepen telkens. Vastleggen van een reeks beelden in de gehele testen met behulp van de image capture software.</li>
</ol>3. beeldvorming analyse
<ol><li>Gebruik de software van de analyse van de afbeelding voor het meten van de wanddikte van de TEBV. Selecteer de afbeelding te analyseren. Klik op de tracking tool om te identificeren van de binnenzijde van de TEBV door de software automatisch en handmatig schets de buitenzijde. Een diagram van dikte wordt weergegeven op het scherm.</li>
	<li>Herhaal de meting voor 5 keer om betrouwbare meting van de constructies. De OCT-analyse werd uitgevoerd door twee onafhankelijke onderzoekers verblind tot de verkregen informatie.</li>
</ol>4. de oogst van TEBV en weefsel verwerking
<ol><li>Open het silicone kurk deksel geplaatst over de bioreactor wanneer de cultuur is voltooid en gooi het kweekmedium. EPTFE van bioreactor lippen los en snijd de silicone tubes van de buitenste zijde van de ePTFE met een schaar. Oogst TEBVs uit de bioreactor en snijd in secties voor het scannen van elektronenmicroscopie onderzoek.</li>
	<li>Neem de rest van de TEBVs en snijd in 4 µm dik secties. Trek de ondersteunende Siliconen slang en herstellen van secties met 4% paraformaldehyde. Het uitvoeren van routinematige histologische kleuring van Masson van trichrome en Sirius rode te onderzoeken van de morfologie van collageen en PGA10,13,14.</li>
	<li>Om te beoordelen PGA inhoud en collageen component, observeren histologische monsters met Sirius rode kleuring door een gepolariseerde Microscoop. PGA overblijfselen zijn duidelijk afgebakend door middel van dubbele breking en het restant gebied kan worden gekwantificeerd op basis van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede10.</li>
</ol>

<ol><li>Chan-Park, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
<li>Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2935622/">Image-guided tissue engineering.</a> Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+methodologies+for+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+%26+Technique%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering.</a> Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).</li>
<li>Chang, W. G., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+discourse+on+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A short discourse on vascular tissue engineering.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).</li>
<li>Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+challenges+in+biomaterials+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering.</a> Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).</li>
<li>Rice, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li>
<li>Niklason, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+engineering+collagenous+tissues+integrating+bioreactors%2C+intravital+imaging%2C+and+biomechanical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).</li>
<li>Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+OCT+in+the+Engineering+of+Tissue+Constructs%3A+A+Potentially+Powerful+Tool+for+Assessing+Optimal+Scaffold+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Tissue+Engineering+%26+Regenerative+Medicine+Journal%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure.</a> Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).</li>
<li>Gurjarpadhye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterization+of+bioengineered+blood+vessels+within+a+bioreactor+using+free-space+and+catheter-based+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+remodeling+and+structural+characterization+of+degradable+polymer+scaffold-based+tissue-engineered+vascular+grafts+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography.</a> Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+natural+history+of+extracellular+matrix+production+in+tissue-engineered+vascular+grafts+during+neovessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation.</a> Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=The+design+conception+and+realization+of+pulsatile+ventricular+assist+devices-from+Spiral-Vortex+pump+to+Luo-Ye+pump+&btnG=">The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Application+of+optical+coherence+tomography+in+tissue+engineered+blood+vessel+culture+based+on+Luo-Ye+pump&btnG=">Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).</li>
<li>Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+age+of+fibrotic+lesions+using+polarized+light+microscopy+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis.</a> American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).</li>
<li>Martinho, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+optical+attenuation+coefficient+and+mechanical+tension+of+irradiated+human+cartilage+measured+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography.</a> Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).</li>
<li>Poirierquinot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1.5-Tesla+magnetic+resonance+imaging+for+tissue-engineered+constructs%3A+a+noninvasive+tool+to+assess+three-dimensional+scaffold+architecture+and+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+burst+pressure%3A+initial+evaluation+of+the+natural+history+of+the+biaxial+mechanical+properties+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+the+venous+circulation+using+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).</li>
<li>Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+vessel+development+and+insight+towards+neovascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Ontworpen voor het genereren van vaartuigen met structurele en mechanische eigenschappen die lijken op die van de inheemse bloedvaten kunnen leiden tot het verkorten van de tijd voor klinisch gebruik en is het ultieme doel van vasculaire engineering. Optische beeldvormingstechnieken toestaan de visualisatie van weefsel ontworpen vasculaire specifieke onderdelen die individuele constructies in cultuur en blootstelling transplantaties aan een cultuur omgeving zonder de steriliteit7niet controleren. ...

Weefsel-engineered bloedvaten (TEBVs) is de meest veelbelovende materiaal als een ideale vasculaire graft-1. Met het oog op transplantaties te klinisch nuttig met soortgelijke structurele en functionele eigenschappen als inheemse vaartuigen, zijn meerdere technieken ontwikkeld om vasculaire functie2,3. Al tijdens de implantatie en in fase III klinische studie4zijn er gemodificeerde schepen met aanvaardbare bij tarieven, langetermijnkweek en hoge kosten blijkt ook de noodzaak van toezicht op de ontwikkeling van TEBVs. Begrip van extracellulaire matrix(ECM) groei, remodelleren en aanpassing processen in de TEBVs in de omgeving van de chemo-mechanische biomimetische bieden cruciale informatie voor de ontwikkeling van vaatweefsel engineering.
De ideale strategie om bij te houden van de ontwikkeling van kleine diameter gemodificeerde schepen5 moet op niet-destructieve, steriele, longitudinale, driedimensionale en kwantitatieve. TEBVs onder andere cultuur voorwaarden kunnen worden beoordeeld door dit imaging modaliteit, zelfs met inbegrip van wijzigingen vóór en na de vasculaire transplantatie. Strategieën voor het beschrijven van de kenmerken van levende gemodificeerde schepen nodig zijn. Optische beeldvormingstechnieken toestaan visualisatie en kwantificering van weefsel depositie en biomaterialen. Andere voordelen zijn de mogelijkheid om diep-weefsel- en label-vrije beeldbewerking met hoge resolutie6,7. Afbeelding-specifieke moleculen en minder toegankelijke optische apparatuur voor real-time bewaking is echter een aanzienlijke praktische hindernis, die de uitgebreide toepassing van niet-lineaire optische microscopie is beperkt. Optische coherentie tomografie (OCT) is een optische benadering met intravasculaire imaging modaliteit als een veel gebruikte klinische hulpmiddel bij cardiale Interventionele therapie8. In de literatuur is de methode van LGO werd gerapporteerd als een manier om te beoordelen van de wanddikte van TEBVs9,10, bevestigend beeldvormende modaliteiten voor vaatweefsel engineering onderzoek wordt gekoppeld. Overwegende dat de dynamiek van gemanipuleerde vasculaire werd groei en remodeling niet waargenomen.
In dit manuscript detailleren wij de voorbereiding van biologisch afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde TEBVs voor vier weken cultuur. Menselijke navelstreng slagaders vasculaire zachte spiercellen (HUASMCs) worden uitgebreid en in een poreuze afbreekbaar polyglycolic zuur (PGA) steigers in de bioreactor agarvoedingsbodem. Biologisch afbreekbare polymeren de rol te spelen in een tijdelijke substraat voor weefselengineering en hebben een bepaalde afbraak tarief11. Met het oog op een juiste match tussen steiger afbraak en vorming van de neo-weefsel, zijn ECM en PGA steigers cruciale factoren voor effectief vasculaire remodeling. Het systeem van de perfusie simuleert de biomechanische communicatie van inheemse vaartuigen en handhaaft een consistent vervorming onder druk stimulatie.
Het doel van het voorgestelde protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudig en niet-destructieve strategie voor TEBVs imaging en langdurige bewaking van cultuur. Dit protocol kan worden gebruikt voor visualisatie van morfologische veranderingen en diktemetingen van gemodificeerde schepen onder verschillende cultuuromstandigheden. Bovendien kunnen de analyses van de aantasting van het polymeer gebaseerde materialen in het weefsel engineering steigers worden uitgevoerd voor de identificatie. Door het combineren van methoden voor het scannen van elektronen microscopic(SEM) en gepolariseerde Microscoop gebruikt in dit protocol, correlatie en kwantificering van extracellulaire matrix distributie en aantasting van de PGA kunnen worden gemaakt, die kan vergemakkelijken beoordeling steiger afbraak gecombineerd met OCT beeldvorming.

<table><tbody><tr><td>PGA mesh</td><td>Synthecon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone tube</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>connector</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>intravascular OCT system</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td>ILUMIEN&trade; OPTIS&trade; SYSTEM</td><td></td></tr><tr><td>scanning electron microscopic</td><td>Philips</td><td>FEI Philips XL-30</td><td></td></tr><tr><td>polarized microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX51</td><td></td></tr><tr><td>sutures</td><td>Johnson &amp; Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pulsatile pump</td><td>Guangdong Cardiovascular Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightLab Imaging software</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Gemanipuleerde vaattransplantaten met structurele en mechanische eigenschappen die lijken op natuurlijke bloedvaten worden verwacht om te voldoen aan de groeiende vraag naar arteriële bypass. Karakterisering van de groeidynamiek en remodelleert proces van afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde weefsel-engineered bloedvaten (TEBVs) met Pulsatiele stimulatie is cruciaal voor vaatweefsel engineering. Optische beeldvormingstechnieken opvallen als krachtige tools voor de monitoring van de vascularisatie van gemanipuleerde weefsel inschakelen met een hoge resolutie imaging in real-time cultuur. Deze paper toont een niet-destructieve en snel real-time beeldvormings strategie voor het controleren van de groei- en verbouwing van TEBVs in langetermijnkweek met behulp van optische coherentie tomografie (OCT). Geometrische morfologie wordt geëvalueerd, met inbegrip van vasculaire remodelleert proces, wanddikte en vergelijking met de dikte van de TEBV in verschillende cultuur tijdstippen en aanwezigheid van Pulsatiele stimulatie. Ten slotte, OCT biedt praktische mogelijkheden voor het real-time opvolgen van de afbraak van het polymeer in de reconstructie weefsels onder Pulsatiele stimulatie of niet en in elk segment van schip, vergeleken met de beoordeling van het gebruik van de afbraak van de polymeer scanning electron microscopic(SEM) en gepolariseerde Microscoop.

Het driedimensionale cultuur-systeem bestaat uit een kamer van de cultuur in de bioreactor en het systeem van de perfusie met een gesloten vloeistof cyclus10,13 (Figuur 1). De OCT imaging katheter werd ingevoegd in het distale einde van de Y-junction en trok zich terug in de silicone buis voor imaging. OCT imaging werd voor het eerst gebruikt om af te bakenen de structurele karakterisatie van het biol...

Een stap voor stap protocol voor niet-destructieve en lange-termijn follow-up van het proces van vasculaire remodeling en aantasting van de steiger in real-time cultuur van biologisch afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde weefsel-engineered bloedvaten met Pulsatiele stimulatie met behulp van optische coherentie tomografie wordt hier beschreven.

Niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-Engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vasculaire weefsel-engineering veld, zoals het toezicht op de dynamiek van ingenieur vasculaire groei en remodelleren tijdens de lange termijn cultuur. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van optische coherentie tomografie, of OCT, is dat het een direct beschikbare, realtime en niet-destructieve beeldvorming strategie om de structurele kenmerken en het remodelleren proces van engineered schepen te karakteriseren. Het demonstreren van de procedure zal ook Shangmin Liu, en Wentao Ma, technici van mijn laboratorium.Om deze procedure te beginnen, fabriceren de PGA steiger zoals beschreven in het tekstprotocol Dip PGA steigers in een mol-per-liter natriumhydroxide voor een minuut, om de ruimtelijke structuur van het gaas aan te passen. Dan, weken de steigers in weefsel-cultuur-grade water drie keer gedurende twee minuten per stuk. Elke keer, voorzichtig dep droog het schavot met een tissue papier.Droog vervolgens de steigers op in een kap met een blower voor een uur. Om de bioreactor en de y-junction voor OCT imaging te monteren, eerst, weken de zelf ontwikkelde glazen cilindrische bioreactor, PGA steigers, siliconen buis, bio-compatibele buizen, connectoren, roerstaaf, en apparatuur voor montage in een 95 procent ethanol tank voor twee uur. Trek de PGA steiger door de zijarmen van de bioreactor aangesloten op de ene kant met een connector, evenals aan een andere kant met de y-junction gebruikt om de OCT geleidedraad te leveren.Monteer een andere PGA steiger in de bioreactor op dezelfde manier. Pas het polytetrafluorethyleen op de lippen van de bioreactor door het aan te spannen met 4-0 hechtingen. Zet de bioreactor weer een uur in de ethanoltank voordat je hem 's nachts droogt in een kap met de blower aan.Nu, isoleer menselijke navelslagader gladde spiercellen van menselijke navelslagaders door standaard explant technieken In de oorzaak van het opslaan van de cellen in PGA steigers, vermijd het druipen van celsuspensie op de bodem van bioreactor. Bedek ook de bioreactor met siliconenstopdeksel zo snel mogelijk na de celzitplaats om besmetting te voorkomen. Uit- en uitzetten van de cellen in gladde spiergroei medium.Zaad de menselijke navelslagader gladde spiercellen met een concentratie van 5 miljoen cellen-per-milliliter in de bovenstaande cultuur medium op de PGA steigers. Na het plaatsen van een sir bar in de bioreactor, bedek het de siliconen stop deksel dat een voedingsbuis en drie korte buizen segmenten ingevoegd voor gasuitwisseling heeft. Bevestig PTFE 0,22 micron filters op elke luchtverversingsbuis, en bevestig een heparine dop aan de voedingssonde.Pas de roerstaaf aan met een roersnelheid van 13 ronden per minuut. Monteer vervolgens de glazen bioreactor, siliconen stopklep en PGA-steiger in het kweeksysteem. Laat de cellen 45 minuten hechten door de bioreactor om de 15 minuten te leunen met een standaard naar links en naar rechts.Sluit nu de LOO-OH-YEE pomp, fosfaat-gebufferde zoutzak en driver aan op de biocompatibele buizen om het profusiesysteem te creëren. Open de driver om de buizen te vullen met PBS. Plaats de totale bioreactor in een bevochtigde couveuse met 5 procent CO2 op 37 graden Celsius.Vul de cultuurkamer met 450 milliliter van het cultuurmedium. Kweek de ingezaaide steigers onder statische cultuur voor een week, het veranderen van de cultuur medium om de drie tot vier dagen door aspirating de helft van het oude medium door de voedingsbuis en het bijvullen van de reactor met een gelijkwaardige hoeveelheid verse cultuur medium. Om het overmaaksysteem voor te bereiden op OCT-beeldvorming, pompt u vloeistoffen in de PBS-zak om ze door de biocompatibele buizen en terug naar de zak te laten circuleren.Open de kracht van de bestuurder en regel de pompinstelling met een frequentie van 60 slagen per minuut en een output systolische druk van 120 millimeter kwik. Pas de mechanische parameters aan de behoeften van de weefsel-engineering vasculaire cultuur. Klik op de run-knop om het overfusiesysteem te laten werken.Geef de fix pulsatie simulatie aan de vaten voor drie weken door iteratief onder druk van de biocompatibele buizen na een week van statische cultuur. Gebruik een lichtbron om de axiale resolutie van tien tot twintig micron en de beelddiepte van één tot twee millimeter te garanderen om de structuur van de weefsel-engineered bloedvaten, of TEVB's, te identificeren op basis van het frequentiedomein OCT intravasculair beeldvormingssysteem. Schakel de aan/uit-schakelaar in en open de beeldopnamesoftware Sluit de glasvezelkatheter aan op de aandrijfmotor en optische controller, met de katheter automatische retraitefunctie.Stel de parameters van de beeldacquisitiesnelheid in op tien frames per seconde, met een automatische pullbacksnelheid van tien millimeter per seconde. Bevestig nu de beeldkatheter aan de y-splitsing via de heparinedop met een naald van 18 meter. Plaats de katheter in de siliconenbuis en identificeer de structuurdichtheid van het PGA-gaas voordat u de PGA-steiger op de bioreactor laadt.Plaats nu de katheter kantelt over het gebied van belang. Pas het pullback-apparaat aan en controleer of de beeldkwaliteit is. Bewerf afbeeldingen op één, vier, zeven, tien, 14, 17, 21 en 28 dagen cultuur voor elke afzonderlijke TEBV.Sla deze beelden sequentieel op met een realtime observatie van de TEBV-microstructuur, inclusief oppervlaktemorfologie, interne structuur en compositie. Herhaal de meting drie keer om telkens een betrouwbare meting van de ontworpen vaten te krijgen. Leg een reeks afbeeldingen vast tijdens het testen met behulp van de software voor het vastleggen van afbeeldingen.Als u software voor beeldanalyse wilt gebruiken om de dikte van de weefselwand te meten, selecteert u eerst het beeld dat moet worden geanalyseerd. Klik vervolgens op het tracking-instrument om automatisch de binnenzijde van het weefsel-engineered bloedvat met de software te identificeren en handmatig de buitenkant te schetsen. Er verschijnt een diagram met dikte op het scherm.Herhaal de meting vijf keer om een betrouwbare meting van de constructies te krijgen. Overweeg het gebruik van twee onafhankelijke onderzoekers verplicht om de informatie te verkrijgen. Open het siliconen stopdeksel dat over de bioreactor wordt geplaatst wanneer de cultuur klaar is, en gooi het kweekmedium weg.Maak het polytetrafluorethyleen los van de lippen van de bioreactor en snijd de siliconenbuizen van de buitenzijde van het polytetrafluorethyleen met een schaar. Oogst de TEBVs uit de bioreactor en snijd ze in secties voor een scanning-elektronenmicroscopieonderzoek. Trek de ondersteunende siliconen buis, en bevestig de secties met 4 procent macht formaldehyde.Voer routinematige histologische kleuring uit met masson's trichrome en sirious rood om de morfologie van collageen en PGA te onderzoeken. Om het PGA-gehalte en collageencomponent te beoordelen, observeer je histologische monsters met sirious rode vlekken door een gepolariseerde microscoop. OCT beelden worden vergeleken met histopathologische vondsten van TEBVs na vier weken van cultuur.De OCT-afbeelding toont compacte microstructuur en specifieke componenten in vergelijking met histologische beoordeling. Het kweekmedium, de siliconen buis, de TEBV en het PGA-fragment zijn zichtbaar. Masson's trichrome kleuring toont collageenvezels verspreid in een bepaalde richting, samen met PGA resten in de media laag van de ontworpen vaten.Sirius rode vlekken onthult PGA resten en een collageen component met behulp van een gepolariseerde microscoop. Scanning-elektronenmicrografen van gemanipuleerde vaten tonen een compacte microstructuur. Ondertussen neemt deze intraluminale beeldvormingsmodaliteit niet-destructieve en eenvoudige monitoring van TEBV's over, inclusief het remodelleringsproces en visuele morfologie in situ in de langlopende cultuur.Zoals hier getoond, vindt de verbouwing eerder plaats en de morfologische veranderingen manifesteren zich duidelijker in de dynamische groep door vergelijking van DEBV dikte. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van vasculaire weefseltechniek om structuurkenmerken en het lange termijn remodelleringsproces van gemanipuleerde schepen te verkennen. Duidelijke weergave van polymere resten door gepolariseerde microscopie in combinatie met OCT-beeldvorming kan nuttig zijn voor het beoordelen van steigerdegradatie.

nondestructive-monitoring-degradable-scaffold-based-tissue-engineered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Onze groep heeft een bioreactor cultuur systeem dat bootst de fysiologische pulserende stress van het cardiovasculaire systeem te regenereren implanteerbare kleine diameter vaattransplantaten.

Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Source: Huang, Y. et. al., Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of optical coherence tomography (OCT) to monitor tumor spheroids in a multi-well plate by capturing high-resolution cross-sectional images. By analyzing light reflections from cellular structures, OCT constructs 3D models to assess morphological features like size and shape while also...

Morphological and Physiological Monitoring of Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography 

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Implantatie van autologe en allogene bottransplantaten, vormen aanvaarde benaderingen tot grote craniofaciale botverlies te behandelen. Toch is het effect van transplantaat samenstelling op de interactie tussen neovascularisatie, celdifferentiatie en botvorming is onduidelijk. We presenteren een multimodale beeldvorming protocol gericht op de angiogenese-osteogenese afhankelijkheid van het transplantaat nabijheid helderen.

Computed Tomography en optische beeldvorming van Osteogenesis-angiogenese Koppeling te beoordelen Integratie van schedelbot Autografts en Allografts

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

We beschrijven het gebruik van full-field optische coherentiemicroscopie als een methode voor een hoogwaardige beoordeling van corneadonorstroma. Dit protocol kan worden gebruikt om kenmerken te identificeren die wijzen op gezondheid of ziekte, en is gericht op het verbeteren van de screening en selectie van donorweefsels, en dus de resultaten van keratoplastiek.

Full-field optische coherentiemicroscopie voor histologie-achtige analyse van stromale kenmerken in hoornvliestransplantaten

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Microbiële biofilms vormen complexe architecturen in interfasen en ontwikkelen tot zeer Schaalafhankelijke ruimtelijke patronen. Hier introduceren we een experimenteel systeem (hard-en software) voor het automatisch verwerven van 3D optische coherentie tomografie (OCT) datasets. Deze toolset maakt de niet-invasieve en Multi-Scale karakterisatie van biofilm morfogenese in ruimte en tijd mogelijk.

Geautomatiseerde 3D optische coherentie tomografie om biofilm morfogenese te Verheldoen over grote ruimtelijke weegschalen

Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van retinale vasculatuur reactiviteit in vivo met menselijke proefpersonen met behulp van een gas ademhaling provocatie techniek om vasoactieve stimuli te leveren tijdens het verwerven van retinale beelden.

Retinale vasculaire reactiviteit zoals beoordeeld door optische coherentie tomografie Angiografie

Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

Leer niet-destructieve monitoring van vaatremodellering en scaffoldafbraak in weefsel-geïnspireerde bloedvaten met optische coherentie tomografie. Deze methode biedt realtime beeldvorming voor langetermijncultuur.

Niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-Engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie (Video) | JoVE Journal

Niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-Engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie

Meer video's verkennen